光频域成像<em&gt;体外</em肺切除标本：获得一对一的图像病理组织学的相关性

摘要

对图像的方法体外

摘要

肺癌是癌症相关死亡的首要原因^1。鳞癌和小细胞癌通常发生在与传导性气道，而腺癌通常更多的外围设备中的位置。肺恶性肿瘤发现，早在疾病过程中可能会很困难，因为有几个缺陷：放射性分辨率，支气管镜在评估潜在的气道黏膜组织，并确定早期病理变化的限制，和小样本的大小和/或不完整的组织学活检采样。高分辨率成像方式，如光频域成像（OFDI），提供非破坏性的，大面积组织显微结构的3维视图的深度接近2毫米的实时（ 图^1）2-6。对外直接投资中使用的各种应用，包括评估冠状动脉粥样硬化^6,7和食管肠上皮化生和不典型增生支气管镜OCT /对外直接投资已被证明是一个安全的工具，用于评估肺的气道^11-23（ 动画 ） 在体内成像。 OCT已在肺部气道^{16,23 17,22}实质的动物模型，并在人体内气道^14,15评估。 OCT成像的正常气道已经证明气道的层次和肺泡附件的可视化和不典型增生病变的评价，已发现有用的区分等级的发育不良，支气管粘膜^{11,12,20,21。}对外直接投资的成像支气管粘膜已被证明在很短的支气管段（0.8厘米^）18。此外，体积对外直接投资跨越多个气道代在猪和人的肺在体内的气道已^19。支气管OCT /对外直接投资通常采用薄，弹性的导管，这是与标准bronchos兼容科皮克接入端口。另外，OCT和对外直接投资基于针状探头最近已被开发，其可以用于图像区域以外的气道壁的肺或胸膜表面^17的 。

没有研究，虽然OCT /对外直接投资已使用并证明是可行的， 在体内肺成像，精确匹配的一对对外直接投资：组织学已经完成。因此，具体的各种肺部病变的成像的标准还没有被开发。 在体内组织病理学同行只支气管镜活检小片段，这是难以与大对外直接投资的数据集。此外，他们还没有登记需要大容量的对外直接投资提供全面的组织学。因此，具体的影像学特征的肺部病理不能在体内设置。一对精确匹配，对外直接投资和组织学的相关性准确评估是非常重要的功能，看到在O外商直接投资对组织学为金标准，以获得特定的图像解释标准为肺部肿瘤和其他肺部病变。一旦具体的成像标准已经制定，验证体外一对一的一个组织学，标准可能在体内成像研究。在这里，我们提出了一个精确的，一对一之间的相关性在离体肺切除标本的高分辨率光学成像和组织学方法。在本手稿中，我们描述了所使用的技术，以配合对外直接投资的组织学图像。然而，这种方法是不特定的对外直接投资，任何光学成像技术可用于获得组织学类型的注册图像。我们进行了气道为中心，用专门的定制支气管镜2.4法国的对外直接投资（直径0.8mm）的导管。组织样品组织染料标记，对外直接投资与组织学可见。仔细取向程序被用来精确地关联伊马晋和组织取样的位置。在这个手稿的技术被用来进行体积对外直接投资的第一个示范的相互关系，以组织为基础的诊断评估肺部病理^24。这种直接，有效的方法也可以推广到其他类型的组织提供精确的成像需要，以确定正常和病变组织的精细影像学特征组织学的​​相关性。

研究方案

1。成像系统

对外直接投资的技术细节已被描述以前^4-6。周对外直接投资是在25和100之间的每秒帧数和每圆形的横截面图像在512和2048之间的轴向深度公司的成像速度进行。自定义2.4神父（直径为0.8 mm）本研究中所用的螺旋扫描导管被设计操作通过标准气管镜的进入口的。导管包括用于将光聚焦到支气管壁和一个一次性使用的外护套的内光核心。导管主体在成像过程中保持静止，而内芯是在25和100赫兹和翻译在拉回介于1.25和5毫米/秒的速度之间的速率旋转。在组织的系统的时间是6毫米的轴向分辨率，并提供了一种图像范围的深度为7.3毫米的^4-6。导管为基础的对外直接投资在这项研究中，复制在体内支气管镜对外直接投资（FIgure 1）。然而，这个协议也可以被施加到成像与一个台式光学系统（ 图3和4）。

