脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

要約

我々は、GFPトランスジェニックマラリア原虫を用いて脾臓の生体顕微鏡検査を実施するための方法およびこの器官内の寄生虫のモビリティと血流​​の定量化を示す。

要約

実験的なげっ歯類のマラリアモデルにおける生体顕微鏡の出現は、寄生虫-宿主相互作用の^1,2の知見に大きな進歩を可能にした。このように、前赤血球段階でマラリア原虫のin vivoイメージングで皮膚のリンパ節^3、皮膚の⁴の寄生虫の完全な開発、および移行を確保するために、肝細胞由来のmerosomeの形成に寄生虫のアクティブな入り口を明らかにしたと血流⁵にメロゾイト放出。また、赤血球内の個々の寄生虫の開発は、最近の4Dイメージングを使用して文書化し、マラリア⁶のタンパク質輸送上の私たちの現在のビューに挑戦されています。従って、生体内イメージングは根本的にマラリア原虫の開発における重要なイベントに関する我々の見解を変更しました。残念なことに、脾臓、主要なリンパ器官を通じて、マラリア原虫のダイナミックなパッセージの研究は、絶妙に感染した赤のBをクリアするように適応lood細胞は、技術的な制約のために不足している。

Balb / cマウスにおけるマラリア原虫yoeliiのマウスモデルを用いて、我々は、脾臓の生体内イメージングを実施し、中に赤い果肉の繊維芽細胞由来の障壁の細胞にそれと寄生された赤血球の付着（pRBCs）の差動リモデリングを報告している非致死的な寄生虫ラインP.yoelii 17倍の感染は、P.yoelii 17XL致死寄生虫の⁷行目で感染することに反対した。これらの結論に到達するには、ImageJのフリーソフトを使用して、特定の方法論は、シングルpRBCsの高速三次元運動の特性評価を可能にするために開発されました。このプロトコルを用いて得られた結果は、脾臓の寄生虫の速度、方向性と滞留時間を決定する生体内での遵守に取り組むすべてのパラメータを許可する。さらに、我々は、血流の生体顕微鏡を用いて定量化し、差を使用するための方法論を報告する脾臓の複雑な微小構造への洞察を得るためにferent着色剤。

倫理の文

すべての動物実験は、バルセロナCEEA - UB（：5429プロトコルなしDMAH）の大学の動物実験のために倫理委員会で承認されたガイドラインとプロトコルに準拠して、バルセロナ大学の動物施設で実施した。年齢の6-8週の雌BALB / cマウスはチャールズリバー研究所から入手した。

プロトコル

このメソッドは^、7に報告された研究で使用されていました。

1。緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子組換え寄生虫を持つ動物の感染症

1. 戦略およびプロトコルをターゲットP. 17XLと17倍のyoelii - GFPトランスジェニックラインが同じベクトルを使用して生成されたが、P.のため別の場所で説明berghei ^8。彼らは、P.のユビキタスプロモーター下にGFP ⁹の変異体3バリアントを表現全体の内の赤血球の発達サイクルの間に細胞質ゾルの寄生虫GFPの構成的発現を指示するberghei伸長因子1（Pbeef1a）、。
2. P.の寄生された赤血球（pRBCs）を動物の腹腔内に注入する5〜10％の寄生虫血でドナーマウスの尾の血液から得られるとPBSで希釈したyoelii - GFPトランスジェニック系統17XLと17倍。 3日後infectiで1％の周辺寄生虫に到達するための5 × ⁵ pRBCs /マウスの用量を使用して、（π）上。
3. 3日目πで、両方の寄生虫の線に感染したマウスのその寄生虫をチェック100倍油浸対物と光顕微鏡下でギムザ染色と観察が続くテール滴の血液で血液塗抹を行うことで同じです。寄生虫は、約300赤血球の3つの光学分野での総赤血球上pRBCsの割合を計算することによって推定される。
4. FITC -標識赤血球を注射の対照動物は、通常の脾臓においてこれらの細胞の動きを特徴付けるために使用することができます。

2。動物を制御するために、FITCと注射で赤血球のラベリング

1. PBSを含むエチレン200μlのBalb / cマウスの心臓穿刺による総1mlの血液が（0.1グラム/四酢酸（EDTA）（100 g / Lの、pH7.4）をジアミンとPBS / EDTAでRBCペレットを洗浄集める室温で5分（min）のため、300 xgで遠心分離を介してL、pH 7.4）中（RT）。
2. 300＆でRBCペレットを200μlの再懸濁しムー、FITC（10g / Lの）と穏やかに撹拌しながら暗所で室温で2時間インキュベートを含むPBS / EDTAのL（0.1g / Lの、pHを8）。その時間の後、上清を除去し、細胞をPBS / EDTA（0.1g / Lの液、pH7.4）で5倍（300 × gで、5分、RT）を洗浄する。
3. 循環で1％FITC - RBCを達成するために、in vivoの実験では、PBS200μlのFITC標識RBCペレットを10μlを希釈し、Balb / cマウスに静脈内注入する。

