神经元的初步培养体系的研究疱疹病毒潜伏期和活化

摘要

协议描述了一种高效和可重复性的模型系统研究单纯疱疹病毒1型（HSV-1）延迟和重新启动。该法采用同质交感神经神经元文化，并允许使用各种工具，包括RNA干扰和重组蛋白表达的病毒神经元相互作用的分子解剖。

摘要

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）建立终身潜伏感染在周边神经元。这种潜在的水库是经常激活事件的源，确保传输和临床疾病作出贡献。目前的抗病毒药物不影响潜在的水库，有没有疫苗。而裂解复制的分子细节是良好的特点，在神经元的延迟控制机制仍然是难以捉摸的。我们目前所知的延迟是来自于体内研究使用小动物模型，并已确定病毒基因的要求和免疫反应的作用是不可或缺的。然而，这是无法区分病毒神经元的关系，从更一般的感染，在活的动物免疫或支持非神经细胞介导的​​后果的具体影响。此外，动物实验是昂贵，费时，并在有限的可用选项的操作主机流程。为了克服这些限制，只有一个神经元系统的迫切需要，抄录在体内的潜伏期和活化的特点，但在同质化和无障碍方面提供了组织文化的好处。

在这里，我们提出利用体外原代培养大鼠颈上神经节（SCG）（ 图1）交感神经元模型，研究HSV-1的延迟和重新启动，适合大多数如果不是所有所需的标准。消除非神经细胞后，近同质TrkA的神经元文化与HSV-1感染中存在阿昔洛韦（ACV）的抑制裂解复制。以下阿昔洛韦去除，非生产的HSV-1感染的忠实表现出延迟接受的特点是有效建立。值得注意的是，裂解基因，蛋白质，传染性病毒成为不到，即使在没有选择的情况下，但潜伏相关转录（LAT），快递离子在神经元细胞核坚持。病毒的基因组都保持在25％神经元的平均拷贝数，可以诱导高效复制干扰与PI3激酶/ Akt信号或神经生长因子^1的简单撤出。重组HSV-1编码EGFP的融合病毒裂解蛋白Us11提供的复制功能，实时的标记从激活，很容易量化。除了化学处理，如RNA干扰或基因通过慢病毒载体传递基因的方法，可以成功地应用于系统允许是非常困难的，如果不是不可能的，在动物的机理研究。总之，在SCG基于HSV-1的延迟/激活系统提供了一个强大的，必要的工具来解开单纯疱疹病毒潜伏期和活化在神经元，在病毒学的长期难题的解决方案，可提供新的见解，新疗法的开发控制的分子机制目标t他潜伏的疱疹病毒水库。

研究方案

1。从大鼠胚胎SCG神经元的分离和培养

提供有用的背景下，为了解该协议建立的早期文学的全面讨论，上海建工神经元培养方法，包括在体外培养，涂层板，基板，无血清培养基的成分SCG的基础上，读者可以参考参考^2-4。

1. 按照NIH的指引下进行的机构动物照顾及使用委员会 （IACUC）批准了一项活动的协议，利用大鼠SCG神经元来源。
2. 前开始清扫，准备胶原蛋白和层粘连蛋白涂层的96孔组织培养皿。使用多通道移液设备，填补所有96口井含有0.66毫克/毫升鼠尾胶原溶液。立即删除的胶原蛋白，它可以回收和使用长达8解剖。在去除T他的胶原蛋白，它是非常重要的，让干井层流罩下。干燥所花费的时间取决于该井在菜的数量。例如，它通常需要大约5-10分钟。在96菜干井，但可能需要长达30 - 40分钟，如果使用较大的格式以及菜24。如果不能正确地在上海建工附件差干井。然后重复使用2微克/毫升粘连的解决方案的过程。在37°Ç在加湿的CO ₂培养箱孵育至少2小时的粘连的解决方案，直到您准备好你的神经元（步长1.14）板。
3. 商业上获得的怀孕雌性大鼠使用_二氧化碳安乐死。喷药后用70％乙醇的尸体，一个U形切口在腹部。皮肤脱皮后，第二个U形切口，通过腹部肌肉壁。子宫后，抬起腹部肌肉层是可见的。在15中取出子宫和地方厘米菜。小心地打开使用钝的剪刀，以避免损害的幼仔在子宫。每个小狗必须从它的胚胎囊释放，脐带切断，小狗擦拭干净，用70％乙醇和Kimwipes。
4. 在解剖罩工作，牺牲剪从头部，躯干，腹中E21号幼鼠。剪刀在脖子基地的目标，只是上面的肩膀。揭露节，牵制（头颈部的一面朝上）使用23政针在三个地点：一）脊髓;二）前皮肤拉起了鼻子和固定;及iii）食道/气管必须固定距离从颈部基地。
5. 寻找*定位颈动脉分叉（两届胚胎SCGS）两侧的两个上海建工。总公司是位于下方的分支。从动脉分离，由除了拉动分叉，上海建工。放入12毫升L15及媒体（0.4％，D-（+）葡萄糖补充）15毫升锥形管冰核。

