Frecuencia de imagen óptica de dominio de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Piezas de resección pulmonar: Obtención de One to One de imagen para estudio histopatológico de correlación

Resumen

Un método para la imagen Ex vivo Muestras de resección pulmonar con óptica de imágenes de dominio de frecuencia (IED) y obtener una correlación precisa para histología se describe, que es esencial para el desarrollo de criterios específicos de interpretación de SIED para la patología pulmonar. Este método es aplicable a otros tipos de tejidos y técnicas de formación de imágenes para obtener imágenes precisas de correlación histología para la interpretación precisa de la imagen y de evaluación. Criterios de imagen establecidos con esta técnica sería entonces aplicable a la evaluación de imagen en el futuro In vivo Estudios.

Resumen

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths¹. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)^2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis^6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia^6,8-10.

Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways^11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways^16,23 and parenchyma^17,22 of animal models and in vivo human airway^14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa^11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)¹⁸. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described¹⁹. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface¹⁷.

While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology²⁴. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Protocolo

1. Imaging System

Los detalles técnicos de la SIED se han descrito anteriormente ^4-6. Circunferencial SIED se llevó a cabo a velocidades de formación de imágenes entre 25 y 100 imágenes por segundo y entre 512 y 2.048 perfiles de profundidad axial por circular en sección transversal imagen. Custom 2,4 Fr (0,8 mm de diámetro) catéteres de exploración helicoidal utilizados en este estudio fueron diseñados para operar a través del puerto de acceso de broncoscopios estándar. Los catéteres consistía en un núcleo óptico interno para enfocar la luz en la pared bronquial y una funda exterior de un solo uso. El cuerpo del catéter se mantuvo estacionaria durante la formación de imágenes, mientras que el núcleo interno se hizo girar a una velocidad entre 25 y 100 Hz y traducido a una velocidad de retirada de entre 1,25 y 5 mm / seg. La resolución axial del sistema fue de 6 mm en el tejido y proporciona una profundidad de imagen que van de 7,3 mm ^4-6. Basado en catéter salidas de IED se llevó a cabo en este estudio para replicar en vivo broncoscópica las salidas de IED (Figura 1). Sin embargo, este protocolo también se puede aplicar a imágenes con un sistema óptico de sobremesa (Figura 3 y 4).

2. Imaging System Set-up

1. Encienda el sistema de imágenes
2. Establecer y registrar los parámetros de imagen (velocidad de rotación, la velocidad de retroceso, tasa de adquisición de imágenes, etc.) Para el sistema de formación de imágenes SIED utilizado en este estudio, se obtuvieron imágenes a 10-50 fps.
3. Conecte catéter hasta el cruce giratorio y el dispositivo retirada.
4. Haga girar catéter y verificar la calidad de imagen. Ajuste la alineación del sistema y el desplazamiento cuando sea necesario.

3. Preparación de tejidos

1. Coloque una mesa disponible almohadilla absorbente sobre la mesa de trabajo y la muestra de pulmón conjunto de almohadilla.
2. Si la imagen de una muestra ex vivo quirúrgico de un paciente, asegúrese de consultar con el departamento de patología para asegurar que todos los márgenes de resección (márgenes bronquiales, vasculares y del parénquima) han evaluado, documentado y / o removido por un patoLogist.
3. Identificar las vías aéreas bronquiales entrar en la pieza de resección en el hilio. Retire cualquier moco visible dentro de la vía aérea utilizando una jeringa dio a luz. Si es necesario, adjunte un segmento más largo de tubo de plástico a la jeringa orificio de succión más profunda dentro de las vías respiratorias.
4. Palpar la superficie exterior de la muestra para identificar la lesión de interés.
5. Uso de una sonda de metal fino, con cautela navegar a través del árbol bronquial hasta cerca de la lesión de interés.
6. Abrir la vía aérea a lo largo de la sonda hasta que la lesión de interés es visible o palpable bajo la mucosa respiratoria.
7. Retire con cuidado la sangre o mucosidad de la mucosa que recubre las vías respiratorias de la lesión con un aplicador con punta de algodón.
8. Coloque el catéter SIED por encima de la mucosa respiratoria y obtener una imagen para confirmar la lesión está subyacente a la mucosa respiratoria y para identificar una región de imagen de alta calidad de interés para la correlación de la histología.

