Оптических изображений домена частоты<em&gt; EX VIVO</em&gt; Образцы легочной резекции: Получение один к одному изображению, чтобы Гистопатология Корреляция

Резюме

Метод изображений Бывших естественных условиях Образцы легочной резекции с оптической частотной области изображения (ПИИ) и получим точную корреляцию с гистологией описано, которая имеет важное значение для разработки конкретных интерпретации ПИИ критерии легочной патологии. Этот метод применим и к другим типам тканей и методов визуализации для получения точной визуализации для гистологии корреляции для точной интерпретации изображений и оценки. Изображениями критериев, установленных с этой техникой затем будет применимо к изображению оценки в будущем В естественных условиях Исследования.

Аннотация

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths¹. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)^2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis^6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia^6,8-10.

Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways^11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways^16,23 and parenchyma^17,22 of animal models and in vivo human airway^14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa^11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)¹⁸. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described¹⁹. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface¹⁷.

While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology²⁴. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

протокол

1. Система индикации

Подробная техническая информация о ПИИ были описаны ранее ^4-6. Окружная ПИИ был проведен в визуализации скоростях от 25 до 100 кадров в секунду и между 512 и 2048 осевые профили глубиной в круглое поперечное сечение изображения. Пользовательские 2,4 Fr (0,8 мм) спиральное сканирование катетеров, используемых в данном исследовании были предназначены для работы через порт доступа стандартного бронхоскопы. Катетеры состоял из внутренней оптической жиле, чтобы сфокусировать свет на стенки бронхов и одноразовой внешней оболочки. Катетер тела оставался неподвижным во время съемки, а внутреннее ядро ​​вращался со скоростью от 25 до 100 Гц и переведены на откате скоростью от 1,25 до 5 мм / сек. Осевая разрешающая способность системы составляет 6 мм в ткани и при условии, изображения, начиная глубину 7,3 мм ^4-6. Катетер на основе ПИИ была выполнена в этом исследовании размножаться в естественных условиях бронхоскопической ПИИ (Fiрисунке 1). Тем не менее, этот протокол также может быть применен к визуализации с настольного оптической системы (рис. 3 и 4).

2. Imaging System Set-до

1. Включите системы визуализации
2. Установить и записывать изображение параметров (скорость вращения, откат скорость, скорость получения изображений и т.д.). Для системы ПИИ изображения, используемые в этом исследовании, изображения были получены при 10-50 кадрах в секунду.
3. Прикрепите катетер для поворотного соединения и откат устройства.
4. Побочные катетер и проверить его на качество изображения. Настройка системы выравнивания и смещения по мере необходимости.

3. Подготовка ткани

1. Поместите настольные одноразовые впитывающие накладки на настольных и образец легкого набора на клавиатуре.
2. Если изображение хирургического образца естественных бывших у пациента, не забудьте проконсультироваться отделении патологии обеспечить, чтобы все краев резекции (бронхов, сосудов и паренхимы поля) были оценены, задокументированы и / или удалены патологист.
3. Определение бронхиальной дыхательных путей ввода резекции образца на воротах. Удалите все видимые слизи в дыхательных путях с помощью шприца отверстие. При необходимости приложить больше сегменте пластиковых труб на шприц отверстие для всасывания глубже в дыхательные пути.
4. Пальпируйте внешней поверхности образца для выявления поражения интерес.
5. Использование тонких зондов металла, осторожно перемещаться по бронхиального дерева почти до поражения интерес.
6. Откройте дыхательные пути вдоль зонда до поражения интерес видимым или ощутимым под слизистой оболочкой дыхательных путей.
7. Осторожно удалите крови или слизи из дыхательных путей слизистой оболочки покрывающей поражения с ватным аппликатором.
8. Поместите ПИИ катетер выше дыхательных путей и слизистой оболочки получить изображение, чтобы подтвердить поражение дыхательных путей, лежащих в основе слизистой оболочки и выявления высококачественных изображений регион представляет интерес для корреляции гистологии.