3。外科的処置

1. ケタミン100 mg / kg及び動物の体重に応じてミダゾラム当たり投与量の5 mg / kgをから構成される注射麻酔薬を準備。麻酔薬の単回投与したマウスの腹腔内に注入する。フルタイムで麻酔マウスを維持するために30分毎に投与量の半分をReadminister。
2. マウスの暖かいを保持し、マウスが先に進む前に足のパッドをつまんで（​​通常は5〜20分間後に）完全に麻酔であることを確認します。
3. するために実験の過程で物質の静脈内投与を容易に、27Gカニューレを使用してマウスの尾静脈にカニューレを挿入する。針はよく生理食塩水バッファの20〜50μlを注入して静脈内に配置されていることを確認し、テープで密封します。それが妨害する場合、静脈の上流にカニュレーションを繰り返します。気泡を導入しないように注意してください。
4. 動物の左背側の皮膚と筋肉組織の小さな切開部から脾臓の劣った部分を公開します。小さい呼吸の動きが観察された脾臓を配置し、マウスの毛の清潔と水分を保つために露出した表面にPBSを適用します。
5. 可視化を可能にするために脾臓を周囲の皮膚へのシアノアクリレート系接着剤と60x24mmのカバースリップを（スーパー接着- 3ロックタイト）封印。

4。脾臓で生きている寄生虫のイメージング

1. 生体顕微鏡実験は、ライカTCS - SP5共焦点顕微鏡（ライカで実施した温度制御とのインキュベーションシステムを搭載したマイクロシステムズ、ハイデルベルク、ドイツ）、APO 63xグリセロールの液浸対物レンズ（NA 1.3）、8000ライン/秒とアルゴン（488 nm）とヘリウムネオン（594 nmの、633 nm）で共鳴スキャナレーザー。このような青色ダイオード（波長405nm）とダイオードポンプ固体状態（561 nm）のような追加のレーザーは、、表1に記載されているプローブの励起のために必要となる場合があります。
2. カバースリップ脾臓が目標に下向きにして顕微鏡のステージに動物を置きます。脾臓の微小循環の構造の一般的なビューは、必要に応じて20倍の対物レンズを用いて可視化することができる。 RBCの反射コントラストはその後より高い倍率で画像への関心の異なる領域を選択するために役立ちます。
3. 組織の自家蛍光を使用して63xグリセロールの液浸対物レンズで関心の選択された領域をフォーカス。 GFPの寄生虫は、脾臓の異なる領域を通過観察される。
4. 蛍光は、2つの異なるチャチャに記録されます3.0エアリー台にピンホールがセットされたnnels（FITC / GFPと組織の自家蛍光用488/570-630 nmの励起/発光波長488/505-580 NM）。一緒に蛍光色素を持つRBC反射（488/480-495 nm）を、（表1参照）、血液の血管系にラベルを付けるためには、後述の血流の実験で撮像されたとされるゾーンの追加情報を取得するために使用されています。
5. 8 kHzの速度でために臓器の三次元の8μmの深さをカバーするZ -スタックが、1.5分のビデオを生成するために5を介して画像をキャプチャ。
6. 定量分析のための脾臓の異なるゾーンの記録ビデオ。

5。血流測定のための脾臓と画像取得の微小血管の生体顕微鏡

1. 等張生理食塩水に溶解した極めて重要な蛍光プローブは、脾臓の構造にイメージするために実験中に尾静脈に血管系とゲイン洞察力を注入することができる。一覧プローブとその応用の表1 ¹⁰に表示されます。
2. 蛍光デキストランで血管系にラベルを付けるには、生理食塩水緩衝液100μlにテキサスレッドでラベルされた70kDaのデキストランの1mgを準備する。
3. 撮像される動物に蛍光デキストランを注入するカニューレ尾静脈を使用してください。
4. 光電場の回転（速度に影響を与えることではない）で、レーザー走査の方向に、水平方向に船を設定します。船の中央の内腔にxyとXTラインスキャンモードを使用してください。 512 × 512ピクセルの画像を得るために8 kHzの速度で32行平均で双方向スキャンを使用してください。
5. 3種類の異なるチャンネル（励起/発光波長488/505-580 NM、594/605-660 NM、FITC / GFP、デキストラン-テキサスレッドおよび赤血球反射、それぞれに対して488/480-495 nm）の上で船の画像を取得する。
6. 変動を補償するために、異なる径とし、心周期の異なる段階以上の船舶の画像を撮影する。これらのイメージでは、セルの移動に起因する筋は血流^11を定量化するために使用されます。