*上海建工是无色半透明和不透明的，黄色的脂肪组织，围绕分岔相比。尝试以消除残余的脂肪组织和血管的多少，前收集的节。

6. 重复1.4和1.5，直到所有SCGS是从胚胎收获。
7. 轻轻离心节为1分钟600转，吸去多余的介质。
8. 悬浮在L15及媒体含有胰蛋白酶（0.25％，无EDTA）的胶原酶（1毫克/毫升）1毫升的节。孵育30分钟，在37°C，搅拌每10分钟。
9. 添加10毫升的C-媒体（1X的MEM，0.4％，D-（+）葡萄糖，L-谷氨酰胺2毫米，10％FBS）灭活的胰蛋白酶和1分钟600转的离心机。
10. 删除尽可能*胰蛋白酶/胶原酶媒体和洗的C-媒体10毫升节。离心1分钟600转。重复此步骤一次。

*残余的胶原酶将会interfe重新与胶原基质细胞附着在培养皿。

11. 取出洗净媒体和重新暂停在1毫升的C-媒体节和磨碎使用21政针5毫升注射器分离的细胞*大的团块。完成23政针的研制过程，直到可见的团块是分离的。

*小心，不要过度，磨碎，因为这会损害细胞。如果胰蛋白酶和胶原酶治疗是成功的，最大的十五岁上下周期21Ğ针的;和三个周期的23政针应该足够了。

12. 通过70微米尼龙过滤器[BD生物科学细胞过滤过滤游离神经元到50毫升锥形管，丢弃任何剩余的团块。
13. 撤回10μL的过滤细胞悬液，台盼蓝的组合，以确定活细胞的数量等分。计数积极不含细胞的数量UDE的染料使用血球。
14. 删除从96在37℃培养箱（见第1.2步）等待菜粘连的解决方案。不涸的菜，它可以用于电镀细胞的粘连后立即被删除。免除* 5000-6000 总活细胞（50 - 100μL每口井）的胶原蛋白和粘连预涂96以及组织培养皿。包括在C-媒体50毫微克/毫升的神经生长因子（NGF）。

*它采用良好的无菌组织培养技术是至关重要的，因为抗生素是从生长介质中省略。此外，还有可以是在从不同供应商的胶原蛋白的显著变异。我们不得不使用Millipore公司从鼠尾胶原跨批次一致的结果。

15. 在DIV（ 体外日 ）1，更换用于板与50μL的NBM（0.4％，D-（+）细胞的C-媒体-葡萄糖，2毫米L-谷氨酰胺的B-27补充剂含有50 ng / ml的神经生长因子， 5μM的aphidicolin和20μM的5 - 氟脲嘧啶5 - 氟-2'-脱氧。孵育5天的文化。在这一点上，trypsinizing几个井剩余的细胞计数确定幸存的抗有丝分裂剂治疗的神经元数目。通常情况下，大约1000名神经元保持在96孔板，每孔。

*真菌或细菌污染的问题通常是明显的文化在最初24小时。检查每个微生物生长取代电镀媒体前仔细。如果只有一个井的数量有限的影响，他们可以用稀释漂白液，用PBS冲洗和干燥，以进行实验，治疗。我们建议重复任何实验，甚至数量有限的油井微生物污染。如果广泛的微生物污染，在96盘观察，实验必须终止。

2。 SCG的邪教感染URES与HSV-1 Us11-EGFP和建立延迟

病毒学技术，包括基本的病毒传播，确定病毒滴度和感染（MOI），多元化的有用的背景，读者可以参考文献^5。疱疹病毒生物学的讨论，读者可以参考参考文献^6。最后，读者可以参考参考之前的例子，其他的协议，以及关于SCG神经元的α-疱疹病毒裂解感染更多的背景，并与本协议的研究延迟和重新适应的比较^7-10。

1. 在6格，添加阿昔洛韦（ACV），终浓度为100微米，在每口井*现有的媒体。例如，如果每个包含50μL，加入25μl300微米阿昔洛韦股票的。通常情况下，阿昔洛韦是增加了感染前的晚上，但也可以增加6-8个小时之前感染。

