D&#39;imagerie optique du domaine de fréquence<em&gt; Ex vivo</em&gt; Les spécimens résection pulmonaire: Obtention One to One image à l&#39;histopathologie Corrélation

Résumé

Procédé pour l'image Ex vivo Pièces de résection pulmonaire avec optique dans le domaine fréquentiel d'imagerie (investissements à l'étranger) et d'obtenir des corrélations précises à l'histologie est décrite, qui est essentielle à l'élaboration de critères spécifiques d'interprétation investissements à l'étranger pour la pathologie pulmonaire. Cette méthode est applicable à d'autres types de tissus et les techniques d'imagerie pour obtenir des images précises à la corrélation d'histologie pour l'interprétation des images précises et d'évaluation. Critères d'imagerie établies avec cette technique serait alors applicable à l'évaluation de l'image à l'avenir In vivo Études.

Résumé

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths¹. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)^2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis^6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia^6,8-10.

Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways^11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways^16,23 and parenchyma^17,22 of animal models and in vivo human airway^14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa^11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)¹⁸. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described¹⁹. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface¹⁷.

While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology²⁴. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Protocole

1. Système d'imagerie

Les détails techniques de ces investissements ont été décrits précédemment ^4-6. Circonférentielle investissements étaient menés à des vitesses d'imagerie entre 25 et 100 images par seconde et entre 512 et 2.048 profils de profondeur axiale par circulaire en coupe transversale d'image. Cathéters mesure 2,4 Fr (0,8 mm de diamètre) à balayage hélicoïdal utilisées dans cette étude ont été conçus pour fonctionner à travers l'orifice d'accès bronchoscopes standard. Les cathéters consistait en un noyau interne optique pour focaliser la lumière sur la paroi bronchique et une gaine externe à usage unique. Le corps de cathéter est resté immobile pendant l'imagerie tandis que le noyau interne est mis en rotation à une vitesse comprise entre 25 et 100 Hz et traduite à une vitesse de retrait compris entre 1,25 et 5 mm / sec. La résolution axiale du système est de 6 mm dans les tissus et fourni une profondeur d'image allant de 7,3 mm ^4-6. À base de cathéter investissements étaient effectués dans cette étude se répliquer in vivo bronchoscopique investissements à l'étranger (Figure 1). Cependant, ce protocole peut également être appliquée à l'imagerie d'un système de paillasse optique (Figure 3 et 4).

2. Système d'imagerie Set-up

1. Allumez le système d'imagerie
2. Régler et enregistrer les paramètres d'imagerie (vitesse de rotation, vitesse de retrait, le taux d'acquisition de l'image, etc.) Pour le système d'imagerie investissements à l'étranger utilisé dans cette étude, les images ont été obtenues à 10-50 fps.
3. Fixez cathéter à la jonction rotative et un dispositif de retrait.
4. Spin cathéter et vérifier la qualité d'image. Régler l'alignement du système et de compenser au besoin.

3. Préparation des tissus

1. Placez une table tampon absorbant jetable sur la paillasse et le spécimen du poumon jeu sur le clavier.
2. Si un spécimen d'imagerie chirurgicale ex vivo à partir d'un patient, assurez-vous de consulter le service de pathologie afin de s'assurer que toutes les marges de résection (marges bronchiques, vasculaires et parenchymateuses) ont été évalués, documentés et / ou supprimés par un pathologue.
3. Identifier l'bronchique entrer dans la pièce d'exérèse au niveau du hile. Retirez tout le mucus visible dans les voies respiratoires à l'aide d'une seringue portait. Si nécessaire, attacher un segment plus long tube de plastique sur la seringue portait à l'aspiration plus profonde dans les voies respiratoires.
4. Palper la surface extérieure de l'échantillon afin d'identifier la lésion de l'intérêt.
5. En utilisant une sonde métallique fine, délicatement naviguer dans l'arbre bronchique jusqu'à proximité de la lésion d'intérêt.
6. Ouvrir les voies aériennes le long de la sonde jusqu'à ce que la lésion d'intérêt est visible ou palpable sous la muqueuse des voies aériennes.
7. Retirer soigneusement toute trace de sang ou de mucus de la muqueuse des voies aériennes recouvrant la lésion avec un coton-tige.
8. Placer le cathéter au-dessus de ces investissements la muqueuse des voies aériennes et d'obtenir une image de confirmer la lésion est sous-jacente à la muqueuse des voies aériennes et d'identifier une région de formation d'image de haute qualité pour la corrélation d'intérêts histologie.

