活体显微镜的脾:寄生虫的流动性和血流量的定量分析

摘要

我们使用GFP转基因疟疾寄生虫和寄生虫的流动性和血流量在本机关的量化脾的活体显微镜的方法。

摘要

在实验啮齿动物疟疾模型活体显微镜的问世，使寄生虫-宿主^相互作用 1,2的知识的重大进展。因此，在预红细胞阶段疟原虫体内成像显示到皮肤淋巴结^3，寄生在皮肤⁴的完整的开发，并形成，以保证移民的一个肝细胞衍生merosome寄生虫的积极入口裂殖子释放进入血液流^5。此外，个人寄生虫在红细胞的发展，已最近记录使用4D成像和挑战我们目前蛋白^在疟疾6出口。因此，活体成像，从根本上改变我们对疟原虫发展中的关键事件。不幸的是，疟疾寄生虫通过脾，一个主要的淋巴器官的动态通过的研究精美的适应，以清除感染的红Blood细胞缺乏由于技术上的限制。

BALB / C小鼠约氏疟原虫疟疾的小鼠模型，我们已经实施了脾的活体成像和屏障红髓中的成纤维细胞的起源细胞，期间报告的差重塑和坚持寄生的红细胞（pRBCs）与非致命性寄生虫线P.yoelii 17X感染，而不是P.yoelii 17XL致命寄生虫线⁷感染。为了达到这些结论，一个特定的方法，使用ImageJ免费软件开发，使快速立体单pRBCs运动的特性。获得的结果与本议定书允许速度，方向和居住的寄生虫的时间确定在脾，所有参数，解决在体内坚持。此外，我们报告的血流量，用活体显微镜量化和不同的使用方法着色剂，以获得洞察到复杂的微循环结构的脾ferent。

伦理声明

在巴塞罗那大学动物设施在巴塞罗那CEEA瑞银（协议没有DMAH:5429）大学动物实验伦理委员会批准的准则和协议的规定，所有的动物实验研究。从查尔斯河实验室获得6-8周龄雌性BALB / c小鼠。

研究方案

这种方法是在^7日报道，研究使用。

1。动物与绿色荧光蛋白（GFP）转基因寄生虫感染

1. P.约氏疟原虫 - GFP转基因17XL和17X线使用相同的载体，定位策略和协议描述为 P 伯氏 ^8。他们表示下普遍存在的P.推动者⁹ GFP的突变3变 ​​种疟原虫延伸因子1（Pbeef1a），指示组成型表达GFP的寄生虫在红细胞内发育周期的整个细胞质中。
2. 注入动物腹腔内寄生的红细胞P.（pRBCs）约氏疟原虫 - GFP转基因株系17XL和17X，从供体小鼠的尾巴的血液在5-10％原虫和PBS稀释。 5X10 ⁵ pRBCs /鼠标的使用剂量达到1％的外围原虫后3天，infecti（PI）。
3. PI在第3天，检查与两个寄生虫线感染小鼠的原虫是相同的，通过做血液涂片用姬姆萨染色和与100X的油客观光显微镜下观察的尾巴血液下降。原虫估计约300红细胞光学领域中的红细胞总数的pRBCs比例计算。
4. 可用于注射用FITC标记的红细胞的控制动物的特点，在正常脾脏，这些细胞的运动。

2。 FITC和注射，以控制动物的红血细胞的标记

1. 通过一个BALB / c小鼠心脏穿刺收集200μL的1毫升血总用含乙二胺四乙酸（EDTA）（100克/升，pH值7.4），并在PBS / EDTA洗涤红细胞颗粒（0.1克/ L，pH 7.4）中，通过离心5分钟，在室温（RT）在300 XG（分）。
2. 在300和200μL红细胞沉淀重悬万亩; PBS / EDTA（0.1克/升，pH值8）含有FITC标记（10克/升），并在黑暗轻轻摇动2小时在室温下孵育升。此后，上清液被删除，细胞洗五次PBS / EDTA（0.1克/升，pH值7.4）（300 XG，5分钟，RT）。
3. 在体内实验中，稀释10μLFITC标记的红细胞沉淀在200μL的PBS，注入静脉注射到BALB / c小鼠，以达到1％的FITC标记的红细胞在循环。

