Purificazione di Hsp104, una proteina Disaggregase

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo per la purificazione del altamente attivi Hsp104, un esamerica AAA + proteine ​​da lievito, che le coppie idrolisi dell'ATP per disaggregazione delle proteine. Questo schema sfrutta un costrutto His6-tag per la purificazione di affinità E. coli Seguita da cromatografia a scambio anionico, His6-tag rimozione di proteasi TEV, e le dimensioni di esclusione cromatografia.

Abstract

Hsp104 è un esamerica AAA + ¹ da proteine ​​del lievito, che le coppie idrolisi dell'ATP alle proteine ​​disaggregazione ^2-10 (Fig. 1). Questa attività conferisce due vantaggi chiave selettiva. In primo luogo, rinaturazione di aggregati disordinati di Hsp104 consente la sopravvivenza di lievito, dopo varie sollecitazioni misfolding di proteine, tra cui shock termico ^3,5,11,12. In secondo luogo, rimodellamento di cross-beta fibrille amiloidi da Hsp104 lievito permette di sfruttare una miriade di prioni (amiloidi infettive) come un serbatoio di benefici e ereditabile variazione fenotipica ^13-22. Sorprendentemente, Hsp104 rimodella direttamente preamyloid oligomeri e fibrille amiloidi, compresi compresi quelli di proteine ​​prioniche il lievito Sup35 e Ure2 ^23-30. Questo amiloide-rimodellamento funzionalità è un aspetto specializzato di lievito Hsp104. La E. ortologo coli, ClpB, non riesce a oligomeri preamyloid rimodellare o fibrille amiloidi ^26,31,32.

Ortologhi Hsp104 si trovano in tutti i regni della vita tranne, stranamente, gli animali. Infatti, se le cellule animali possiedono un sistema enzimatico che le proteine ​​coppie disaggregazione di rinaturazione (piuttosto che degrado) rimane sconosciuto ^33-35. Così, noi e altri hanno proposto che Hsp104 potrebbe essere sviluppato come agente terapeutico per varie malattie neurodegenerative legate alla misfolding di proteine ​​specifiche in oligomeri preamyloid tossici e fibrille amiloidi ^{4,7,23,36-38.} Non ci sono trattamenti che riguardano direttamente la specie aggregate associati a queste malattie. Eppure, Hsp104 dissolve oligomeri tossici e fibrille amiloidi composto da alfa-sinucleina, che sono collegati con la malattia di Parkinson ²³ così come le forme di PrP amiloide ^39. Importante, Hsp104 riduce l'aggregazione delle proteine ​​e migliora neurodegenerazione in modelli di roditori della malattia di Parkinson ²³ e la malattia di Huntington ^38. Idealmente, per ottimizzare la terapia e minimizzare gli effetti collaterali, Hsp104 sarebbe progettato e potenziato per rimodellare selettivamente aggregati specifici centrale per la patologia in questione ^4,7. Tuttavia, la limitata comprensione strutturale e meccanicistica di come Hsp104 disaggrega ad un repertorio eterogeneo di strutture aggregate e proteine ​​non correlate frustra questi tentativi ^30,40-42.

Per comprendere la struttura e il meccanismo di Hsp104, è essenziale per lo studio della proteina pura e ricostituire la sua attività disaggregase con componenti minimi. Hsp104 è una proteina 102kDa con un pI di ~ 5.3, che hexamerizes in presenza di ADP e ATP, oppure a concentrazioni di proteine ​​in assenza di ^43-46 nucleotidi. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la purificazione di molto attiva, stabile Hsp104 da E. coli. L'utilizzo di E. coli permette semplificata produzione su larga scala e il nostro metodo può essere eseguita in modo rapido e affidabile per Hsp104 numerose varianti. Il nostro protocollo aumenta Hsp104 purezza e semplifica la sua ₆ tag rimozione rispetto ad un metodo di purificazione precedente da E. coli ^47. Inoltre, il nostro protocollo è più facile e conveniente di due protocolli più recenti ^26,48.

