Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Özet

Burada, son derece aktif Hsp104 hexameric AAA + protein mayası, protein ayrıştırılmasıyla çiftler ATP hidrolizi arıtma için bir protokol açıklar. Bu düzeni yakınlık arıtma için His6 etiketli inşa patlatır E. coli Anyon-değiştirici kromatografi, TEV proteaz His6-tag kaldırılması, ve boyut dışlama kromatografisi izledi.

Özet

Hsp104 maya hexameric bir AAA + protein ^{1, 2-10} protein ayrıştırılmasıyla çiftler ATP hidrolizi (Şekil 1). Bu etkinlik iki anahtar seçici avantaj kazandırır. Birincisi, Hsp104 tarafından düzensiz agrega Yeniden doğallaştırmanın ısı şok ^3,5,11,12 dahil olmak üzere, çeşitli protein misfolding gerilmeler sonra maya hayatta kalma güçlendirir. İkincisi, Hsp104 çapraz beta amiloid fibriller itilme, sayısız yarar sağlayan bir rezervuar olarak prion (enfeksiyöz amiloidleri) yararlanmak ^ve 13-22 fenotipik varyasyon kalıtsal maya sağlar . Enteresandır ki, Hsp104 doğrudan maya prion proteinlerin Sup35 ve Ure2 ^23-30 oluşan olanlar da dahil olmak üzere preamyloid oligomerler ve amiloid fibriller remodels. Bu amiloid remodeling işlevselliği maya Hsp104 özel bir yönüdür. E. coli orthologue, ClpB, yeni model preamyloid oligomerler veya amiloid fibriller ^26,31,32 başarısız olur.

Hsp104 orthologues hayvanlar, perplexingly dışında yaşamın tüm krallıkları bulundu. Gerçekten de, hayvan hücrelerinde herhangi bir enzim sistemine sahip olmadığını Yeniden doğallaştırmanın (yerine bozulması daha) çiftler protein ayrıştırılmasıyla ^bilinmeyen 33-35 kalır . Bu nedenle, biz ve diğerleri Hsp104 toksik preamyloid oligomerler ve amiloid fibriller ^4,7,23,36-38 spesifik proteinlerin misfolding bağlı çeşitli nörodejeneratif hastalıklar için tedavi edici bir ajan olarak gelişmiş olabilir önerdi. Bu hastalıklar ile ilişkili toplanan türlerin doğrudan hedef tedaviler vardır. Ancak, Hsp104, Parkinson ^Hastalığı 23 gibi ^PrP 39 amiloid formları ile bağlı alfa-sinüklein oluşan toksik oligomerler ve amiloid fibriller çözünür . Daha da önemlisi, Hsp104 protein agregasyonunu azaltır ve Parkinson Hastalığı ²³ ve Huntington hastalığı ³⁸ kemirgen modellerinde nörodejenerasyon düzelir. İdeal olarak, tedavi optimize etmek ve yan etkileri en aza indirmek için, Hsp104 mühendislik ve seçici ^soru 4,7 hastalığın merkezi özel agrega bozulmasina potansiyelize olacaktır . Ancak, nasıl Hsp104 disaggregates sınırlı yapısal ve mekanik bir anlayış toplanan yapıları ve ilgisiz proteinler gibi farklı bir repertuar bu ^{çalışmaların} 30,40-42 köstekliyor .

Hsp104 yapısı ve mekanizması anlamak için, saf protein ve sulandırmak, disaggregase aktivite minimal bileşenleri ile çalışmak için gerekli. Hsp104 ~ 5.3, ADP ve ATP varlığında veya yokluğunda ^43-46 nükleotid yüksek protein konsantrasyonları hexamerizes pI 102kDa proteindir. Burada, son derece aktif, istikrarlı Hsp104 E. temizleme için optimize edilmiş bir protokol tarif coli. E. coli basitleştirilmiş büyük ölçekli üretim sağlar ve yöntemi çok sayıda Hsp104 varyantları için hızlı ve güvenilir bir şekilde yapılabilir. Bizim protokol Hsp104 saflığı artar ve E. önceki bir arıtma yöntemi ile karşılaştırıldığında, _O'nun 6-tag çıkarma işlemlerini basitleştiriyor coli, ^47. Ayrıca, bizim protokol iki daha yeni protokoller ^26,48 daha bayağı ve rahat.