6。画像処理すると、ImageJソフトウェアを使用して、寄生虫のモビリティの定量分析

1. ImageJのソフトウェア（バージョン1.39o、のWayne Rasband、NIH、使用して生成された動画像からのリアルタイム映像を作成しますwww.macbiophotonics.ca ）。
2. ImageJの維持"xyzct"シーケンスと区切られたチャンネルに"。LIF"ファイルを開きます。
3. 連続したZ -フレーム間とスタック間のdblvoxelXボクセル幅、dblvoxelYボクセルの高さ、dblvoxelZボクセル深さとフレームの間隔：メタデータファイルからいくつかの有用な情報を登録します。この情報は、キャリブレーションのために使用されます。
4. GFP -寄生虫の画像（チャンネル1）に減算自己蛍光（チャンネル2）。ぼかし（ガウス）= 1で画像をフィルタリングする。画像にガウスぼかしフィルタを使用するとpublicatioに対して宣言する必要があることを思い出してください。NS。 "animal1_m1_substract.seqを"ファイルに保存します。
5. それは動きの速い粒子とZ -運動特性に単一粒子識別を容易にするので、Z -コード化されたカラービデオは、寄生虫のモビリティの定量分析のための支持材料として作成されます。
6. 三次元ではZと時間という四次元であることと、イメージ5Dへのスタックを変換する。各Zとオーバーレイに異なる色を与える。
7. Z -コード化されたカラーのビデオを作成するためにすべての時間枠で最大強度を使用して、すべてのZを投影する。 "animal1_m1_Z_color.avi"として保存します。
8. 居住のフレーム数（1から​​10まで）に応じて、ビデオの最初の10時間枠で表示されるすべての粒子を分類し、ラベルを付けます。それぞれのビデオでは、20個が得られる割合は、次の追跡されます。合計で、120寄生虫は、脾臓の異なるゾーンを表すsixビデオ/動物を使って、3匹の動物から定量されま​​す。
9. 各Zに居住のフレームを報告すると定量化するために、すべての粒子のため、ムービー全体にわたって。
10. MTrackJプラグインを（E. Meijeringによって書かれた）を使用して粒子の4D（X、Y、Z、t）は手動トラッキングを行います。イメージ5Dのようなファイル"animal1_m1_substract.seq"を開き、ピクセルの幅、高さ、深さ（μm単位）とスタックの間隔（秒単位）から、前に登録された情報を用いて画像のプロパティを設定します。次のように、トラックの設定を構成します。"次回への移動"と"ローカルカーソル明るいcentroid/25x25pixelを適用する"。表示設定："の原点を示す"、"画像を表示"、"アクティブなトラックを表示"、"現在のチャンネル内に存在するトラックを表示"、"現在の時点でのポイントを追跡のみ表示"。
11. 各粒子のトラックを追加。変位は6μmの（pRBCの平均直径）よりも高い場合にのみ、Z軸の動きを考慮してください。 100フレームの最大値を超える粒子に従ってください。
12. X、Y、Zと"animal1_m1_p1"としてトラックから測定トン座標。xlsファイルを保存します。
13. 変位（D = SQRT（（X _の最終のための措置- X ^_inital）2 +（yの_最後の - yを^_inital）2 +（zの_最後の - zの^{_{inital）2）、}}パスの長さ（P _{=Σn = 0のとき→最後の} SQRT（（X _{n +1個の} - X ^_N）2 +（ nは、追跡の各位置を示すとyの_{n +1個の} - Y ^_N）2 +（zの_{n +1個の} - Z ^_N）2）、平均速度および滞留時間は、x、y、zから値を使って計算することができますは、t座標キャリブレーション追跡登録されたデータによると。粒子の方向性は、1に近いことを示す指示運動と0に近いことを示す拘束運動¹²の値までの値を使用して、変位とパスの長さの商として定義されています。計算のためのテンプレートが囲ま促進される。