*这是前ceedingly重要的神经元在任何时候，以尽量减少不必要的物理处理。简单地拆除和更换媒体或感染病毒股票必须非常轻轻地，慢慢地做。否则，由此产生的机械应力产生不利影响后，神经元存活率。

2. 格7，感染HSV-1 ^{Us11-EGFP（11}号描述）SCG的文化在感染复数（MOI），1 -2之间（上看到以下重要意见，确定最优内政部）*。新增摊薄病毒直接以及现有的媒体。包括一个模拟感染控制和媒体缺乏阿昔洛韦裂解感染阳性对照。允许感染进行2-3小时，在37°C。

*教学语言使用病毒滴度执行斑块检测Vero细胞¹²和1.14步，每孔接种于镀金，活细胞的数量决定的计算方法。这种计算是有用的，只有在操作感，作为种子细胞总数包含污染的神经胶质细胞，成纤维细胞和神经元在一起。由于这些污染的细胞分裂反分裂剂治疗死亡，存活神经元有效的教学语言实际上是更大。从最初的起点数量为5000 - 6000活细胞，约1000神经元抗有丝分裂剂（由trypsinizing和直接细胞计数评估）后与治疗。最佳的教学语言使用感染神经细胞时，从一个病毒备料到下可以有所不同。随着每一个新的病毒的准备，我们建议测试了不同的教学语言，从1到2的范围有限。这里的目标是要找出一个具有神经细胞的活力和诱导激活事件（第3条中定义）的最大数量的结果后，至少影响。 Us11-EGFP病毒是在迅速优化的条件，特别是有帮助的，但也可以使用其他如斑块检测或定量读数tative聚合酶链反应。它可以帮助使用通过蔗糖坐垫纯化，除去杂质，降低细胞活力，虽然这是没有必要的，而不是进行例行的病毒。

3. 小心地更换新鲜的NBM含有50 ng / ml的NGF和100微米阿昔洛韦*感染媒介。

*这是极为重要的改变感染媒体时，是非常温和的。在井墙上，而不是在井底对准枪头，并允许媒体轻轻地滑入细胞。甚至从吸管媒体的快速弹射可以产生足够的力量脱离基板的轴突和导致细胞蜕去了通常作为细胞表。如果只有一个神经元的分离（20-30％）的数量有限，其后果是最小的细胞出现健康。分离的神经元有可能重新连接，随着时间的推移，然而，轴突将不再被很好地伸出d新轴突再生。虽然不是最佳的，可以进行实验，如果只有一个井数量有限的影响。如果有广泛的神经元支队（70-80％），我们不建议，包括受影响以及在实验中（S）。如果大多数井含有70-80％的独立神经元，我们建议终止实验。 虽然仍可能重新连接的神经元，它们通常会形成较大的团块。这个复杂的个体激活神经元的正确评估。我们建议重复任何分离神经元的井，观察实验，以确保激活率没有影响神经元的井坚持差。

此外， 关键是要始终处理轻轻为可能的文化 。从不必要的，突然的动作（包括反复开放和孵化室门关闭）或有力的媒体应用C的机械应力·乌尔德·妥协的文化支持HSV-1的延迟，可能导致高得令人无法接受的自发活化率在一个给定的实验能力。

4. 维持6天，在此期间，病毒会建立延迟的文化。在此期间，使用荧光显微镜监测神经健康和Us11-EGFP的表达裂解复制的一个指标。 us11-EGFP应只发现在缺乏控制阿昔洛韦治疗井，表示成功的原发性感染和生产的裂解复制。即使在病毒生产增长的情况下，神经元可能显示病变的影响。受感染的文化应密切监测和模拟感染细胞相比。

3。恢复和评估

1. 在14格，仔细取代阿昔洛韦含媒体与新媒体缺乏阿昔洛韦。如果合适的话，包括在这个时候的药理（或生物）的变量。是S余吕杏茜按照2.3所述的预防措施。
2. 超过5至6天期间，监测用荧光显微镜检测神经元处于激活的活文化。或者收集其他类型的分析样品（蛋白质，核酸，斑块检测等）。
3. 激活频率计数含有绿色荧光蛋白阳性神经元的井数计算，并表示作为样本井总数的比例。请注意，在单个EGFP的表达，不区分主激活事件和随后的感染，由于病毒传播。由于传染病的传播包含一个单一的文化，在一个良好的EGFP阳性神经元的一个或多个操作定义在这些条件下作为一个激活事件。