4. Marcación de tejido

1. Seleccione la región de interés en la vía aérea sobre la base de los estudios de imagen previos en el Paso 3.8.
2. Elegir dos puntos en el tejido a lo largo de la línea deseada de la imagen. Los puntos pueden ser paralela ya sea a la longitudinal (Figura 2) o circunferencial (Figura 3) aspecto de la vía aérea, dependiendo de los resultados deseados. Puntos espaciales no más de 1,5 cm de separación de modo que la porción de tejido que puede encajar en el bloque histología otro para el procesamiento. Si una longitud de tejido de> 1,5 cm se requiere, a continuación, dividir la longitud de tejido en múltiples 1,5 cm de largo entintadas regiones de interés para crear imágenes múltiples encontrados: pares histología.
3. Sumerja una punta fina aguja agujero abierto (es decir, de calibre 25 7/8 "de largo) en el tejido de marcado tinte (Triángulo de Ciencias Biomédicas, Durham, NC).
4. Limpie cuidadosamente el exceso de tinta de la parte exterior de la aguja con una gasa, dejando tinta tejido marcando sólo en la aguja de taladro.
5. Perforar el tejido perpendicular a la mucosa respiratoria en elelegido punto a lo largo de la línea de formación de imágenes.
6. Repita los pasos 3,3 a 3,5 para el segundo punto de la mucosa respiratoria.
7. Si la tinta corre sobre la superficie de la mucosa de distancia desde el sitio de punción, utilizar un aplicador con punta de algodón para quitar cuidadosamente el exceso de tinta.
8. Eliminar el moco o sangre en la superficie de la mucosa respiratoria con un aplicador con punta de algodón, si está presente.
9. Si los puntos de tinta se colocan de forma circunferencial dentro de una vía aérea, es útil a la patilla abierta a los dos lados de la vía respiratoria para aplanar el tejido en el campo de la imagen (Figura 3a).

5. Tisular

1. Coloque el catéter a través de las salidas de IED cada marca de tinta y de imagen para garantizar las marcas son visibles en las salidas de IED. Marks debe aparecer como perturbaciones focales dentro de la estructura del tejido que recubre con partículas de alta dispersión y atenuación de la señal subyacente rápido, que corresponde a las partículas de tinta en el sitio de la punción (Figura 3b, la figura 4a, Figura 4g ).
2. Si la tinta marca (s) no son visibles en las salidas de IED, repita los pasos 4,3 a 4,7 para las marcas no visibles. Si las marcas de tinta son visibles con las salidas de IED, vaya al paso 5.3.
3. Coloque el catéter paralelo a las dos marcas de tinta en la superficie de las vías respiratorias mucosa tal que la óptica de catéter recubrir el tejido más allá de la marca de tinta primero (figura 2b). Anclaje del extremo proximal del catéter con un objeto ligero y asegurar el extremo distal puede ayudar a reducir los artefactos de movimiento.
4. Continuar con la recolección de un pullback SIED.
5. Ver las imágenes retirada de SIED para asegurar que ambas marcas de tinta son visibles en las imágenes y para verificar si los artefactos de movimiento (Figura 3 y Figura 4). Si las marcas no son visibles, repita los pasos 5.1 a 5.4.

6. Recolección y procesamiento de tejidos

1. Colocar un punto de tinta verde (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) en el tejido mucoso vía aérea para orientar el comienzo del estudio de imágenes, 0,3 cm de distancia de the marca de tinta que apareció por primera vez en la retirada de imágenes (Figura 2c).
2. Quitar el tejido que abarca las dos marcas de tinta negra y tinta marca verde. Recortar el tejido para encajar en un casete de histología estándar de procesamiento. Si el corte de tejido fresco es difícil, entonces el tejido puede ser fijada antes de retirar el tejido para histología.
3. Place tejido en un casete de procesamiento histología y fijar en formalina al 10% durante al menos 48 h.
4. Proceso de tejido en un procesador de tejido, disponible a través de cualquier departamento de histología.
5. Insertar tejido en parafina de manera que las secciones de corte será paralela a las dos marcas de tinta negra en la superficie de las vías respiratorias.
6. Utilice un microtomo de tejidos para afrontar el bloque de parafina hasta que una marca de tinta es visible o la sección de tejido entero es visible, lo que ocurra primero.
7. Una vez que ambas marcas de tinta negra son visibles, corte una sección de 5 micras de grosor y montar en un portaobjetos de vidrio.
8. Continuar para cortar y montar secciones de 5 micras de espesor cada50 micras hasta que las marcas de tinta negra ya no son visibles o los extremos del tejido, lo que ocurra primero.
9. Siga estándar de hematoxilina y eosina (H & E) tinción protocolos para manchar cubreobjetos y portaobjetos.