4. Маркировка тканей

1. Выберите область интереса в дыхательных путях на основе предыдущих результатов визуализации в шаге 3.8.
2. Выберите две точки на ткани вдоль линии желаемого изображения. Очки могут быть параллельными либо продольными (рис. 2) или окружные (рис. 3) аспект дыхательных путей, в зависимости от желаемого результата. Космический точек не более 1,5 см друг от друга так, что часть ткани может поместиться в одной гистологии блок для обработки. Если ткань длиной> 1,5 см требуется, затем разделить ткани длиной в несколько 1,5 см длиной подписали регионах, представляющих интерес для создания нескольких соответствие изображения: гистология пар.
3. Опустите тонкой наконечником открытых диаметра иглы (т.е. 25 калибровочных 7/8 "длиной) в ткань красителем маркировку (треугольник медико-биологических наук, Durham, NC).
4. Тщательно протрите излишки краски с внешней стороны иглы марлей, оставляя ткань маркировка чернилами только в пределах иглы отверстие.
5. Прокол ткани перпендикулярно слизистой оболочки дыхательных путей ввыбранной точке вдоль линии изображения.
6. Повторите шаги с 3,3 до 3,5 для второй точки на слизистой оболочке дыхательных путей.
7. Если чернила заканчиваются на поверхности слизистой оболочки от места прокола, воспользуйтесь ватной палочки тщательно удалите излишки чернил.
8. Удалить слизь или кровь на поверхности слизистой оболочки дыхательных путей с хлопком палочки, если он присутствует.
9. Если чернильные точки расположены в пределах окружности дыхательных путей, полезно прикрепить открытую с двух сторон дыхательных путей, чтобы сгладить ткани в поле изображения (рис. 3а).

5. Изображениями тканей

1. Поместите ПИИ катетер над каждой марки чернил и изображений для обеспечения знаки видны на ПИИ. Знаки должны появиться в качестве координационных нарушений в структуру ткани с вышележащих сильно рассеивающих частиц и лежащие в основе быстрого затухания сигнала, что соответствует частицы краски в месте пункции (рис. 3б, 4а Рис, Рис 4g ).
2. Если чернила знак (знаки) не видны на ПИИ, повторите шаги с 4,3 до 4,7 для не-видимые знаки. Если чернила знаки видны с ПИИ, переходите к шагу 5.3.
3. Поместите катетер параллельно двум чернил следы на поверхности слизистой оболочки дыхательных путей, что катетер оптики залегают на ткани после первой маркой чернил (рис. 2б). Закрепление проксимального конца катетера с легким объектом и обеспечения дистального конца может помочь уменьшить артефакты движения.
4. Продолжайте собирать откат ВПИИ.
5. Просмотр изображений ПИИ откат, чтобы обеспечить как чернила марки являются видимыми в области обработки изображений и для проверки артефактов движения (рис. 3 и рис 4). Если знаки не видны, повторите шаги с 5,1 до 5,4.

6. Сбор и обработка ткани

1. Поместите зелеными чернилами точка (треугольник медико-биологических наук, Durham, NC) на слизистой ткани дыхательных путей ориентироваться начала сканирования изображений, 0,3 см от гоE Ink знак, который впервые появился в визуализации откат (рис. 2).
2. Удалите ткань охватывающая два черных чернил знаки и зеленый знак чернил. Обрежьте ткань, чтобы вписаться в стандартную кассету обработки гистологии. Если сокращение чистой тканью трудно, то ткань может быть установлен до удаления ткани для гистологического исследования.
3. Место ткани в кассете гистологии обработки и исправления в 10% формалине в течение не менее 48 часов.
4. Процесс ткани в ткань процессоров, доступных через любое отделение гистологии.
5. Добавить в парафин ткани таким образом, что сокращение разделов будет параллельно две черные метки чернил на поверхности дыхательных путей.
6. Используйте ткань микротома к лицу парафинового блока, пока не чернилами знак является видимым или весь раздел ткань видно, что наступит раньше.
7. После того как черные метки чернила видны, вырезать один толщиной 5 мкм раздел и установить на предметное стекло.
8. Продолжайте резать и монтировать толщиной 5 мкм разделов каждый50 мкм до черных чернил знаки не видны или ткани концов, что наступит раньше.
9. Следуйте стандартным гематоксилином и эозином (H & E) окрашивания протоколы для окрашивания и покровное слайдов.

7. Обработка изображений

Если изображения были получены с помощью сканера настольный или другую технику сканирования, где оба чернила знаки были видны в одном поперечном сечении образ, то образ может быть напрямую связаны с соответствующими гистологии. Если объемных наборов данных были приобретены с винтовой катетер сканирования изображения необходимо будет повторно интерполированное так, чтобы один 2D-изображение делит оба чернильных меток для корреляции с гистологией. Это может быть осуществлено с использованием ImageJ или другое программное обеспечение для обработки изображений. В некоторых случаях, чернила не может быть хорошо видна и в этом случае соседние секции / горки должны быть изучены.