*多重激活事件可以发生在一个文化，如¹所述。从反应来区分从病毒传播的主要激活事件 tivati​​on，包壳抑制剂WAY-150138可以加入。阻断包壳，传染性病毒产生和传播从激活是不可能的。因此，绿色荧光蛋白信号检测中存在的方式150138反映在单个文化以及^1,13-15独立激活事件。请注意这样的150138是唯一有效的对HSV-1巴顿应变，而不是市售。作为一种替代方式150138，考虑使用以下任何：i）一个突变病毒蔓延到邻近的细胞的能力受损，可利用二）记者病毒EGFP的是从IE的启动表示，在持续存在阿昔洛韦; iii）与PAA或阿昔洛韦治疗，以防止后期的基因表达（和传染性病毒的生产），其次是针对IE基因产物的抗体免疫使用。

4。替代的方法来评估活化使用的检测

从一个单一的SCG的准备。内容】“ 从个别的，单一的实验结果应得到重复实验可以进行，只要具有独立的上海建工准备为每个重复使用一个单一的上海建工批次进行。

1. HSV-1裂解成绩单的评估。阿昔洛韦在不同的实验诱导激活的存在或没有清除，收集后的RNA所需的时间。当使用96孔培养板，我们建议每个样品至少有20口井池（大约10 ⁵个细胞的RNA样品）。另外，SCGS可以镀在较大的井（如24孔板，用4-5×10 ⁴细胞/孔）。虽然检测RNA不到20口井，小体积参与不必要的采样样本变异的结果，当然是可能的。
2. HSV-1裂解蛋白质的检测。收集裂解所需的时间后重新启动感应。加入裂解缓冲液7.5μl到10 W在96孔板的ELLS和SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。另外，病毒的蛋白质可以通过间接免疫荧光显微镜检测。最初的电镀贴装基板上的成像，如无菌盖玻片一直与聚-D-赖氨酸（0.2毫克/毫升，Sigma公司）预涂胶原蛋白和层粘连蛋白的应用前必须做（见1.10） 。
3. 传染性微粒的检测。培养上清收集后重新启动。执行斑块检测上采用系列稀释的上清Vero细胞单层。此外，牙菌斑检测可使用裂解液冻结解冻文化的，包括细胞相关的颗粒，以确定滴度。

5。代表结果

图2A说明了一个例子，1μM的曲古霉素（TSA），已知的激活^16-18诱导，被应用到SCG的潜伏感染的文化，与野生型HSV1的-EGFP Us11记者的应变。与TSA，激活达到2天之内最高的50％，并通过5天的激活高原约60％的水井。底线（“自发的”）激活是在这个实验中约10％，通常范围从10-20％用在体外系统。最大的活化水平各不相同，这取决于激活诱导利用。许多活化诱导剂，可应用于实验的时间，因为他们不干扰病毒复制与生产，但是这需要凭经验确定。其他诱导，包括任何试剂，影响神经细胞的可行性，或阻碍生产力病毒生命周期的完成，可能需要一个短暂的脉冲应用挑起激活。

而积累的-EGFP Us11在每个图2A中所描述的实验以及从延迟激活的指示，不区分是否us11-EGFP在单个神经元的信号来自一个独立的激活事件，或一个激活病毒通过文化传播。为了评估神经元的经历以及在每个独立的激活事件的数量，培养预先处理方式150138，一种化合物，特别是阻止病毒传播，防止病毒DNA基因组^13-15包壳。受感染的治疗交感神经文化路150138与TSA诱导激活。 EGFP阳性神经元的重大数字只发现在TSA的处理井相比，二甲基亚砜处理控制文化，展示一些独立激活事件发生每个文化（ 图2B）。

在我们的分析，Us11-EGFP记者表示，从内源性Us11启动^11。由于Us11是一个“真实迟到”或_γ2病毒裂解基因，病毒DNA复制，需要强大的expressi上。 图3说明了这一点，作为受损是由病毒DNA聚合酶抑制剂phosphonoacetic酸（PAA），在诱导激活PI3激酶抑制剂LY294002的文化-EGFP Us11积累的。