Protokol

1. Hsp104, Açıklanması

1. Plazmid E. arıtma için istihdam coli, pPROEX-HTB-Hsp104, trc organizatörü ²⁶ indüklenebilir kontrol altında Hsp104 açık okuma çerçevesi içerir. Plazmid TEV proteaz bölünme tarafından kaldırılabilir bir N-terminal Onun _6-etiket Hsp104 üretir. Kodon optimize edilmiş E. içine pPROEX-HTB-Hsp104 Dönüşümü tipik bir bakteriyel dönüşüm prosedürü kullanarak coli BL21-CodonPlus RIL hücreleri (Stratagene, Agilent Technologies) (örneğin, üreticinin talimatlarına göre). Kodon optimize edilmiş E. kullanmak önemlidir. Hsp104 alışılmadık bir kodon önyargı çünkü coli süzün.
2. 100 mL 2XYT kültür (USB. Tarif: 16g / L kazein pepton, 10 g / L maya özü, 5 g / L NaCl, pH 7.0) İnokülasyon 100μg/mL ampisilin ve taze transformants 34μg/mL kloramfenikol ile desteklenmiş ve 37 o gecede büyümek ° 200rpm az sallayarak C.
3. 6 X 2L şişeler 100μg/mL ampisilin ve 34μg/mL kloramfenikol 1L 2XYT içine 10 ml gecelik kültür İnokülasyon. 37 ° C kadar OD ₆₀₀ = 0.4-0.6 250rpm az çalkalayınız. Sallayarak durdurun ve 15 sıcaklığını düşürmek ° C 15 ° C'ye ulaşıncaya kadar hücrelerin inkübatör 30dk için unagitated denge sağlaması için izin verin Bir kez 15 ° C 1mm bir final konsantrasyon IPTG ekleyerek protein ekspresyonu neden ulaşılır. (12-16 saat) bir gecede 250rpm sallayarak sürdürün.

2. Hücre Hasat ve Lizis

1. 4 20dk için 4.000 rpm santrifüj Hasat hücreleri (bir precooled rotor) ° C (Sorvall RC 3BP + santrifüj kullanın). Hsp104 aktivitesi azaldı çünkü sonraki adımları derhal yapılmalıdır E. coli hücrelerinde dondurulur. Ayrıca, sonraki tüm adımlar buz veya 4 ° C'de yapılmalıdır
2. Prechilled yeniden süspanse hücre pelletleri (buz) 10ml lizis tamponu (40mm Hepes-KOH pH 7.4, 500mm KCl, 20mm MgCl _2,% 2,5 (w / v) gliserol, 20mm imidazol, 5μM pepstatin, tam proteaz inhibitörü kokteyl (1 EDTA tablet/50mL-ücretsiz), 2mm β-mercaptoethanol).
3. Buzlu suya dalmış bir ısı değiştirici kullanan bir Fransız basını (Emulsiflex) Homojenizatör hücreleri Lyse. Kullanmadan önce, tüm hücre kümeleri çözündüğünü sahip olduğunuzdan emin olun. Lizis tamponu ile homojenizatör değişikti sonra, iki geçiş 15,000-18,000 psi basıncı ile silindir üzerinden tam lizis için yeterli. Fransız basını, mevcut değilse, sonication takip lizozim ile inkübasyon (tartışma) kullanılabilir. SDS-PAGE analizi (1μL) (Şekil Lizat 2) parçalanmış hücreleri küçük bir örnek.
4. 4 20dk 16.000 rpm'de santrifüj hücre enkaz kaldırma ° C (+ centifuge bir Sorvall RC5C kullanın). Bir sonraki adım için supernatant saklayın ve SDS-PAGE analizi için süpernatant küçük bir örneği (1μL) tasarruf (Ni Yük Şekil 2).