Protocollo

1. Espressione di Hsp104

1. Il plasmide utilizzato per la purificazione in E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104, contiene la Hsp104 open-lettura telaio sotto il controllo del promotore inducibile trc ^26. Il plasmide produce Hsp104 con un N-terminale suoi _6-tag che possono essere rimossi per scissione della proteasi TEV. Trasforma pPROEX-HTB-Hsp104 in codone ottimizzato E. coli BL21-CodonPlus RIL-cellule (Stratagene, Agilent Technologies) utilizzando una procedura tipica trasformazione batterica (per esempio in base alle istruzioni del produttore). E 'importante utilizzare un codone ottimizzato E. coli ceppo Hsp104 perché ha un pregiudizio insolito codone.
2. Inoculare una cultura 2XYT 100 ml (Ricetta USB.: 16g / l di peptone di caseina, 10 g / l estratto di lievito, 5 g / L di NaCl, pH 7,0) integrato con 100μg/mL ampicillina e cloramfenicolo 34μg/mL con trasformanti fresca e crescere overnight a 37 ° C con agitazione a 200gpm.
3. Inoculare 10 mL della cultura durante la notte in 6 X 1L 2XYT con 100μg/mL 34μg/mL ampicillina e cloramfenicolo in fiaschi 2L. Agitare a 250rpm a 37 ° C fino OD ₆₀₀ = ,4-0,6. A smettere di tremare e ridurre la temperatura a 15 ° C. Consentono alle cellule di equilibrare unagitated per 30min nell'incubatrice fino a raggiungere 15 ° C. Una volta a 15 ° C viene raggiunta indurre l'espressione delle proteine ​​con l'aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 1 mm. Riprendi agitazione a 250rpm notte (12-16 ore).

2. Raccolta e lisi delle cellule

1. Harvest cellule mediante centrifugazione (in un rotore preraffreddato) a 4.000 rpm per 20min a 4 ° C (usiamo un Sorvall RC 3BP centrifuga +). I passi successivi devono essere eseguiti immediatamente, perché Hsp104 attività è diminuito quando E. coli sono congelati. Inoltre, tutti i passi successivi devono essere eseguiti su ghiaccio o a 4 ° C.
2. Pellet cellulari risospendere in prechilled (su ghiaccio) 10 ml tampone di lisi (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 500mm KCl, 20 mM MgCl _2, 2.5% (w / v) glicerolo, 20 mM imidazolo, 5 micron pepstatina A, completo cocktail inibitore della proteasi (1 EDTA senza tablet/50mL), e 2mM β-mercaptoetanolo).
3. Lisare le cellule con una stampa francese (Emulsiflex) omogeneizzatore che utilizza uno scambiatore di calore immerso in acqua ghiacciata. Prima dell'uso, assicurarsi che tutti i grumi di cellule sono state solubilizzate. Dopo equilibrante omogeneizzatore con tampone di lisi, due passa attraverso il cilindro con una pressione di 15.000-18.000 psi è sufficiente per lisi completa. Se una stampa francese non è disponibile, l'incubazione con lisozima seguita da sonicazione può essere utilizzato (vedi discussione). Salva un piccolo campione di cellule lisate per l'analisi SDS-PAGE (1ml) (lisato in fig. 2).
4. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 16.000 rpm per 20min a 4 ° C (usiamo un RC5C Sorvall centifuge +). Conservare il supernatante per la fase successiva e salvare un piccolo campione (1ml) di supernatante per SDS-PAGE analisi (Load Ni in fig. 2).