3。外科手术

1. 准备注射麻醉剂100毫克/公斤的氯胺酮和5毫克/公斤的蓝精灵每剂量根据动物的重量组成。小鼠腹腔注射一剂麻醉剂。 Readminister一半的剂量每30分钟保持鼠标全职麻醉。
2. 保持鼠标的温暖和验证，鼠标是完全麻醉按捏，然后再继续垫脚（通常是5-20分钟后）。
3. 为了在实验的过程中促进静脉给药的物质，cannulate尾静脉鼠标使用27G套管。检查，以及静脉内注射生理盐水缓冲液20-50定位针，并用胶带密封。如果它阻碍，重复静脉插管上游。注意不要引入气泡。
4. 通过在动物的左背侧皮肤和肌肉的小切口，暴露脾下的一部分。将少呼吸运动是观察脾，适用于暴露的表面，以保持它的清洁鼠标的头发和水合PBS。
5. 60x24mm的掩护滑氰基丙烯酸酯胶粘剂（超级乐泰胶3）脾周围皮肤，让可视化密封。

4。成像在脾脏的生活寄生虫

1. 显微镜活体实验进行了Leica TCS - SP5的共聚焦显微镜（Leica微，德国海德堡）配备孵化温度控制系统，APO 63X甘油浸泡物镜（NA 1.3），在8000线/ s和氩气（488纳米）和氦氖（594纳米，633纳米谐振扫描仪）激光器。可能需要额外的激光器，如蓝色二极管（405纳米）和二极管泵浦固态（561纳米），表1中列出的探针的激发。
2. 盖下滑脾朝下的目标，放在显微镜阶段的动物。脾脏微循环障碍结构的一个普遍的看法，可以选择可视化使用20倍的目标。红细胞反射对比将有助于选择不同地区的利益，在更高的放大倍率之后形象。
3. 63X甘油浸泡的目的，采用组织自体荧光的镜头聚焦感兴趣的选定区域。 GFP寄生虫观察经过不同领域的脾。
4. 荧光是记录在两个不同的茶nnels（激发/发射波长488/505-580 FITC / GFP和488/570-630组织自体荧光纳米的纳米）与针孔设置为3.0艾里单位。红细胞反射（488/480-495纳米），连同荧光染料标记的血液血管（见表1），用于成像和血流下面描述的实验区获得更多的信息。
5. 通过五个捕捉图像的Z堆栈覆盖，因为立体感的器官8微米的深度，速度为8 kHz，1.5分钟生成的视频。
6. 脾进行定量分析不同区域的记录影片。

5。健脾和微血管血流量测量的图像采集活体显微镜

1. 溶解在生理盐水中的重要的荧光探针，可以到尾静脉注射在血管和洞察到脾的结构图像的实验。列表A探针及其应用是在表1 ^10。
2. 标签用荧光葡聚糖的血管系统，准备70 kDa的葡聚糖与德克萨斯红标记在100μL缓冲液1毫克。
3. 使用空心尾静脉注入荧光葡聚糖成像动物。
4. 横向设置的船只，在激光扫描的方向，光场的旋转（不影响速度）。使用XY和XT线在该船只的中央管腔扫描模式。使用双向扫描速度为8 kHz，获得一个512 × 512像素的图像线平均为32。
5. 船只在三个不同的渠道（激发/发射波长488/505-580纳米，594/605-660纳米，FITC / GFP，右旋糖酐德克萨斯红和红细胞反射，分别488/480-495纳米）获取图像。
6. 以不同直径和心动周期不同阶段的船只图像，以弥补波动。在这些图像，移动细胞产生的条纹将被用来量化血流^11。