2。成像系统设置

1. 打开成像系统
2. 设置和记录摄像参数（​​旋转速度，拉回速度，图像采集速率，等）。对于对外直接投资在这项研究中使用的成像系统，在10-50 fps的图像，获得。
3. 将导管旋转交界处，回调设备。
4. 旋转导管和检查图像质量。调整系统的调整和偏移根据需要。

3。组织制备

1. 将一个桌面上的台式和一组肺标本垫一次性吸水垫。
2. 如果成像手术前病人体内样本，请务必咨询病理科，以确保所有切缘（支气管，血管和实质的利润）进行评估，记录，和/或删除的病理logist。
3. 确定切除标本在肺门支气管气道进入。删除任何明显的气道黏液内使用注射器孔。如果有必要，将一个长的塑料管段的注射器吸孔气道中的深。
4. 触诊的检体的外表面，以确定病变景点。
5. 使用细金属探测器，小心翼翼地浏览支气管树，直到附近的病变的利益。
6. 打开气道沿探头，直至病变的利益是看到或摸到下呼吸道粘膜。
7. 小心地取出任何气道黏膜的血液或粘液，用棉签覆盖病变。
8. 将对外直接投资导管上方的气道粘膜并获得的图像，以确认病变相关的气道粘膜并识别感兴趣的组织学相关的高品质的摄像区域。

4。组织标记

<李的在步骤3.8以前的影像学表现的基础上气道的兴趣选择区域。
1. 选择两个点上的组织，沿着所希望的行的成像。点可能是平行于要么的长度（ 图2）或周向（ 图3）方面的气道，这取决于所需的结果。空间点相距不超过1.5厘米，使组织的部分可能适合在一个组织学块进行处理。如果一个组织长度> 1.5厘米，然后分割成多个长1.5厘米签署地区的利益创建多个匹配的影像学检查：组织学对组织长度。
2. 浸细笔尖开放的孔针（ 即 25号7/8“长）标记染料（的三角生物医学科学，达勒姆，北卡罗莱纳州）的组织。
3. 小心地擦去多余的墨水用纱​​布关闭针的外部，仅在针孔离开组织标记油墨。
4. 在气道黏膜组织垂直穿刺选择点沿线的成像。
5. 重复步骤3.3至3.5的第二个点上呼吸道粘膜。
6. 如果墨水运行在距穿刺部位的粘膜表面，使用棉签小心地将多余的油墨。
7. 取出粘液或血液的表面上的气道粘膜用棉头，如果存在的话。
8. 如果圆周放置的墨点内的气道，它是有用的针开放双方扁平化的气道组织中的摄像视场（ 图3a）。

5。影像组织

1. 将在每个墨水标记和图像，以确保标记是可见对外直接投资的对外直接投资导管。商标应显示为焦距与上覆高度散射粒子和快速的信号的衰减，这对应于在穿刺部位（ 图3b，图4a，图4g的墨粒子的基本结构的组织内的中断）。
2. 如果墨水标记（s）是不可见的对外直接投资，重复步骤4.3至4.7为不可见的标记。如果墨痕可见的对外直接投资，继续执行步骤5.3。
3. 平行的导管放置使得导管光学标记（ 图2b）超出第一墨水覆盖在组织上的气道粘膜表面的两个油墨标记。与一个轻量级的对象的导管的近端锚定和固定的前端可以帮助减少运动伪影。
4. 继续收集的对外直接投资回落。
5. 对外直接投资的回落图像，以确保两个墨痕中是可见的影像，以检查运动伪影（ 图3和图4）。如果标记是不可见的，重复步骤5.1至5.4。

6。收集和处理组织

1. 将一个绿色的墨点（的三角生物医学科学，达勒姆，NC）的气道粘膜组织定位成像扫描开始的，0.3厘米距离日E Ink的标志，首先出现在成像回调（ 图2c）。
2. 删除组织涵盖了两个黑色的墨痕和绿色墨水标记。修剪组织，以符合标准的组织学处理盒。如果切割新鲜组织是困难的，那么组织可以固定前组织学检查，以消除组织。
3. 将组织在组织学处理盒和固定在10％福尔马林浸泡至少48小时。
4. 过程组织在一个组织的处理器，可通过任何组织学部门。
5. 嵌入石蜡组织中，使得切口部将是平行的两个气道表面上的黑色墨痕。
6. 使用组织切片面对的石蜡块，直到墨水标记是可见的，或整个组织的部分是可见的，以先到者为准。
7. 一旦这两个黑色墨水标记是可见的，切成5微米厚的部分，并安装到载玻片上。
8. 继续削减和安装5微米厚的部分50微米，直到黑色的墨痕不再是可见的或组织结束，以先到者为准。
9. 按照标准的苏木精伊红（H＆E）染色染色的协议和盖玻片幻灯片。