图1。示意图说明了一个典型的实验协议， 在体外系统培养的神经元，研究HSV-1的延迟和重新使用。1）从第E21大鼠颈上神经节（SCG）后解剖，分离神经元接种于96孔的菜和反分裂治疗剂，以消除非神经细胞。 2） 在体外 （DIV），经过6天的文化与重组的HSV-1包含EGFP的融合中存在阿昔洛韦（ACV），抗病毒药物病毒编码Us11晚期基因（EGFP HSV-1）感染阻止裂解复制。 3）第14天（14格），阿昔洛韦被删除和EGFP表达没有检测到。文化可以稳定保持在这种方式为1个月或以上，或可以添加一个测试变量，以评估其能力挑起延迟激活。变量可以是在一个特定基因的shRNA或异位表达的蛋白质的小分子化学抑制剂，针对可溶性营养因子或细胞表面蛋白的抗体，或慢病毒表达形式。然后重新监测得分实时EGFP阳性井。

图2。 TSA的重新SCG的文化HSV-1潜伏感染SCG的文化，在图1中所述。在DIV的14，阿昔洛韦被删除，并含1μM的曲古抑菌素与媒体所取代（TSA）。 （一）文化进行可视化，并取得为期5天的药物治疗后使用荧光显微镜每天。接受reactivat井的百分比在实验过程中的离子显示相比，DMSO对照处理的文化。活化比例计算出的绿色荧光蛋白阳性井96孔培养板20口井的数量。错误的横道平均标准错误。 （二）潜伏感染的文化处理TSA及抑制病毒的DNA包壳，程150138（20微克/毫升）。 EGFP的神经元的数量相比，48小时后，与药物治疗的控制与治疗DMSO和路150138。每个数据点代表的绿色荧光蛋白+神经元以及1000文化中的神经元的比例。栏显示EGFP的平均百分比+良好的神经元。

图3。 EGFP的检测中是依赖于病毒DNA复制。SCG的文化，然后用10 LY29004，称为诱导激活¹微米治疗潜伏感染。立法院（蓝色）WA诱导活化病毒DNA合成抑制剂，phophonoacetic酸，聚丙烯酸（300μg/ml，红色），这两种化合物（绿色）治疗的对照。

讨论

这主要神经文化和感染系统提供了一个简单而有效的方法来探讨HSV-1潜伏期和活化的分子机制。该系统忠实地概括公认的标志，在人类的感染和在活的动物模型中定义的延迟。当病毒潜伏在SCG的文化，传染性颗粒和病毒裂解基因产物不能被检测出来。在潜伏感染神经细胞的检测是唯一的病毒基因产物的土地增值税的成绩单，非编码核内积累。激活恰逢病毒裂解基因表达和传染性颗粒生...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂	公司	产品编号	评论
为70μm尼龙过滤器（细胞过滤器）	BD公司	352350
1X汉克的平衡盐溶液（HBSS中- / - ）	Invitrogen公司	14175	W / O CaCl 2和MgCl 2的
1X最小（MEM）的主要媒介	Invitrogen公司	11095-080
5 - 氟-2'-脱氧尿苷	西格玛	F0503	准备在1x的MEM 20毫米的股票;储存在-20°C
96以及平井底TC板	康宁	3599
阿昔洛韦	Calbiochem公司	114798	准备31毫米在DMSO股票;商店在-20℃
aphidicolin	Calbiochem公司	178273	准备在DMSO 10毫米的股票;存储在-20℃
B - 27补编	Invitrogen公司	17504-44
胶原酶	西格玛	C2674	在-20°C，准备在HBSS 10毫克/毫升股票- / - ;商店
D - （+）葡萄糖	西格玛	G6152	准备在H 2 O 40％的股票;过滤消毒及储存于4°C间
L-谷氨酰胺	Invitrogen公司	25030-081
层粘连蛋白	西格玛	L2020	准备在H 2O 1毫克/毫升的股票;快速冻结20μLaliquats及存储于-80℃;稀释至2μg/ ml的工作浓度。在无菌的H 2 O
leibovit'z L - 15家媒体	Invitrogen公司	11415
神经生长因子	哈伦实验室	BT.5017	准备在HBSS 50微克/毫升股票- / -存储在-80°C间
的Neurobasal培养基	Invitrogen公司	12348
phosphonoacetic酸（PAA）的	西格玛	P6909	准备在H 2 O 75毫克/毫升的股票;商店在-20℃
聚-D-赖氨酸氢溴酸	西格玛	P0899	准备在H 2 O 20毫克/毫升的股票;商店在-20°C
鼠尾胶原	Millipore公司	08-115	浓度变化与大量供应，储存在4°C和稀释至0.66 mg / ml的工作浓度。在无菌的H 2 O
曲古菌素A	西格玛	T8552	准备在DMSO 1毫米的股票;存储在-20℃
胰蛋白酶2.5％	Invitrogen公司	15090-04