7. Procesamiento de imágenes

Si las imágenes se adquirieron con un escáner de sobremesa, o técnica de escaneo otra donde ambas marcas de tinta eran visibles en una sola imagen transversal, a continuación, la imagen se puede correlacionar directamente con la histología correspondiente. Si los conjuntos de datos volumétricos fueron adquiridas con un catéter de exploración helicoidal, las imágenes tendrán que ser re-interpolados para que una imagen 2D único biseca ambas marcas de tinta para la correlación con la histología. Esto se puede lograr usando ImageJ u otro software de procesamiento de imágenes. En algunos casos, la tinta puede no ser fácilmente visible, en cuyo caso las secciones adyacentes / diapositivas deben ser examinados.

Resultados

Las marcas de tinta negra debe estar entre 1 a 1,5 cm de distancia para indicar la región de imagen de interés. La marca de tinta verde debe ser colocado al principio de la exploración de imagen, antes de la primera marca de tinta negro para orientar la muestra (Figura 2 y la Figura 3a). Marcas de tejido de tinta debe ser visible tanto en las salidas de IED de imágenes y la histología (Figura 3 y 4). En los cerdos normales (Figura 3) y las vías respiratorias humanas (Figura 4), ​​capas de las vías respiratorias típica debe ser visible. El epitelio (E) es visible como una delgada, moderadamente señal de la capa densa, homogénea en el aspecto luminal de la vía aérea. La lámina propia consiste organizada señal intensa de señal pobre en tejido, correspondiente a los diversos componentes de la lámina propia (LP), tales como señales intensas tejidos conectivos incluyendo elastina y el colágeno (EL), y pobre de la señal de tipo salival tejido glandular (G ). Hay señales de vez en cuando los conductos visibles pobres (D) que atraviesan la respiepitelio respiratoria para conectar con el lumen bronquial. El músculo liso se presenta como discontinuos, intercalados fascículos musculares lisas y no es así identificada en las salidas de IED. En la H & E y manchas tricrómico, capas vías respiratorias puede ser visualizada (Figura 3c, 3d, 3f, 3g, 4b, 4c, 4e, y 4f), donde en tricrómico las superficiales tejidos densos elásticas y colágenas aparecer azul profundo y el músculo liso subyacente Las manchas de color rojo (SM). Anillos de cartílago (C) aparecen como poca señal en forma de medialuna estructuras con límites bien definidos, que se solapan en la vía respiratoria porcina y no se solapan en las vías respiratorias humanas. El pericondrio que rodea los anillos de cartílago aparece como una capa delgada de tejido señal intensa que abarca los anillos de cartílago con poca señal. En el periférico vías respiratorias humanas (Figura 4g y 4h), archivos adjuntos alveolar (A) son visibles como finas, intensas como señal de celosía paredes alveolares con espacios vacíos de señal alveolares. Espacios vasculares dentro de la lámina propia son visible como estructuras de señal de vacío lineales o circulares con artefacto sombreado suave subyacente (flechas).

Figura 1. Las salidas de IED de la especie porcina vías respiratorias. Imágenes in vivo obtenidos a partir de una vía respiratoria porcina en ventilación mecánica. (A) ODFI sección transversal de la vía aérea proximal. (B) SIED sección transversal de la vía aérea distal. (C) ODFI sección longitudinal de la vía aérea proximal, una mayor ampliación de imagen de Panel E en la región resaltada en rojo. (D) las salidas de IED sección longitudinal de la vía aérea distal, mayor magnificación de imagen e panel en la región verde resaltado. (E) ODFI sección longitudinal de la vía aérea de proximal a distal (izquierda a derecha). Catéter diámetro es de 0,8 mm y marcas de graduación representan incrementos de 0,5 mm. Aunque las diferentes capas de la pared de vía respiratoria y archivos adjuntos alveolares son discernibles en las imágenes de SIED, es difícil de interpretar con precisión la co anatómicarrelate de las señales de salidas de IED sin histología directamente registrados. e: epitelio, lp: lámina propia, sm: submucosa, c: cartílago, a: los archivos adjuntos alveolar.