3. Hsp104 Purificazione

1. Mix surnatante dal punto 2.4 con 12mL (2 ml Ni-Sepharose perle per 1L di cellule) del 50% impasto di buffer di lisi equilibrata Ni-Sepharose perline (GE).
2. Ruotare il campione lentamente per 3 ore a 4 ° C in modo tale che Ni-Sepharose rimane fluttuante e schiumare è ridotto al minimo. Tempi di incubazione più brevi sono possibili, ma diminuisce la resa. A 4 ° C in presenza di inibitori della proteasi, il degrado si verifica poco, e un 3 ore al Ni-Sepharose tempo di incubazione non diminuisce l'attività del prodotto finale. Raccogliere Ni-Sepharose tramite centrifugazione per 2 minuti a 4 ° C a 2.000 rpm (centrifuga Eppendorf 5810R). Salva un piccolo campione di surnatante per SDS-PAGE analisi (1ml) e scartare il resto (flusso Ni Thru (FT) in fig. 2).
3. Lavare i recuperate Ni-Sepharose con 25 volumi di colonna di tampone di lavaggio (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 150mm KCl, 20 mM MgCl _2, 2.5% (w / v) glicerolo, 20 mM imidazolo, 2mM β-mercaptoetanolo), 5 volumi di colonna tampone di lavaggio con KCl 1M per rimuovere i contaminanti legato elettrostaticamente a Hsp104, e 25 volumi di colonna di tampone di lavaggio. Raccogliere Ni-Sepharose dopo ogni lavaggio mediante centrifugazione per 2 minuti a 4 ° C a 2.000 rpm (centrifuga Eppendorf 5810R). Dopo ogni ciclo di lavaggio e centrifugazione, rimuovere tampone per aspirazione.
4. Per eluire Hsp104, mescolare Ni-Sepharose con 1 ml di tampone di eluizione (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 150mm KCl, 20 mM MgCl _2, 2.5% (w / v) glicerolo, 350mm imidazolo, 2mM β-mercaptoetanolo) per 1 ml e Ni-Sepharose rotazione a 4 ° C per 20 minuti. L'alta concentrazione imidazolo interrompe il suo tallone-Ni ₆ interazione. Rimuovere Ni-Sepharose con colonne vuote 1,2 ml di spin (Bio-Rad) tramite centrifugazione per 2 minuti a 4 ° C a 2.000 rpm (centrifuga Eppendorf 5810R). Salva 1ml di eluato per SDS-PAGE analisi (eluato Ni in fig. 2). Per ogni litro di cellule, ~ 15 mg di Hsp104 si ottiene in questa fase.
5. Buffer eluato scambio in Buffer Q (20 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 0,5 mm, 5mm MgCl _2, 50 mM NaCl) usando MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore) 15 ml di unità concentratore centrifugo. In primo luogo, concentrato di proteine ​​di ~ 1,5 ml quindi aggiungere 14.5mL di tampone di Q per diluire proteina di 10 volte. Ripetere 3 volte per lo scambio di buffer. L'aumento del pH e sale a bassa assicura che Hsp104 ha una carica negativa alto.
6. Purificare Hsp104 tramite cromatografia a scambio anionico utilizzando un buffer equilibrato Q colonna Risorsa Q 6 ml (GE). Prima dell'iniezione, la proteina viene filtrata attraverso un basso legame proteico Millex GP PES membrana 0.22μM siringa filtro (Millipore). Ci avvaliamo di una portata di 1mL/min. Lavare via debolmente proteine ​​di legame con 1 volume colonna del 20% Buffer Q + (20 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 0,5 mm, 5mm MgCl _2, 1M NaCl). Eluire Hsp104 con sfumatura lineare (20% -50% Buffer Q +) più di 5 volumi di colonna (Fig. 3). Raccogliere frazioni da 1 ml. Hsp104 e la maggior parte delle varianti tipicamente eluire a ~ 400mm NaCl (31mS/cm). Salva campioni delle frazioni di picco (1ml) per SDS-PAGE analisi (Fig. 3, nel riquadro).
7. Per rimuovere la sua _6-tag, proteine ​​di scambio con il concentratore centrifugo Amicon come descritto sopra (vedi punto 3.5) nel buffer della scissione (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, KCl 140mm, e 10mM MgCl _2). Usa proTEV proteasi (Promega) o AcTEV proteasi (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Per Hsp104, abbiamo trovato che il più alto rapporto di proteasi TEV: Hsp104 sono necessari per la scissione totale. Usiamo un rapporto di 1 unità di proteasi per 12μg Hsp104. Scissione deve essere eseguita a 30 ° C per 2-4 ore, seguita da una incubazione 16 ore a 4 ° C. Concentrazione finale Hsp104 dovrebbe essere tra 20-75μM monomero. Riducono le rimanenti Hsp104 His6 marcatura ed proteasi TEV con Ni-Sepharose (GE) con l'aggiunta di Ni-Sepharose in eccesso alla quantità di Hsp104 nella reazione della scissione (assumere perle può legare 15 mg di proteina per ml di resina imballato). Rimuovere perline con colonne di rotazione vuoto (Bio-Rad) per centrifugazione per 2 minuti a 2.000 rpm a 4 ° C. Raccogliere i campioni prima e dopo la scissione (1ml) per SDS-PAGE analisi per garantire la scissione, e la rimozione delle proteine ​​uncleaved (Fig. 4).
8. Scambio in dimensione del buffer di esclusione (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, 10mM MgCl _2, 0.1mm EDTA, 1 mM DTT) utilizzando MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore), come descritto al punto 3.5.
9. Ulteriori purificare Hsp104 via dimensione-cromatografia di esclusione. Usa esclusione Superose dimensione del buffer equilibrata 6 o 200 Superdex colonna (sia da GE) (Fig. 5). Prima dell'iniezione, la proteina viene filtrata attraverso un basso legame proteico Millex GP PES membrana 0.22μM siringa filtro (Millipore). Per meno di 10 mg di proteine, le colonne di dimensioni 10/300 (24ml) può essere utilizzato e le frazioni di 0,5 ml sono stati raccolti. Per i campioni maggiori di 10 mg, la colonna dimensione 12/60 (120ml) dovrebbe essere usato e 1 ml frazioni vengono raccolte. Fare riferimento alle istruzioni del produttore per flussi e volumi di campione da caricare. Dopo la purificazione, frazioni Hsp104 sono riuniti come mostrato in fig. 5 e concentrata in Unità Concentratore Amicon centrifuga (Millipore). Hsp104 viene memorizzato come descritto di seguito. A causa della perdita di materiale a separare Hsp104 prodotti di degradazione e contaminanti la resa finale del purificata full-length Hsp104 è ~ 1-3mg per litro di partenza cultura.