4. Marquage des tissus

1. Sélectionnez la région d'intérêt dans les voies respiratoires en fonction des résultats d'imagerie antérieurs à l'étape 3.8.
2. Choisir deux points sur le tissu le long de la ligne souhaitée d'imagerie. Les points peuvent être parallèles soit à la direction longitudinale (Figure 2) ou périphérique (figure 3) Aspect de la voie aérienne, en fonction des résultats souhaités. Points d'espace pas plus de 1,5 cm en dehors de sorte que la portion de tissu peut tenir dans un bloc d'histologie pour le traitement. Si une longueur de tissu de> 1,5 cm est nécessaire, puis diviser la longueur du tissu dans de multiples 1,5 cm de long encrés régions d'intérêt de créer plusieurs images appariés: paires histologie.
3. Trempez une amende pencher ouvert aiguille creuse (c.-à calibre 25 7/8 "de long) dans le tissu marquage colorant (Triangle sciences biomédicales, Durham, Caroline du Nord).
4. Essuyez soigneusement l'excès d'encre sur l'extérieur de l'aiguille avec de la gaze, laissant l'encre uniquement au marquage du tissu à l'intérieur de l'aiguille alésage.
5. Piquer la perpendiculaire du tissu de la muqueuse des voies aériennes à l'choisie point le long de la ligne de formation d'image.
6. Répéter les étapes de 3,3 à 3,5 pour le second point sur la muqueuse des voies aériennes.
7. Si l'encre déborde de la surface muqueuse loin du site de ponction, utilisez un coton-tige pour enlever soigneusement l'excès d'encre.
8. Éliminer le mucus ou de sang sur la surface de la muqueuse des voies aériennes avec un coton-tige, si elle est présente.
9. Si les points d'encre sont placées à l'intérieur de la circonférence d'une voie aérienne, il est utile de la broche ouverte des deux côtés de la voie aérienne pour aplatir le tissu dans le domaine de l'imagerie (figure 3a).

5. Tissu d'imagerie

1. Placer le cathéter investissements à l'étranger au cours de chaque marque à l'encre et l'image de s'assurer que les marques sont visibles sur ces investissements. Marques doivent apparaître comme des perturbations de liaison au sein de la structure de tissu recouvrant avec des particules de dispersion fortement sous-jacent et d'atténuation de signal rapide, ce qui correspond à des particules d'encre à l'intérieur du site de ponction (figure 3b, la figure 4a, la figure 4g ).
2. Si de l'encre marque (s) ne sont pas visibles sur les investissements à l'étranger, répétez les étapes 4,3 à 4,7 pour les marques non visibles. Si les marques d'encre sont visibles à ces investissements, passez à l'étape 5.3.
3. Placer le cathéter en parallèle aux deux marques d'encre sur la surface des voies respiratoires telles que les muqueuses optique cathéter recouvrir le tissu au-delà de la première marque d'encre (Figure 2b). L'ancrage de l'extrémité proximale du cathéter avec un objet léger et fixer l'extrémité distale peut aider à réduire les artéfacts de mouvement.
4. Procéder au prélèvement d'un recul investissements à l'étranger.
5. Voir les images recul investissements à l'étranger pour s'assurer que les deux marques d'encre sont visibles en imagerie et pour vérifier les artefacts de mouvement (Figure 3 et Figure 4). Si les marques ne sont pas visibles, répétez les étapes 5,1 à 5,4.

6. Collecte et traitement des tissus

1. Placez une encre verte dot (Triangle sciences biomédicales, Durham, Caroline du Nord) sur le tissu des muqueuses des voies respiratoires afin d'orienter le début de l'analyse d'imagerie, de 0,3 cm de emarque à l'encre électronique qui est apparu d'abord dans le repli d'imagerie (figure 2c).
2. Éliminer les tissus entourant les deux marques d'encre noire et l'encre verte marque. Coupez le tissu pour tenir dans une cassette de traitement histologie standard. Si l'on coupe le tissu frais est difficile, puis le tissu peut être fixé avant d'enlever le tissu pour l'histologie.
3. Tissus place dans une cassette de traitement de l'histologie et la solution formol à 10% pendant au moins 48 heures.
4. Tissus processus dans un processeur tissu, disponible dans n'importe quel département de l'histologie.
5. Incorporer le tissu dans de la paraffine de sorte que les sections découpées sont parallèles aux deux marques d'encre noire sur la surface des voies respiratoires.
6. Utilisez un microtome tissu pour faire face au bloc de paraffine jusqu'à ce que soit une marque d'encre est visible ou la coupe de tissu est entièrement visible, selon la première éventualité.
7. Une fois que les deux marques d'encre noire sont visibles, coupez une section 5 um d'épaisseur et monter sur une lame de verre.
8. Continuer à découper et à monter 5 um sections épaisses chaque50 pm jusqu'à ce que les marques d'encre noire ne sont plus visibles ou les extrémités du tissu, selon la première éventualité.
9. Suivez norme hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration des protocoles pour tacher et diapositives lamelle.