3. Hsp104 Arıtma

1. Lizis tamponu dengelenmiş Ni-sepharose boncuk (GE)% 50 bulamaç 12ml (1L hücre başına 2mL Ni-sepharose boncuk) ile 2,4 adım supernatant karıştırın.
2. 4 az 3 saat yavaş örnek Döndür ° C Ni-sepharose eşit kapanmıştır ve Köpüklenmemesine minimize kaldığı gibi. Kısa kuluçka süreleri mümkündür, ancak verim düşecektir. 4 ° C proteaz inhibitörlerinin varlığında, küçük bir bozulma meydana gelir ve Ni-sepharose 3 saatlik bir inkübasyon süresi, nihai ürünün etkinliği düşmediğinden. 2 dakika süreyle santrifüj Ni-sepharose toplayın, 4 ° C 'de 2.000 tane rpm (Eppendorf santrifüj 5810R). SDS-PAGE analizi (1μL) kaydedin ve süpernatant bir küçük örnek (Şekil sayesinde Ni Akış (FT) 2) geri kalanını atın.
3. Yıkama tamponu (40mm Hepes-KOH pH 7.4, 150mm KCl, 20mm MgCl _2,% 2.5 (w / v) gliserol, 20mm imidazol, 2mm β-mercaptoethanol), 5 sütun hacimleri 25 sütun hacimleri ile alınan Ni-sepharose yıkayın Hsp104 elektrostatik bağlı kirleticiler ve yıkama tamponu 25 sütun hacimleri kaldırmak için 1M KCl ile tampon yıkayın. 2 dakika süreyle santrifüj her yıkamadan sonra Ni-sepharose toplayın, 4 ° C 'de 2.000 tane rpm (Eppendorf santrifüj 5810R). Her yıkama ve santrifüj çevriminden sonra, aspirasyon tampon kaldırmak.
4. Hsp104, mix Ni-sepharose 1mL elüsyon 1mL Ni-sepharose başına tamponu (40mm Hepes-KOH pH 7.4, 150mm KCl, 20mm MgCl _2,% 2.5 (w / v) gliserol, 350mm imidazol, 2mm β-mercaptoethanol) ve Zehir 4 ° C'de 20 dakika çevirin. Yüksek imidazol konsantrasyon Ni boncuk ₆ etkileşimi bozar. 4 az 2 dakika süreyle santrifüj boş 1.2 mL dönüş sütun (Bio-Rad) ° C 2.000 rpm (Eppendorf 5810R santrifüj) Ni-sepharose çıkarın. (Şekil Ni eluat 2) SDS-PAGE analizi için eluat, 1μL kaydedin. ~ 15mg, Hsp104 hücrelerin her litre için, bu aşamada elde edilir.
5. MWCO 30.000 Amicon Ultra (Mil kullanarak içine Tampon Tampon Q (20mm Tris-HCl, pH 8, 0.5mm EDTA, 5mM MgCl _2, 50mm NaCl) döviz eluatlipore), 15 mL santrifüj konsantratör birimleri. Birincisi, daha sonra 10 kat protein sulandırmak için Tampon Q 14.5mL eklemek ~ 1.5mL protein konsantresi. Tampon değişimi için 3 kez tekrarlayın. Artan pH ve düşük tuz Hsp104 yüksek bir negatif yük sahip olmasını sağlar.