7。体積血流量の計算

1. 体積血流量はQ = V *π* VとD _V ² / 4、、赤血球速度以上の断面積として推定されND D _V、内腔の血管径^11。
2. Vを計算するには、明るい反射（RBC）とImageJのソフトウェアを使用して、各XTの画像に緑色の蛍光（pRBC - GFP）を示す4つの粒子の縞を示すfive粒子の縞の角度（θ）を測定します。 XYの画像上でルーメンの血管径を測定します。
3. 速度は次のように表され、V = 1/tan（θ）* _D、E / D赤血球_（D、E = 6μm）と内腔の血管径を補正するために_V。
4. 船舶ごとに異なる​​直径と5つのXTの画像と3隻の最小値を定量化する。

8。統計的分析

1. 統計分析、プロットの方向性については、密度分布として、速度と平均滞留時間二寄生線との相違を評価するためにSTATA（IC10）で平等 - の - 中央値のテストを使用してください。

9。代表的な結果

生体内IMA脾臓でのGFPの寄生虫のパトンには、寄生虫の二系統の間で移動度の違いを明らかにした。単一の寄生虫のモビリティのパラメータの定量的な分析は減少速度、方向性の欠如と17倍の株に感染したマウスの寄生虫の増補滞留時間を示した。また、血管内の体積の血流が系統⁷との間で変化しなかった。技術的な手順は、図1Aに示されている。図1Bは、容器に赤脾髄と別の（図1B、それぞれ1と2、ズームイン）への拡大と、FITC標識赤血球を注入されたマウスの正常な脾臓の一般的な見解を示しています。血管系は、赤血球の反射コントラストと一緒に70kDaのデキストラン-テキサスレッドを注入することによって証明されました。表1にまとめた他の蛍光色素は、ヘキスト（図1C、1D）として撮像される臓器に関する情報を、得るために使用することができます。

17XLと17倍の株の寄生虫のリアルタイムイメージングは​​、作品1と2に示すローリングサークル挙動を示す（動画2）いくつかの17倍 -​​ pRBCと。モビリティのパラメータの定量的な分析は、Z -コード化されたカラー画像の助けを借りて、個々の寄生虫の追跡を通じて達成された。図2Aに囲ま粒子は、異なる平面に移動表示されるZ -コード化されたカラースタック、のZ -射影を示しています。図2Bおよび2Cは、それぞれ17倍および17XL感染で異なる寄生虫のトラックを表しています。定量化のすべての粒子の方向性と滞留時間からの結果はそれぞれ、2Dおよび2E図における寄生虫人口の密度分布のマップとして表示されます。生体顕微鏡を用いて脾臓の血流を監視するには、赤血球の動きに起因する血管の中央内腔のXTの画像で得られた筋は、速度^11を計算するために測定した。画像は、対応するXTラインスキャン（図2G）と容器のXY走査（図2F）を示す。

蛍光PROB電子	ローカライゼーション	1光子励起（nm）の	2光子励起（nm）の	検出された放射（波長）	数量/マウス体重
ヘキスト33342	膜透過性のDNA結合プローブ。それは、静脈内注射後のすべてのセル（生と死）の核にラベルを付けます。	405	800	410から480	12.5グラム/キログラム
ヨウ化プロピジウム	膜非透過性のDNA結合プローブ。これは、標的の膜（アポトーシスおよびネクローシス細胞）と細胞の核にラベルを付けます。	561	800	570から650	250 mg / kgの
7万モル重量デキストラン蛍光（FITC、テキサスレッド）	液相プラズマのコントラストを高めるマーカー。	FITC 488テキサスレッド594	800	500から540 600から650	50 mg / kgの
ナトリウムフルオレセイン	プラズマのコントラストを向上させるバルク液相アルブミンマーカー。	488	800	500から540	2ミリモル/キロ
エバンスブルー	プラズマのコントラストを向上させるバルク液相アルブミンマーカー。	633	ND	645から700	20 mg / kgの
ローダミンR6	アクティブなミトコンドリアに蓄積する重要なプローブ。それは、静脈内注射後の内皮と循環白血球にラベルを付けます。	561	800	570から650	25 mg / kgの
Fluospheres - 1micron径	貪食能を持つ細胞でuptakenされているビーズ。	488	800	500から540	ND
Alexa488標識フィブリンIIβの鎖特異的抗体	プローブ、ラベルフィブリンIIβチェーン	488	800	500から540	0.3 mg / kgの