Figura 2. Marcación de tejido de vía respiratoria porcina. (A) Abierto las vías respiratorias con dos marcas de tinta negra en la superficie luminal colocado en paralelo a la cara longitudinal de la vía aérea, 1,5 cm de separación. (B) las salidas de IED catéter colocado sobre dos marcas de tinta negro para incluir ambas marcas dentro de la retirada SIED. (C) las vías respiratorias con marca adicional tinta verde para orientar el comienzo del estudio de imágenes en la muestra.

Figura 3. Las salidas de IED y la histología de las vías respiratorias porcina demostrando cor precisorelación usando marcación de tejido. (a) Abierto las vías respiratorias con dos marcas de tinta negra en la superficie luminal colocado en paralelo a la cara circunferencial de la vía aérea. Patillas se utilizan para abrir más la vía aérea (flechas). (B) las salidas de IED de las vías respiratorias porcina con ambas marcas de tinta visible (asteriscos) con (c) manchado histología precisamente correlacionada con H & E (asteriscos: tinta negro marca visible sobre el epitelio respiratorio) y (d) tinción tricrómica correlacionada. Barra de escala: 2 mm. (E) mayor aumento vista de imagen SIED con (f) correspondiente histología teñidas con H & E y (g) tinción tricrómica correlacionada. E: epitelio respiratorio, EL: colágeno denso y tejidos elásticos, SM: músculo liso, C: anillos cartilaginosos (artefacto histológico ha dado lugar a la separación artificial de los anillos cartilaginosos), G: tejido de la glándula salival, D: conducto salival entrar epitelio. Barra de escala: 250 m. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 4. SIED y la histología de las vías respiratorias humanas que demuestra una correlación precisa usando marcación de tejido. (A) SIED de las vías respiratorias humanas proximal con dos marcas de tinta visible (asteriscos). (B) manchado Precisamente correlacionada con la histología H & E con tinta negro marca visible sobre el epitelio respiratorio (asteriscos) y (c) tinción tricrómica correlacionada. Barra de escala: 2 mm. (D) Mayor ampliación de la imagen de vista SIED y (e) la histología correspondiente teñidas con H & E y Tricrómico de (f). Barra de escala: 250 m. E: epitelio respiratorio, LP: lámina propia, G: tejido de la glándula salival, C: anillos cartilaginosos, PC: pericondrio. En las vías respiratorias humanas, la estratificación típica es visible. En el tejido conectivo laxo, no se intercalan fascículos de rojo-tinción de músculo liso (SM, c paneles y f), Que no forman una banda continua y por lo tanto no son visibles como una capa distinta en las salidas de IED. (G) las salidas de IED de las vías respiratorias humanas distal y (h) precisamente correlacionada H & E histología con las marcas de tinta negros visibles sobre el epitelio respiratorio (asteriscos). Barra de escala: 2 mm. Adjuntos alveolar (A) son accesibles como señales intensas como celosía paredes alveolares con espacios vacíos de señal alveolares. Espacios vasculares dentro de la lámina propia también son visibles como estructuras de señal de vacío-con sombreado subyacente leve (flechas).