6. Buffer S dengelenmiş Kaynak S 6mL sütun (GE) ile anyon değişim kromatografisi yoluyla Hsp104 arındırın. Enjeksiyondan önce, protein, düşük protein bağlayıcı Millex GP PES Membran 0.22μM şırınga filtresi (Millipore) süzülür. Biz 1mL/min bir akış oranı istihdam etmektedir. 1 sütun hacmi ile% 20 Buffer zayıf bağlayıcı proteinlerin uzaklıkta yıkayın S + (20mm Tris-HCl, pH 8, 0.5mm EDTA, 5mM MgCl _2, 1M NaCl). 5 sütun hacimleri üzerinden doğrusal bir degrade Zehir Hsp104 (20% -50% Tampon S +) (Şekil 3). 1ml kesirler toplayın. Hsp104 ve türevlerini en tipik ~ 400mm NaCl (31mS/cm) Zehir. SDS-PAGE analizi (Şekil 3, içerlek) pik fraksiyonları (1μL) örnekleri kaydedin.
7. Amicon santrifüj konsantratör kullanarak, _O'nun 6-tag kaldırmak için, döviz protein olarak bölünme tampon (20mm Hepes-KOH pH 7.4, 140 KCl ve 10mM _MgCl 2) (bkz: adım 3.5) yukarıda tarif. Üreticinin talimatlarına göre proTEV proteaz (Promega) veya AcTEV proteaz (Invitrogen) kullanın. Hsp104 için, biz Hsp104 tam bölünme için gerekli olan: TEV proteaz yüksek oranları bu bulduk. Biz 12μg Hsp104 başına 1 proteaz biriminin bir oran kullanın. Dilinim 2-4 saat süreyle, 16 saat inkübasyon 4 ° C 30 ° C'de olmalıdır Final Hsp104 konsantrasyonu 20-75μM monomer arasında olmalıdır. Ni-sepharose (GE) ile kalan His6 etiketli Hsp104 ve TEV proteaz fazla bölünme tepki Hsp104 miktarı (boncuklar paketlenmiş reçine ml başına protein 15mg bağlayabilirsiniz varsayalım) Ni-sepharose ekleyerek tüketir. 4 2min için 2,000 rpm'de santrifüj boş dönmeye sütun (Bio-Rad) ile boncuk kaldırın ° C Bölünme ve uncleaved protein (Şekil 4) kaldırılmasını sağlamak için SDS-PAGE analizi için bölünme (1μL) öncesi ve sonrası numunelerini.
8. MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore) kullanarak adım 3.5 'te açıklandığı gibi boyut dışlama tampon (20mm Hepes-KOH pH 7.4, 140 KCl, 10mM MgCl _2, 0.1mm EDTA, 1mm DTT) içine Alım Satım.
9. Ayrıca boyut dışlama kromatografisi ile Hsp104 arındırmak. Boyut dışlama tampon dengelenmiş Superose 6 veya Superdex 200 sütun (GE) (Şekil 5) kullanın. Enjeksiyondan önce, protein, düşük protein bağlayıcı Millex GP PES Membran 0.22μM şırınga filtresi (Millipore) süzülür. Daha az protein 10mg, 10/300 boyutu sütun (24mL) ve 0.5 ml kesirler toplanır. 10mg daha büyük numuneler için, 12/60 boyutu kolon (120ml) ve 1 ml kesirler toplanan. Akış oranları ve yüklenecek örnek hacmi için üreticinin talimatlarına bakın. Saflaştırma sonrasında, Hsp104 kesirler Şekil toplanmış. 5 ve Amicon Santrifüj Konsantratörü Birimleri (Millipore) yoğunlaşmıştır. Aşağıda açıklandığı gibi Hsp104 saklanır. Tam uzunlukta Hsp104 saflaştırılmış nihai verim kültürünün başlangıç ​​~ 1-3mg litre Hsp104 bozunma ürünleri ve kirleticiler ayıran malzeme kaybı nedeniyle.