表1。生体顕微鏡用蛍光プローブ。 in vivoで脾臓のラベル付けに使用されている別のローカライズを有する生体蛍光色素。励起/発光は（EXC / EM）一光子（または2光子顕微鏡）で使用する範囲が提供されています。示される用量は、生理食塩水緩衝液の0.1〜0.2ミリリットルに溶解し、マウスの尾静脈に注入されます。 [ND：本研究で決定ではない。

図1。脾臓の生体顕微鏡。 A.ライカTCS - SP5顕微鏡のステージ上に配置つのマウスと共焦点顕微鏡。マウスは、カバースリップを露出し、密封脾臓の劣った部分を持っています。B.の FITC -標識赤血球を注入された非感染動物の脾臓の代表的な領域の画像と血管系を可視化する70kDaのデキストラン-テキサスレッド。反射（黄色）、デキストラン（青）とFITC -赤血球（緑色）が表示されます。白い箱のブローアップでは、オープン循環（1）と密接な循環（2）の領域を表します。オープン循環（C）と70 kDaのデキストラン（赤）およびHoechst 33342（青）で染色クローズ循環（D）。

図2。寄生虫のモビリティと血流。ACの定量。四次元（4D）の粒子の運動の定量的な分析は、色分けされた画像処理を使用することによって促進される。A.トラッキングの5つの異なった深さの最大値投影を使用して表現Z -コード化されたカラー画像からの奥行き情報を用いて行った。白い長方形は、1時点で別のZで同じ粒子を表しています。別の位置は、買収の間の時間経過によるものです。別のZの画像の。深さのコード：（0μm）を黄色、オレンジ（2μm以下）、ピンク（4μM）、青（6ミクロン）、緑（8ミクロン）のような着色された各時間間隔で粒子の運動のB、Cの時間の予測：。グレー（0から2.4秒）、シアン（2.4〜4.8秒）、マゼンタ（4.8〜7.0秒​​）、赤（7.0〜9.4秒）と黄色（9.4から11.8秒）。白いラインはMTrackJ。D、方向性の値（D）によるGFPの粒子の密度の大腸菌の分布とを用いて17倍（11.8秒）（B）および17XL（4.8秒）（C）GFPの寄生虫の粒子の4D手動トラッキングを表します。滞留時間（E）。データは、寄生虫と平等 - の - 中央値検定で分析した3つの独立した実験から100 FITC -標識赤血球のそれぞれの行の120の粒子に対応しています。 17X/17XL/FITC-RBCsの中央値は0.53/0.75/0.85（D）と4.61/0.67/0.9秒（E）です。における2線間の違いは、 栄>（D）及び（E）（P <0.001）、統計的に有意である。 FITC -標識赤血球と17XL寄生虫の違いは、（P> 0.05）。F、G.の脾臓の血流の測定は統計的に有意ではない。同じ容器（白い線）の中央の内腔のラインスキャンからXY画像（F）とXTの画像（G）の表現。 70kDaのデキストラン（赤）、pRBC（緑）と赤血球反射（青）でプラズマを示す脾臓の血管。

作品1と2。17XL（1）または17倍に感染したマウス脾臓のタイムラプス生体顕微鏡の画像（2）10％の寄生虫血でGFP -トランスジェニック原虫（Z -最大投影）。寄生虫や組織の自家蛍光はそれぞれ緑色と赤色で表示されます。スケールバーは10μmを表し、時間間隔は秒になります。
Vは"​​>ムービー1を見てここをクリックしてください。
ムービー2を見てここをクリック。

ディスカッション

このげっ歯類のマラリアモデルにおける脾臓の生体顕微鏡検査の実装は、これまで技術的な考慮事項に"ブラックボックス"が原因と考えられているこの器官を通じて寄生虫の動的な経過を調査の可能性を開いた。ここでは、主要な努力は、単一および人口のレベルで異なる寄生虫の行の比較分析を可能にする定量的手法を適応する置かれた。マラリア^3,5の前にイメージングさ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
ライカTCS - SP5共焦点顕微鏡	ライカマイクロシステムズ、ハイデルベルク、ドイツ	TCS - SP5シリアル番号。 5100000419
ケタミン（Ketolar 50 mg / ml）を	ファイザー	631028
ミダゾラムの15 mg / 3ミリリットル	Normon	838193
テキサスレッドコンジュゲートさ7万MWデキストラン、	分子プローブ	D1830
フルオレセインイソチオシアネート、異性体I（FITC）	シグマ	F7250
ヘキスト33342	シグマ	H1399
ギムザ染色	シグマ	GS1	ワーキングソリューションは、蒸留水で10％です。
スーパー接着剤- 3ロックタイト	ロックタイト	9975-0880