4. Hsp104 Disaggregase attività

1. Dopo la purificazione, è buona per valutare Hsp104 attività in un test di disgregazione. Tipicamente, ci avvaliamo di un saggio di luciferasi riattivazione ² (Fig. 6). In questo saggio, Hsp104 in collaborazione con il sistema di chaperone Hsp70 (Hsp70 e Hsp40) disaggrega urea-denaturato aggregati luciferasi lucciola ^2. Solubile luciferasi catalizza l'ossidazione della luciferina ad oxyluciferin, una reazione che libera la luce. Dalla luminescenza monitoraggio, la riattivazione relativa, e quindi disaggregazione, di luciferasi può essere determinato. Hsp104 deve essere in grado di collaborare in sinergia con il co-chaperone Hsp70 sistema. La quantità di luminescenza recuperato dipende dalla Hsp70 esatta: coppia Hsp40 utilizzati. Noi abitualmente utilizzano Hsp72 e Hsp40 (disegni Assay). Come minimo, attivo Hsp104 dovrebbe produrre un aumento di 5 volte nella riattivazione della luciferasi rispetto alla riattivazione di Hsp72: Hsp40 solo (Fig. 6). Hsp104 preparati che non riescono a raggiungere questo livello di attività vengono scartati.

5. Hsp104 archiviazione

1. Per la conservazione a breve termine, Hsp104 può essere conservato a 4 ° C in formato esclusione buffer. Tuttavia, l'attività si ridurrà dopo 2-3 giorni a 4 ° C e bruscamente dopo 1 settimana a 4 ° C. Per i saggi di disaggregazione si consiglia di Hsp104 deve essere utilizzato il più presto possibile dopo la purificazione. Idealmente, Hsp104 deve essere utilizzato immediatamente per le analisi disaggregazione amiloide.
2. Se le proteine ​​devono essere conservati a lungo termine, Hsp104 viene scambiato nella soluzione per la conservazione (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, 10mM MgCl _2, 0.1mm EDTA, 1mM DTT, 10% glicerolo (w / v)). Aliquote 100μl sono a scatto congelato in azoto liquido e conservati a -80 ° C. Cicli di gelo-disgelo ridurre drasticamente Hsp104 attivitàe deve essere evitato. Si consiglia di scongelare lentamente Hsp104 sul ghiaccio. -Amiloide disaggregase attività si ridurrà drasticamente dopo 1 mese a -80 ° C.

6. Risultati Rappresentante e figure:

Figura 1. Hsp104 è un disaggregase bifunzionali. Disaggregazione degli aggregati disordinati (mostrato a sinistra) richiede la cooperazione del sistema chaperone Hsp70 (Hsp70 e Hsp40) ^2. Rimodella Hsp104 ordinato aggregati amiloidi (illustrato a destra) senza l'ausilio di Hsp70 e Hsp40 in vitro, ma Hsp70 e Hsp40 può migliorare Hsp104 attività contro amiloide ^26,28. Per entrambe le tipologie di strutture aggregate, Hsp104 coppie idrolisi dell'ATP per traslocazione del substrato attraverso il suo canale centrale per promuovere disaggregazione. Tirosina-cuscinetto loop pori coinvolgere e substrato navetta attraverso il canale centrale ^49-52.