7. Traitement d'image

Si les images ont été acquises avec un scanner de table, ou autre technique de balayage où les deux marques d'encre sont visibles dans une seule image en coupe transversale, l'image peut être directement corrélée avec l'histologie correspondante. Si volumes de données ont été acquises avec un cathéter à balayage hélicoïdal, les images devront être ré-interpolée de sorte qu'une seule image 2D divise les deux marques d'encre pour la corrélation avec l'histologie. Cela peut être accompli en utilisant ImageJ ou un autre logiciel de traitement d'image. Dans certains cas, l'encre peut ne pas être visible dans ce cas, les sections adjacentes / diapositives doivent être examinés.

Résultats

Les marques d'encre noire doit être comprise entre 1 à 1,5 cm de distance pour indiquer la zone d'exposition d'intérêt. La marque à l'encre verte doit être placé au début de la numérisation d'imagerie, avant que la marque d'encre noire premier à orienter l'échantillon (Figure 2 et Figure 3a). Marques d'encre de tissus devraient être visibles à la fois sur l'imagerie et l'histologie investissements à l'étranger (figure 3 et 4). Chez les porcs normaux (Figure 3) et les voies respiratoires de l'homme (figure 4), marcottage aérien typique devrait être visible. L'épithélium (E) est visible comme une fine modérément signaler dense, couche homogène à l'aspect luminal de la voie aérienne. La lamina propria comprend organisée signal intense pour signal faible tissu, correspondant à différentes composantes de la lame (LP) propria comme signal intense des tissus conjonctifs, notamment le collagène et l'élastine (EL), et un signal de mauvaise salivaire de type tissu glandulaire (G ). Il ya parfois des conduits de signaux visibles pauvres (D) qui traversent la respiépithélium ratoire à se connecter avec la lumière bronchique. Muscle lisse apparaît comme discontinu, entrecoupé fascicules musculaires lisses et n'est donc pas identifiable dans ces investissements. Sur le H & E et les taches trichrome, la superposition des voies respiratoires peuvent être visualisées (figure 3c, 3d, 3f, 3g, 4b, 4c, 4e et 4f), où le trichrome les superficielles denses tissus élastiques et de collagène apparaît d'un bleu profond et le muscle lisse sous-jacent taches rouges (SM). Anneaux cartilagineux (C) apparaissent comme des signaux pauvres en forme de croissant de structures avec des limites bien définies, qui se chevauchent dans les voies respiratoires des porcs et ne se chevauchent pas dans les voies respiratoires de l'homme. Le périchondre du cartilage entourant les anneaux se présente comme une couche mince de tissu signal intense englobant les cycles de signaux de cartilage pauvres. Dans les voies respiratoires périphérique humain (figure 4g et 4h), les pièces jointes alvéolaires (A) sont visibles sous forme de fines, de signaux intenses en forme de treillis avec des parois alvéolaires espaces vides de signal alvéolaires. Espaces vasculaires au sein de la lamina propria sont visible que des structures vides de signal linéaire ou circulaire avec une légère sous-jacente artefact observation (flèches).

Figure 1. Investissements à l'étranger des voies respiratoires du porc. En images in vivo obtenus à partir des voies aériennes porcine sous ventilation mécanique. (A) ODFI section de voie respiratoire proximale. (B) ces investissements section de voie respiratoire distale. (C) ODFI coupe longitudinale des voies aériennes proximales, plus fort grossissement de l'image e panneau dans la région en surbrillance rouge. (D) coupe longitudinale d'investissements à l'étranger des voies aériennes distales, plus fort grossissement de l'image e panneau dans la région surlignée en vert. (E) ODFI coupe longitudinale de voies aériennes de proximal à distal (gauche à droite). Diamètre du cathéter est de 0,8 mm et marques de graduation représentent incréments de 0,5 mm. Bien que les différentes couches de la paroi bronchique et les pièces jointes alvéolaires sont perceptibles dans les images investissements à l'étranger, il est difficile d'interpréter précisément le co anatomiquerrelate des signaux investissements à l'étranger sans histologie directement enregistré. e: épithélium, lp: lamina propria, sm: sous-muqueuse, c: cartilage, un: les pièces jointes alvéolaires.