7。影像处理

如果图像获得与台式扫描仪或其他扫描技术，在一个单一的横截面的图像是可见的两个墨痕，然后将图像可以直接与相应的组织学相关。如果被收购的螺旋扫描导管立体数据集，图像将需要重新插值，使一个单一的2D图像一分为二的两个墨痕与组织学的相关性。这可以通过使用ImageJ或其他图像处理软件。油墨在某些情况下，可能无法轻易地可见的，在这种情况下，相邻的分段/幻灯片应检查。

结果

黑色的墨痕应该是在1 - 1.5厘米之间分开，以指示感兴趣的摄像区域。绿色油墨标记应放置在成像扫描开始之前，第一黑色墨水标记定位的检体（ 图2和图3a）。组织墨痕应该是可见的都对外直接投资成像和组织学（ 图3和4）。 （ 图3）在正常猪和人的气道（ 图4），典型的气道分层应该可见。作为薄的上皮细胞（E）是可见的，中度致密，均匀的层，在管腔方面的气道的信号。固有层由有组织的信号强烈信号不良的组织，如信号激烈的结缔组织包括弹性蛋白和胶原致发光（EL）的固有层（LP）的各种部件，对应信号不良的唾液型腺组织（G ）。信号有偶尔可见的差管（D）穿越呼吸ratory与支气管管腔上皮细胞连接。平滑肌出现不连续的，中间穿插平滑肌分册和是无法识别对外直接投资。的ħ＆Ê和三色渍，气道压条可以可视化（ 图3C，3D，3F，3克，4B，4C，4E，及4楼 ），在那里上三色的表面的致密的弹性和胶原组织出现深蓝色和的底层平滑肌肉污渍红色（SM）。软骨环（C）出现信号不佳的月牙状结构具有明确的界限，在猪呼吸道重叠和不重叠在人类呼吸道。周围的软骨环的软骨膜出现一层薄薄的信号激烈的组织，涵盖了信号不良的软骨环。在人类呼吸道的圆周（ 图4g和4h），肺泡附件（A）是显示为薄，信号激烈格子状肺泡壁与信号无效肺泡腔。固有层内的血管位是V，可见的信号无效的直线或圆弧结构底层的阴影轻度伪影（箭头）。

图1。猪呼吸道对外直接投资。 在体内获得的图像从猪气道机械通气。 （一）ODFI近端气道的横截面。 （二）对外直接投资远端气道的横截面。 （三）ODFI纵向节近端气道，高放大倍率的图像面板e以红色突出显示的区域。 （四）对外直接投资的纵向部分的远端气道，在更高的放大倍率图像的面板e绿色突出显示的区域。 （五）ODFI纵截面的气道从近端到远端（左到右）。导管的直径为0.8毫米的刻度代表0.5毫米为单位递增。虽然气道壁的不同层和肺泡附件是可辨别的对外直接投资图像，它是难以精确地解释的解剖合作rrelate的对外直接投资的信号没有直接登记注册的组织学。 E：上皮，LP：SM：固有层，黏膜下层，C：软骨，肺泡附件。

图2。 （一） 组织标记的猪呼吸道。打开气道腔面有两个黑色的墨痕，平行放置的纵向方面的气道，1.5厘米。 （二）对外直接投资的导管放在两个黑色墨水标记包括两个标志在对外直接投资的回调。 （三）气道与额外的绿色油墨标记定位在试样上的摄像扫描的开始。

图3。猪呼吸道的对外直接投资和组织学表现出精确的对应有关使用组织标记。（一）开放气道腔面有两个黑色的墨痕，平行放置的圆周方面的气道。引脚用于进一步开放气道（箭头）。 （二）对外直接投资的猪呼吸道都墨痕（星号），（三）正是相关组织学与H＆E染色（星号：黑色墨迹，可见上呼吸道上皮细胞）及（d）相关的三色染色可见。比例尺：2毫米。 （五）对外直接投资（F）对应的组织学与H＆E染色及（g）相关的三色染色图像的放大视图。 E：呼吸道上皮细胞，EL：致密的胶原和弹性组织，SM：平滑肌，C：软骨环（组织学的神器已经导致人工分离的软骨环），G：涎腺组织，D：进入涎腺导管上皮细胞。比例尺：250微米。 点击这里查看大图 。