4. Hsp104 Disaggregase aktivitesi

1. Arıtma sonra, bir ayrıştırılmasıyla tayininde Hsp104 etkinliğini değerlendirmek için iyi bir uygulamadır. Genellikle, bir lusiferaz reaktivasyonu tahlil ² (Şekil 6) kullanırlar. Bu testte, HSP70 şaperon sistemi (HSP70 ve Hsp40) disaggregates üre-denatüre ateşböceği lusiferaz agrega ² ile birlikte Hsp104. Çözünür lusiferaz oxyluciferin, ışık bültenleri bir tepki luciferase oksidasyonunu katalizler. Izleme lüminesans, göreceli reaktivasyonu, ve bu nedenle ayrıştırılmasıyla, lusiferaz tespit edilebilir. Hsp104 HSP70 co-şaperon sistemi ile sinerjik işbirliği mümkün olmalıdır. Kurtarıldı lüminesans miktarı tam HSP70 bağlıdır: Hsp40 çifti kullanılmaktadır. Biz rutin Hsp72 ve Hsp40 (Tahlil Tasarımlar) kullanırlar. Yalnız Hsp40 (Şekil 6): En azından, aktif Hsp104 lusiferaz reaktivasyonu bir Hsp72 ile reaktivasyonuna karşılaştırıldığında 5 kat artış üretmek gerekir. Faaliyet bu seviyeye ulaşmak için başarısız Hsp104 hazırlıkları atılır.

5. Hsp104 Depolama

1. Kısa süreli depolama için, Hsp104 4 ° C boyut-dışlanma tampon tutulabilir. Ancak, aktivite, 4 4 ° C ve keskin 1 hafta sonra 2-3 gün sonra azalacak ° C Ayrıştırılmasıyla testlerde Hsp104 arıtma sonra en kısa sürede kullanılması gerektiğini öneriyoruz. İdeal olarak, Hsp104 amiloid ayrıştırılmasıyla deneyleri için hemen kullanılabilir olmalıdır.
2. Protein uzun vadeli depolanması gerekiyorsa Hsp104 depolama tampon (20mm Hepes-KOH pH 7.4, 140 KCl, 10mM MgCl _2, 0.1mm EDTA, 1mm DTT,% 10 gliserol (w / v)) değiştirilir. 100μl alikotları sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C'de saklanan ek bileşenini Donma-çözülme çevrimleri Hsp104 aktivite önemli ölçüde azaltmakve bundan kaçınılmalıdır. Biz yavaş yavaş buz üzerinde Hsp104 çözülme tavsiye ederiz. Amiloid-disaggregase faaliyet -80 az 1 ay sonra keskin bir düşüş olacak ° C

6. Temsilcisi Sonuçlar ve Şekiller:

Şekil 1. Hsp104 Bifonksiyonel disaggregase. Düzensiz agrega (solda gösterilen) Disagregasyon HSP70 şaperon sistemi (HSP70 ve Hsp40) ² işbirliğini gerektirir. Hsp104 remodels in vitro HSP70 ve Hsp40 yardımı olmaksızın amiloid agrega (sağda gösterildiği gibi) emretti, ama HSP70 ve Hsp40 amiloid ^26,28 karşı Hsp104 etkinliği artırabilir. Ayrıştırılmasıyla teşvik etmek için merkezi bir kanal aracılığıyla substrat translokasyon Hsp104 çiftler ATP hidrolizi toplu yapılar, her iki tip. Tirozin taşıyan gözenek döngüler, merkezi ^kanal 49-52 yoluyla servis substrat meşgul .

Şekil 2. Ni-sepharose yakınlık arıtma adım SDS-PAGE analizi. Lizat, Ni Yük, Ni FT ve Ni eluat örnekleri% 4-20 Tris-HCl 1.0mm Kriter jel (Bio-Rad) ve Coomassie vitray kullanarak SDS-PAGE ile fraksiyone . Tüm Hsp104 Ni-sepharose bağlamak mümkün olduğunu unutmayın. Broad Range molekül ağırlığı belirteçleri (Bio-Rad) (şeritli solda) gösterilmiştir.

Şekil 3. Ni-sepharose eluat Kaynak S arıtma Mavi iz 280nm ve yeşil iz absorbans temsil% Tampon S + (maksimum% 50) temsil eder. % 20 oranında elutes ilk zirve, Q + kirleri, bozunma ürünleri ve yanlış katlanmış Hsp104 içerir. Ikinci ve önemli bir zirve düzgün katlanmış ve aktif Hsp104 içerir. Akış hızı 1ml/min idi. % 20-50 Q + Gradient 30 dakika ya da 5 sütun hacimleri. Ankastre: tepe fraksiyonları% 4-20 Tris-HCl 1.0mm Kriter jel (Bio-Rad) ve Coomassie vitray kullanarak SDS-PAGE analizi ile çözümlenir. Broad Range molekül ağırlığı belirteçleri (Bio-Rad) (solda) gösterilmiştir.