Figure 2. Tissu marquage des voies respiratoires du porc. (A) Ouverture des voies aériennes avec deux marques à l'encre noire sur la surface luminale placée parallèlement à l'aspect longitudinal des voies respiratoires, 1,5 cm de distance. (B) investissements à l'étranger cathéter placé plus de deux encre noire marque d'inclure les deux marques au sein du recul investissements à l'étranger. (C) des voies aériennes avec une marque d'encre verte supplémentaire pour orienter le début du balayage d'imagerie sur le spécimen.

Figure 3. Investissements à l'étranger et l'histologie des voies respiratoires du porc démontrant cor préciserelation en utilisant des tissus de marquage. (a) Ouvert voies aériennes avec deux marques à l'encre noire sur la surface luminale placée parallèlement à l'aspect périphérique de la voie aérienne. Les broches sont utilisés pour ouvrir davantage la voie aérienne (flèches). (B) investissements à l'étranger des voies respiratoires du porc à la fois avec l'encre marque visible (astérisques) à (c) teinté histologie précisément, corrélée avec H & E (astérisques: encre noire marque visible sur l'épithélium respiratoire) et (d) corrélation trichrome. Barre d'échelle: 2 mm. (E) vue fort grossissement de l'image de ces investissements avec (f) l'histologie correspondante colorées avec H & E et (g) corrélée trichrome. E: épithélium respiratoire, EL: collagène dense et tissus élastiques, SM: muscle lisse, C: anneaux cartilagineux (artefact histologique a entraîné la séparation artificielle des anneaux de cartilage), G: tissu de la glande salivaire, D: canal salivaire entrer épithélium. Barre d'échelle: 250 um. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4. Investissements à l'étranger et l'histologie des voies aériennes humaines démontrant une corrélation précise en utilisant des tissus de marquage. (A) investissements à l'étranger des voies aériennes proximales de l'homme à la fois avec l'encre marque visible (astérisques). (B) teinté histologie précisément en corrélation avec H & E à l'encre noire marque visible sur l'épithélium respiratoire (astérisques) et (c) corrélée trichrome. Barre d'échelle: 2 mm. (D) vue fort grossissement de l'image de ces investissements et (e) l'histologie correspondante colorées avec H & E et (f) trichrome. Barre d'échelle: 250 um. E: épithélium respiratoire, LP: lamina propria, G: tissu de la glande salivaire, C: anneaux de cartilage, PC: périchondre. Dans les voies respiratoires de l'homme, la stratification typique est visible. Dans le tissu conjonctif lâche, il fascicules sont entrecoupées de taches rouge-muscle lisse (SM, panneaux c et f), Qui ne forment pas une bande continue, et donc ne sont pas visibles dans une couche distincte de ces investissements. (G) de ces investissements voies aériennes humaines et distale (h) précisément corrélée H & E histologie avec des marques visibles d'encre noire sur l'épithélium respiratoire (astérisque). Barre d'échelle: 2 mm. Accessoires alvéolaires (A) sont visibles sous forme de signaux intenses en forme de treillis parois alvéolaires avec des espaces vides de signal alvéolaires. Espaces vasculaires au sein de la lamina propria sont également visibles en tant que signal de vide-structures avec des ombres légères sous-jacent (flèches).