Figura 2. SDS-PAGE analisi di Ni-sefarosio passo affinità purificazione. Lisato, carico Ni, Ni FT e campioni di eluato Ni sono stati frazionati mediante SDS-PAGE utilizzando un 4-20% Tris-HCl 1,0 millimetri Criterion gel (Bio-Rad) e colorate Coomassie . Si noti che non tutti i Hsp104 è in grado di legarsi al Ni-sefarosio. Ampia Gamma di marcatori di peso molecolare (Bio-Rad) sono mostrati (corsia sinistra).

Figura 3. Risorsa purificazione Q di Ni-sefarosio eluato. Traccia blu rappresenta l'assorbanza a 280 nm e traccia verde rappresenta% Buffer Q + (massimo al 50%). Il primo picco, che eluisce al 20% + Q contiene impurità, prodotti di degradazione e piegato impropriamente Hsp104. Il secondo picco e le principali contiene accuratamente piegati e attiva Hsp104. Portata era 1ml/min. Gradiente che va dal 20-50% Q + è di 30 minuti o 5 volumi di colonna. Riquadro: frazioni di picco vengono risolte mediante SDS-PAGE analisi utilizzando un 4-20% Tris-HCl 1,0 millimetri Criterion gel (Bio-Rad) e colorate Coomassie. Ampia Gamma di marcatori di peso molecolare (Bio-Rad) sono indicati (a sinistra).

Figura 4. SDS-PAGE analisi del passo clivaggio della proteasi proTEV. Suoi _6-Hsp104 dalla purificazione delle risorse Q è stato trattato con proteasi proTEV per 4 ore a 30 ° C e poi 16 ore a 4 ° C. I campioni sono stati frazionati mediante la SDS-PAGE utilizzando un 4-20% Tris-HCl 1,0 millimetri Criterion gel (Bio-Rad) e colorate Coomassie. Si noti che proTEV spaccati Hsp104 migra più rapidamente. TEV proteasi e uncleaved Hsp104 sono state esaurite con batterie Ni-Sepharose come descritto al punto 3.7. Ampia Gamma di marcatori di peso molecolare (Bio-Rad) sono indicati (a sinistra).

Figura 5. Taglia-esclusione di purificazione Hsp104. Spaccati Hsp104 è stato ulteriormente purificato attraverso una colonna 6 gel filtrazione Superose (10/300, GE). = Portata 0.4ml/min. Il picco tra le linee tratteggiate rappresentano frazioni pool. Riquadro: frazioni di picco vengono risolte mediante SDS-PAGE analisi utilizzando un 4-20% Tris-HCl 1,0 millimetri Criterion gel (Bio-Rad) e colorate Coomassie. Ampia Gamma di marcatori di peso molecolare (Bio-Rad) sono indicati (a sinistra).

Figura 6. Saggio riattivazione luciferasi. Denaturato aggregati lucciola luciferasi (50nm) sono state incubate sia con Hsp72 e Hsp40 (1μM) (entrambi dal design Assay), Hsp104 (6μM monomero) o Hsp104, Hsp72 e Hsp40 per 90min a 25 ° C. Luciferasi denaturato è solo completamente riattivato in presenza di entrambi i Hsp104 e Hsp40/Hsp72. Luminescenza recuperato viene misurato su una piastra lettore Infinite M1000 (Tecan). Valori rappresentano le medie ± SEM (n = 3).

Discussione

Timeline: per la massima attività Hsp104 raccomandiamo che il sistema di purificazione intero essere completato il più rapidamente possibile. Tuttavia, il numero di passaggi di purificazione rende un programma impegnativo che non può sempre essere pratico. Se le fasi di purificazione vengono eseguite più rapidamente possibile, il tempo a partire dalla fine di espressione durante la notte fino alle 2-4 ore di incubazione a 30 ° C con proteasi TEV è di circa 9-11 ore. Un posto potenziale per mettere in pausa ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
BL21-CodonPlus-RIL cellule competenti	Stratagene, Agilent Technologies	230255
2XYT brodo	USB	75864
Completi, mini, EDTA senza inibitori della proteasi compresse	Roche	1836170
Un pepstatina	Sigma	P4265
Ni-Sepharose 6 flusso veloce	GE Healthcare	17-5318-02
Amicon Ultra-15 unità centrifughe filtro (MWCO 30.000)	Millipore	UFC903008
Risorsa Q - colonna 6ml	GE Healthcare	17-1179-01
proTEV proteasi	Promega	V6052
AcTEV proteasi	Invitrogen	12575015
Superose sei 10/300 GL	GE Healthcare	17-5172-01
Hsp40	Assay Designs	SPP-400
Hsp72	Assay Designs	ADI-NSP-555