Şekil 4. ProTEV proteaz bölünme adım SDS-PAGE analizi, _6-Hsp104 Kaynak S arıtma, 30 ° C daha sonra 4 ° C ve 16 saat 4 saat proTEV proteaz ile tedavi edildi Örnekler% 4-20 Tris-HCl 1.0mm Kriter jel (Bio-Rad) ve Coomassie vitray kullanarak SDS-PAGE ile fraksiyone. ProTEV bölünmüş Hsp104 daha hızlı göç olduğunu unutmayın. Adım 3.7 'de açıklandığı gibi TEV proteaz ve uncleaved Hsp104 Ni-sepharose tükenmiş. Broad Range molekül ağırlığı belirteçleri (Bio-Rad) (solda) gösterilmiştir.

Şekil 5. Hsp104 boyutu dışlanma arıtma Hsp104 Superose 6 jel filtrasyon sütun (10/300, GE) ile saflaştırılmış kesildiler. Debi = 0.4ml/min. Kesik çizgiler arasında zirve toplanmış fraksiyonları temsil eder. Ankastre: tepe fraksiyonları% 4-20 Tris-HCl 1.0mm Kriter jel (Bio-Rad) ve Coomassie vitray kullanarak SDS-PAGE analizi ile çözümlenir. Broad Range molekül ağırlığı belirteçleri (Bio-Rad) (solda) gösterilmiştir.

Şekil 6. Lusiferaz reaktivasyonu tahlil Denatüre ateşböceği lusiferaz agrega (50 nm) Hsp72 ve Hsp40 (1 mikrona kadar) (Testi Tasarımlar hem de), Hsp104 (6μM monomer) veya Hsp104, Hsp72 ve 90 dk için Hsp40 ya da 25 ° C'de inkübe edildi. Denatüre lusiferaz sadece Hsp104 ve Hsp40/Hsp72 varlığı tamamen yeniden. Kurtarılan lüminesans Sonsuz M1000 plaka okuyucu (Tecan) ölçülür. Değerler anlamına gelir ± SEM (n = 3) temsil eder.

Tartışmalar

Zaman Çizelgesi: maksimum Hsp104 aktivite için tüm arıtma düzeni mümkün olduğunca hızlı bir şekilde tamamlanmış olması tavsiye edilir . Ancak, arıtma adımları her zaman pratik olmayabilir zorlu bir program yapar. Saflaştırma adımları en kısa sürede yapılması durumunda, 30 inkübasyon 2-4 saat gece ifade sonundan itibaren zaman ° C TEV proteaz ile yaklaşık 9-11 saattir. Duraklatmak için potansiyel bir yer TEV bölünme adım takip ediyor. Kesinlikle gerekli ise, Hsp104 ek bileşenini (...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası
BL21-CodonPlus-RIL Yetkili Hücreler	Stratagene, Agilent Technologies	230255
2XYT suyu	USB	75864
Eksiksiz, minivan, EDTA içermeyen proteaz inhibitörü tabletler	Roche	1836170
Pepstatin A	Sigma	P4265
Ni-sepharose 6 Hızlı Akış	GE Healthcare	17-5318-02
Amicon Ultra-15 santrifüj filtre üniteleri (MWCO 30.000)	Millipore	UFC903008
Kaynak Q - 6ml sütun	GE Healthcare	17-1179-01
proTEV Proteaz	Promega	V6052
AcTEV Proteaz	Invitrogen	12575015
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare	17-5172-01
Hsp40	Testi Tasarımlar	SPP-400
Hsp72	Testi Tasarımlar	ADI-NSP-555