图4。对外直接投资和组织学人的呼吸道表现出精确的相关组织标记。（一）对外直接投资的人近端气道都墨痕可见（星号）。 （二）正相关的组织学用黑墨水与H＆E染色，标志着明显的呼吸道上皮细胞（星号）及（c）相关的三色染色。比例尺：2毫米。 （四）对外直接投资的图像放大视图及（e）相应的组织学与H＆E（F）三色染色。比例尺为250μm。 E：呼吸道上皮细胞，LP：固有层，G：涎腺组织，C：软骨环，邮编：软骨膜。在人类气道，典型的分层是可见的。疏松结缔组织内，有穿插红染色平滑肌（SM，板C和F分册），不形成连续的频带，从而对外直接投资作为一个独立的层中是不可见的。 （七）对外直接投资的人远端气道及（h）正是相关的H＆E组织学与黑色的墨痕，可见上呼吸道上皮细胞（星号）。比例尺：2毫米。肺泡附件（A）是作为信号激烈格​​子状肺泡壁与信号无效肺泡腔可见。固有层内的血管空间也可见作为信号空隙结构基本轻微的阴影（箭头）。

讨论

早期肺部恶性肿瘤的评估可以非常具有挑战性，由于缺乏症状，无法可视化早期肿瘤影像学或支气管镜。对外直接投资提供了组织学的分辨率，大面积组织微结构的三维视图实时^2-6附近。对外直接投资支气管内已被证明在作为一种安全的技术，可用于获得高分辨率的体积数据集，在很长的气道段在肺呼吸道^11-13（ 动画 ）患者。但是，只有很小的活检获得病理同行体内设置，没有提供足够的相关性肺部病理成像标准的发展对外直接投资的。为了准确地评估肺部成像中看到的对外直接投资的特点，它是必不可少的组织学的相关性，以获得精确匹配的图像。我们提出了一个简单而有效的方法精确，以邻对外直接投资与组织学网元之间的相关性气道成像的体外肺切除的标本，这是适用于几乎所有的体外组织类型。一旦成像标准已经建立了体外与匹配-酮组织学，这些标准可以然后被施加到体内成像。

组织染料用于标记的感兴趣区域成像清晰可见，在对外直接投资和组织学。通过使用简单的技术方向的组织，墨痕，可能会允许对外直接投资的功能和组织学的研究结果比较，以确定可识别的成像特点，组织病理成像和组织学相关。该技术是廉价和实用的，从而使它在许多光学成像应用有用。

在体内设置，如激光标记的方法，可以使用组织取向^25。然而，T他体积小的支气管活检仍然是在体内研究制定具体的成像标准的肺部病理的一个限制因素。虽然体外研究可以作为适当的替代品在体内成像，有一定的局限性。 离体肺标本不充气往往显示外科手术引起的肺不张，改变了正常的肺泡结构的外观。在技​​术上具有挑战性，因为大多数外科手术肺组织病理冰冻切片后收到的评价在此期间，胸膜表面被破坏，干扰标本通货膨胀的充气手术切除的肺组织与组织，组织学相关的标记。非病理肺不张是没有看到在体内设置一个工件，从而此限制将不相关的体内肺成像。此外，由于缺乏可以使血管内的血液在体外标本难以distingu从其他信号无效结构十岁上下的血管结构。在体内设置，多普勒OCT / ^{26日至28日}对外直接投资的结构OCT /对外直接投资的增加将有助于识别船只。

运动伪影可以看出，他们是不存在的体外体内 。这可能是潜在的问题，在标准的OCT系统的采集速率较慢。然而，对外直接投资的系统是目前快速的帧速率> 200帧^29-31。因此，预计不会运动伪影，将是一个重大的问题。前在体内成像OCT和对外直接投资研究的成功证明了精细成像功能的可视化^{14,15,18,19。}

在这项研究中，我们已经证明了体积对外直接投资的相互关系，以评估肺部病理组织为基础的诊断。描述的步骤，目的是提供精确匹配的组织学，用作金STANDA路的对外直接投资的图像解释。

一旦特定的成像条件，经肺病理已开发和验证，与匹配的一对1组织学的体外的准则，然后可以被应用到后续的体内成像研究与使用支气管活检作为金标准评估的摄像功能可见一斑。肺切除标本的应用程序，但这种技术可以应用到几乎所有的组织类型，以提供精确的成像需要确定正常和病理组织的精细影像学特征组织学的​​相关性。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
组织标记染料	三角生物医学	TMD，TMD-BK-G