Discusión

Evaluación de los cánceres de pulmón a tiempo puede ser muy difícil debido a la falta de síntomas y la incapacidad de visualizar los primeros cambios neoplásicos o radiológicamente broncoscópicamente. Las salidas de IED ofrece cerca resolución histológica, amplia zona de 3 dimensiones de la microestructura del tejido vistas en tiempo real ^2-6. Endobronquial SIED ha sido demostrada en pacientes como una técnica segura que se puede utilizar para obtener de alta resolución de conjuntos de datos volumétricos sobre segmentos largos vías respiratorias en las vías respiratorias pulmonares ^11-13 (Animación). Sin embargo, sólo pequeñas biopsias se obtienen como homólogos histopatológicos en el entorno en vivo, que no proporcionan correlaciones adecuadas para SIED para el desarrollo de criterios de imagen para la patología pulmonar. Con el fin de evaluar con precisión las características de SIED visto en proyección de imagen pulmonar, es esencial para obtener la imagen exactamente a la histología correlaciones. Se presenta un método sencillo y eficaz para precisa, uno a Ocorrelación entre las salidas de IED ne e histología aplicada a las vías respiratorias de imágenes de los ex muestras de resección pulmonar in vivo, que es aplicable a casi cualquier tipo de tejido ex vivo. Una vez que los criterios de imagen se han establecido ex vivo con acertaron una-a-uno histología, estos criterios, entonces se puede aplicar a imágenes in vivo.

El tinte del tejido utilizado para marcar la zona de imagen de interés es claramente visible tanto en las salidas de IED y la histología. Mediante el uso de técnicas sencillas para orientar el tejido, las marcas de tinta puede ser correlacionado tanto en imágenes y la histología para permitir doce y cincuenta y nueve de la noche comparaciones de características de SIED y hallazgos histológicos para determinar las características de formación de imágenes identificables de la patología del tejido. La técnica es barato y práctico, por lo que es útil en muchas aplicaciones de formación de imágenes ópticas.

En el entorno en vivo, métodos tales como el marcado con láser se puede utilizar para la orientación del tejido ^25. Sin embargo, tél pequeño tamaño de la biopsia bronquial es todavía un factor de limitación en el uso de los estudios in vivo para desarrollar criterios específicos de formación de imágenes para la patología pulmonar. Aunque los estudios ex vivo servir como una alternativa adecuada para la formación de imágenes in vivo, existen algunas limitaciones. Ex muestras de pulmón in vivo se muestran a menudo sin inflar y atelectasia inducida quirúrgicamente, lo que altera la apariencia de las estructuras alveolares normales. Inflar el tejido pulmonar resecado quirúrgicamente con marcación de tejido para la correlación histológica es técnicamente difícil ya que la mayoría de las muestras de pulmón quirúrgico se reciban después de la evaluación patología sección congelada durante el cual la superficie pleural se interrumpe, lo que interfiere con la inflación muestra. No patológico atelectasia no es un artefacto visto en el escenario en vivo, por lo que esta limitación no sería pertinente para la formación de imágenes in vivo pulmonar. Además, la falta de sangre dentro de los vasos en muestras ex vivo podría hacer difícil distinguish estructuras vasculares de otras estructuras de señal vacíos. En el entorno en vivo, la adición de Doppler octubre / SIED ^26-28 estructural a octubre / SIED sería ayudar en la identificación de los vasos.

Artefactos de movimiento se puede ver en vivo donde no están presentes ex vivo. Esto podría ser potencialmente problemática en los sistemas de octubre estándar con velocidades de adquisición más lentas. Sin embargo, las velocidades de cuadro rápidas de los sistemas de salidas de IED se encuentran actualmente> 200 fps ^29-31. Por lo tanto, no se espera que un artefacto de movimiento será un problema significativo. Anterior en vivo OCT y estudios de imagen han demostrado SIED visualización satisfactoria de características de las imágenes finas ^14,15,18,19.

En este estudio hemos demostrado volumétrica SIED con correlación precisa de tejido basado en el diagnóstico para la evaluación de la patología pulmonar. El procedimiento descrito está destinado a proporcionar histología ajustan con precisión para ser utilizado como oro Standaª de la interpretación de las imágenes salidas de IED.

Una vez que los criterios de imagen específicos para la patología pulmonar se han desarrollado y validado ex vivo con acertaron una-a-uno histología, los criterios, entonces se puede aplicar a posterior en vivo en los estudios de formación de imágenes con el uso de una biopsia bronquial como una evaluación estándar de oro de la formación de imágenes características visto. Esta técnica se presenta como una aplicación a muestras de resección pulmonar, pero puede ser aplicado a casi cualquier tipo de tejido para proporcionar la imagen precisa para histología correlación necesaria para determinar características finas de formación de imágenes de los tejidos normales y patológicos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Marcación de tejido tinte	Triángulo Biomédica	TMD-BK, TMD-G