6。图像处理和寄生虫的流动性的定量分析，使用ImageJ软件

1. 创建一个使用ImageJ软件（版本1.39o，韦恩Rasband，国立卫生研究院，生成图像序列实时视频www.macbiophotonics.ca ）。
2. 打开"LIF"ImageJ中的文件保持"xyzct"序列和分离通道。
3. 注册从元数据文件中的一些有用的信息:dblvoxelX体素宽，dblvoxelY体素高，dblvoxelZ体素的深入和帧之间连续的Z -帧和协议栈之间的间隔。这些信息将被用于校准。
4. GFP寄生虫图像（通道1）减去自体荧光（通道2）。筛选与高斯模糊= 1图像。请记得，在图像中使用高斯模糊滤镜需要PUBLICATIO宣布NS。保存文件"animal1_m1_substract.seq"。
5. Z -编码的彩色视频创建为支持寄生虫流动性的定量分析材料，因为这将促进在快速移动的粒子和Z轴的运动特性的单粒子鉴别。
6. 堆栈转换图像5D，第三维Z和第四维时间。每个Z和覆盖不同的颜色。
7. 项目所有的Z使用所有的时间帧的最大强度，以创建一个Z -编码的彩色视频。另存为"animal1_m1_Z_color.avi"。
8. 分类和标签出现在视频的第10帧的时间，根据居住的帧数量（从1到10）的所有粒子。在每部影片中，20粒子将跟踪以下所得的比例。共120寄生虫3只动物将被量化，使用6个视频/动物代表不同区域的脾。
9. 报告对每个Z居住帧在整部影片是可以量化的所有粒子。
10. 执行4D（X，Y，Z，T）手册使用MTrackJ插件（大肠杆菌Meijering书面）的粒子跟踪。打开文件图片5D"animal1_m1_substract.seq"，并设置图像的属性，使用像素宽度，高度，深度（微米）和堆栈的时间间隔（秒）之前注册的信息。配置轨道设置如下:"移动到下一次"和"适用于本地光标明亮centroid/25x25pixel"。配置显示:"起源"，"形象展示"，"显示积极跟踪"，"只显示电流通道的轨道"，"只显示在当前时间点跟踪"。
11. 添加为每个粒子的轨道。考虑排量只有高于6微米（平均直径为PRBC）在Z轴的运动。按照超过100帧的最大的粒子。
12. 保存的X，Y，Z和"animal1_m1_p1"从轨道测量吨的坐标。XLS。
13. 位移的措施（D = _SQRT（（X决赛- X _头文字 ^）2 +（Ÿ _最后 - Y _头文字 ^）+（Z _最后 - Z _头文字 ^）2）;路径长度（P _{=ΣN = 0→最终} SQRT（（X _{N +1} - X ^_N）2 +（ ₁ - Y _Y N _{^N）2 +（Z} N _{+1 Z} ^N）2）用n表示每个位置跟踪;平均流速和停留时间可使用X，Y，值计算Z，吨坐标跟踪校准根据登记的数据。粒子的方向性定义为位移与路径长度的智商值接近1表示定向运动和价值观接近0表示^克制运动12一个计算模板是推动封闭。

7。体积血流量的计算

1. 体积血流量Q = V *π*深_V ² / 4，V字形，红细胞流速在横截面一个估计ND D _V，管腔血管直径^11。
2. 要计算V，测量角度（θ）五粒子呈现出明亮的反射（RBC）和4个粒子的条纹，在每个XT使用ImageJ软件的图像显示绿色荧光（PRBC - GFP ）的条纹。 XY图像的流明测量血管直径。
3. 则表示速度为V = 1/tan（θ）* _D E / D _V至正常化红细胞_（D E = 6微米）和管腔的血管直径。
4. 量化至少三个不同直径的船只，每艘船五XT图像。

8。统计分析

1. 进行统计分析，积的方向性，平均密度分布的速度和停留时间和使用STATA（IC10）在平等的中位数测试，以评估两者之间的寄生虫线差异。

9。代表性的成果

活体IMA蔓茎在脾GFP的寄生虫透露流动性寄生虫两个菌株之间的差异。单寄生虫的流动性参数的定量分析表明，降低速度，缺乏方向性和增强17X株感染小鼠的寄生虫的停留时间。此外，船只体积血流量没有改变菌株间^7。图1A的技术程序。图1B显示了一个用FITC标记的红细胞注入鼠标的正常脾的总的看来，在进入红髓变焦和其他的船只（图1B，放大，分别在1和2）。血管被证明由70 kDa的葡聚糖得克萨斯红一起注射红细胞反射对比。在表1中总结的其他荧光染料，可用于获取信息的器官被成像，如赫斯特（图1C，1D），。

17XL和17X应变寄生虫实时成像是在1和2电影，一些17X - PRBC（电影2）呈现出滚环的行为。流动性参数的定量分析是通过跟踪个人寄生虫的Z -编码的彩色图像的帮助。图2A显示了一个Z -编码的颜色栈，包围粒子出现在不同的平面移动Z轴投影。图2B和2C的曲目，分别代表不同的17X和17XL感染寄生虫。的图2D和2E寄生虫人口密度分布图，分别从方向性和停留时间的所有量化颗粒结果。为了监视在使用活体显微镜脾血流量，从红细胞运动船只的中央管腔XT图像获得的条纹进行测定，计算速度^11。图像显示XY相应的XT扫描线（图2G）的船只的扫描（图2F）。

荧光PROBË	本地化	1光子激发（NM）	2光子激发（NM）	检测排放（NM）	数量/鼠标重量
赫希斯特33342	膜permeant DNA结合探头。标签静脉注射后的所有核细胞（活的和死的）。	405	800	410-480	12.5克/公斤
碘化丙啶	膜impermeant DNA结合探头。它的标签损害膜细胞凋亡和坏死细胞的细胞核。	561	800	570-650	250毫克/千克
70000 MOL WT葡聚糖荧光（FITC，德克萨斯州红）	流体相的标志物，提高血浆的对比。	FITC标记的488得克萨斯州红594	800	500-540 600-650	50毫克/千克
荧光素钠	散装流体相白蛋白标记，提高血浆的对比。	488	800	500-540	2毫摩尔/千克
伊文思蓝	散装流体相白蛋白标记，提高血浆的对比。	633	ND	645-700	20毫克/千克
若丹明R6	活跃​​的线粒体中积累的重要探头。它的标签后，静脉注射白细胞内皮细胞和循环。	561	800	570-650	25毫克/千克
Fluospheres - 1微米直径	珠是由细胞吞噬活性摄取。	488	800	500-540	ND
Alexa488标记的纤维蛋白IIβ链特异性抗体	探测器标签纤维素IIβ链	488	800	500-540	0.3毫克/千克