Discussion

Évaluation des tumeurs malignes du poumon précoce peut être extrêmement difficile en raison de l'absence de symptômes et de l'incapacité à visualiser les premières transformations néoplasiques ou radiologiquement bronchoscopie. Investissements à l'étranger fournit près résolution histologique, grand espace en 3 dimensions vue de la microstructure des tissus en temps réel ^2-6. Endobronchique investissements à l'étranger a été démontrée chez les patients comme une technique sûre qui peut être utilisé pour obtenir une haute résolution volumes de données sur les segments des voies aériennes longues voies aériennes pulmonaires ^11-13 (Animation). Cependant, seules les petites biopsies sont obtenues comme homologues histopathologiques dans le cadre de vivo, qui ne fournissent pas de corrélats nécessaires pour ces investissements pour le développement de critères d'imagerie pour la pathologie pulmonaire. Afin d'évaluer avec précision les caractéristiques investissements à l'étranger vus en imagerie pulmonaire, il est essentiel d'obtenir une image parfaitement adaptés aux corrélations histologiques. Nous présentons une méthode simple et efficace pour précision, l'un pour ocorrélation entre les investissements à l'étranger ne et l'histologie appliquée à l'imagerie aérienne de spécimens ex vivo résection pulmonaire, qui est applicable à presque n'importe quel type de tissu in vivo ex. Une fois les critères d'imagerie ont été créés ex vivo avec correspondance un-à-un histologie, ces critères peuvent ensuite être appliqués à l'imagerie in vivo.

Le colorant du tissu utilisé pour marquer la zone d'exposition d'intérêt est clairement visible dans les deux investissements à l'étranger et l'histologie. À l'aide de techniques simples pour orienter le tissu, marques d'encre peut être corrélée à la fois dans l'imagerie et l'histologie pour permettre une à une comparaison des caractéristiques et des résultats histologiques investissements directs afin de déterminer les caractéristiques d'imagerie identifiables de la pathologie des tissus. La technique est peu coûteux et pratique, ce qui le rend utile dans de nombreuses applications d'imagerie optique.

Dans le cadre de vivo, des méthodes telles que le marquage au laser peut être utilisé pour ²⁵ l'orientation du tissu. Toutefois, til petite taille de la biopsie bronchique est toujours un facteur limitant dans l'utilisation des études in vivo pour élaborer des critères spécifiques pour l'imagerie pathologie pulmonaire. Bien que les études ex vivo servir d'alternative adéquate pour l'imagerie in vivo, il existe certaines limites. Ex échantillons pulmonaires in vivo sont dégonflé et affichent souvent une atélectasie chirurgicalement induite, ce qui modifie l'apparence des structures alvéolaires normales. Gonfler le tissu pulmonaire réséqué chirurgicalement avec marquage de tissu pour la corrélation histologique est techniquement difficile car la plupart des spécimens pulmonaires chirurgicales sont reçus après évaluation section de pathologie congelés au cours de laquelle la surface pleurale est perturbé, interférant avec l'inflation spécimen. Non pathologique atélectasie n'est pas un artefact vu dans le cadre de vivo, donc cette limitation ne serait pas pertinente pour l'imagerie pulmonaire in vivo. En outre, le manque de sang dans les vaisseaux dans des échantillons ex vivo pourrait rendre difficile la distinguish structures vasculaires des autres structures vides de signal. Dans le cadre de vivo, l'ajout de Doppler OCT / investissements à l'étranger à ^26-28 structurelle OCT / investissements à l'étranger aiderait à l'identification des navires.

Les artefacts de mouvement peuvent être observés in vivo où ils ne sont pas ex vivo présente. Cela pourrait être potentiellement problématique dans la norme des systèmes OCT avec des vitesses d'acquisition plus lente. Cependant, les taux de rafraîchissement rapides des systèmes investissements à l'étranger sont actuellement> 200 fps ^29-31. Ainsi, il n'est pas prévu que artefact de mouvement sera une question importante. Précédente in vivo PTOM et investissements à l'étranger des études d'imagerie ont démontré avec succès la visualisation des fonctions d'imagerie fines ^14,15,18,19.

Dans cette étude, nous avons démontré volumétrique investissements à l'étranger avec une corrélation précise des tissus à base de diagnostic pour évaluer la pathologie pulmonaire. Le mode opératoire décrit est destiné à fournir histologie précisément identifié pour être utilisé comme l'or standae pour l'interprétation des images investissements à l'étranger.

Une fois les critères d'imagerie spécifiques pour la pathologie pulmonaire ont été développées et validées ex vivo avec correspondance un-à-un histologie, les critères peuvent ensuite être appliqués à la suite des études d'imagerie in vivo avec l'utilisation d'une biopsie bronchique comme une évaluation étalon-or de l'imagerie Caractéristiques vu. Cette technique est présentée comme une demande de pièces d'exérèse pulmonaire, mais peut être appliquée à presque n'importe quel type de tissu pour fournir l'imagerie précise de la corrélation histologique nécessaire pour déterminer les caractéristiques d'imagerie fines des tissus normaux et pathologiques.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Colorant tissu marquage	Triangle biomédicale	TMD-BK, TMD-G