表1:活体显微镜荧光探针。标签脾在体内，可用于不同的本地化至关重要的荧光染料。激发/发射（EXC / EM）的范围与单光子（或双光子显微镜）提供使用。剂量表示溶解在缓冲液0.1-0.2毫升和鼠标的尾静脉注射。 [ND:在这项研究中确定。

图1。脾的活体显微镜。答:徕卡TCS - SP5共聚焦显微镜显微镜舞台上放置一个鼠标。鼠标B.形象代表面积的非感染动物注射用FITC标记的红细胞脾脾下部封面滑揭露和密封。70 kDa的葡聚糖德克萨斯红的血管可视化。反射（黄色），葡聚糖（蓝色）和FITC标记的红细胞（绿色）所示。在打击白框代表（1）开放式循环和密切循环（2）地区。开放式循环（C）和关闭循环（四）与70 kDa的葡聚糖（红色）和Hoechst 33342（蓝色）染色。

图2。寄生虫的流动性和血流量。 交流的量化。粒子的运动定量分析的四个维度（4D）便利通过使用颜色编码的图像处理。A.跟踪的Z -编码的颜色代表使用5个不同深度的最大强度投影图像，深入的信息进行。白色矩形代表一个时间点的不同Z相同的粒子。不同的位置，由于采集时间之间的失误不同Z图像。深度代码:黄色（1微米），橙（2微米），粉红（4微米），蓝（6微米），绿（8微米）B，C.粒子运动的时间推算，每个时间间隔颜色:灰色（0-2.4秒），青色（2.4-4.8秒），洋红（4.8-7.0秒），红（7.0-9.4秒）和黄色（9.4-11.8秒）。白线代表4D手动跟踪使用MTrackJ D，E GFP的颗粒密度分布的方向性值（四），17X（11.8）（B）和17XL（4.8秒）（三 ）绿色荧光蛋白寄生虫颗粒停留时间（E）。数据对应的每一行从与平等中位数测试分析的三个独立实验的寄生虫和100 FITC标记的红细胞120颗粒。 17X/17XL/FITC-RBCs位数0.53/0.75/0.85（D）和两线之间的差异4.61/0.67/0.9秒（五）。 荣>（D）和（五）有统计学显着性 （P <0.001 ）。 FITC标记的红细胞和17XL寄生虫之间的差异没有统计学意义（P> 0.05），F，G.脾虚血流量测量。从同一艘船（白线）的中央管腔行扫描XY图像（F）和XT图像（G）的代表。脾血管与70 kDa的葡聚糖（红色），PRBC（绿色）和红细胞的反思（蓝色）血浆。

（2）电影1和2。定时17XL（1）或17X感染小鼠脾活体显微镜图像GFP转基因在10％原虫寄生虫（Z轴的最大投影）。寄生虫和组织自体荧光显示在绿色和红色分别。标尺代表10μm和秒的时间间隔。
V">点击这里观看电影1。
点击这里观看电影2。

讨论

脾在这种啮齿动物疟疾模型的活体显微镜的实施开通过这个到现在为止一直被认为是"黑盒子"由于技术方面的考虑机关调查寄生虫的动态通过的可能性。在这里，一个重要的努力，以适应定量的方法，它允许在单一和人口的水平比较分析，不同的寄生虫线。相反，其他组织和细胞已疟疾^3,5前成像，成像通过pRBCs通过脾需要考虑到三个维和条块分割的器官，不同的环流存在，快与慢¹³...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
徕卡TCS - SP5共聚焦显微镜	徕卡显微系统，德国海德堡	TCS - SP5的序列号。 5100000419
氯胺酮（Ketolar 50毫克/毫升）	辉瑞公司	631028
蓝精灵15毫克/ 3毫升	Normon	838193
葡聚糖70000兆瓦，德克萨斯红标记	分子探针	D1830
异硫氰酸荧光素异构体，我（FITC）	西格玛	F7250
赫希斯特33342	西格玛	H1399
姬姆萨染色	西格玛	GS1	工作的解决方案是在10％蒸馏水
超级胶水，乐泰3	乐泰	9975-0880