Результаты

Черные метки краски должна быть в пределах 1 - 1,5 см друг от друга, чтобы указать изображение интересующей области. Зеленая метка чернила должны быть помещены в начале сканирования изображений, до первой черной меткой чернила, чтобы ориентировать образца (рис. 2 и рис 3а). Знаков ткани чернила должны быть видны на обоих ПИИ визуализации и гистологии (рис. 3 и 4). В обычной свиньи (рис. 3) и дыхательных путей человека (рис. 4), типичный слоев дыхательных путей должна быть видна. Эпителия (E) видна в виде тонкой, умеренно плотные сигнал, однородный слой на просвет аспект дыхательных путей. Собственная пластинка состоит из организованных сигнал интенсивным, чтобы сигнал плохой ткани, соответствующие различным компонентам собственной пластинки (LP), такие как интенсивный сигнал соединительной ткани, включая эластина и коллагена (EL), и сигнал плохой слюнных типа железистой ткани (G ). Есть иногда видимый сигнал плохой каналов (D) перемещения респираторногоЛаборатории эпителием, чтобы соединиться с бронхиальной просвет. Гладкая мышца выглядит как разрывная, чередующиеся гладкие пучки мышц и, таким образом, не идентифицируемые в ВПИИ. В H & E и трехцветный пятна, дыхательных путей слои могут быть визуализированы (рис. 3c, 3d, 3f, 3G, 4б, 4в, 4e, и 4f), где на трехцветный поверхностные плотных эластичных и коллагеновых тканях появляются синие и основные гладких мышц Пятна красного (SM). Хрящ кольца (C) выступают в качестве сигнала плохой форме полумесяца структуры с четко определенными границами, которые перекрываются в свиней дыхательных путей и не перекрывают друг друга в человеческом дыхательных путей. Надхрящница окружающих хрящ кольца появляется в виде тонкого слоя сигнала интенсивного ткань охватывает сигнал плохой кольца хряща. В периферических дыхательных путях человека (рис. 4g и 4h), альвеолярные вложений (A) видны как тонкие, сигнал интенсивной решетки, как стенки альвеол с сигналом недействительным альвеолярных пространств. Сосудистые помещения в пределах собственной пластинки являются Visible как сигнал пустоту линейной или кольцевой структуры с мягким основной артефакт слежки (стрелки).

Рисунок 1. Вывоз ПИИ из свиной дыхательных путей. В естественных изображений, полученных от свиного дыхательных путей при механической вентиляции. (А) ODFI сечения проксимальных дыхательных путей. (Б) ПИИ сечение дистальных дыхательных путей. (С) ODFI продольного сечения проксимальных дыхательных путей, большем увеличении изображение панели е в красном подчеркнул региона. (Г) ПИИ продольный разрез дистальных дыхательных путей, большем увеличении изображение панели е в зеленой подчеркнул региона. (Е) ODFI продольного сечения дыхательных путей от проксимальных к дистальным (слева направо). Катетер диаметром 0,8 мм и делениями представляют шагом 0,5 мм. Несмотря на различные слои дыхательных путей стены и альвеолярного вложения заметно в изображениях ПИИ, трудно точно интерпретировать анатомических сотрудничестваrrelate из сигналов ПИИ непосредственно не зарегистрированы гистологии. е: эпителия, LP: собственной пластинки, см: подслизистая, C: хрящи,: альвеолярной вложений.

Рисунок 2. Ткань маркировки свиней дыхательных путей. (А) Открытое дыхательных путей с двумя черными чернилами знаки на просвет поверхность расположена параллельно продольной аспект дыхательных путей, 1,5 см друг от друга. (Б) ПИИ катетер в течение двух черных чернил марки включает в себя как знаки в откате ВПИИ. (С) Airway с дополнительной зеленой меткой чернила, чтобы ориентировать начала сканирования изображений на образец.

Рисунок 3. Вывоз ПИИ и гистологии свиного дыхательных путей демонстрирует точную соответствуетотношения с использованием ткани маркировки. (а) Открытое дыхательных путей с двумя черными метками чернила на просвет поверхности расположены параллельно окружной аспект дыхательных путей. Пальцы используются для дальнейшего открытия дыхательных путей (стрелки). (Б) Вывоз ПИИ из свиной дыхательных путей с обеих чернил отмечает видимым (звездочки) с (С) точно коррелировали гистологии окрашивали H & E (звездочки: черные чернила отмечает видно на дыхательный эпителий) и (г) коррелированных трехцветный пятно. Шкала бар: 2 мм. (Д) большее увеличение зрения ПИИ изображение с (F), соответствующей гистологии окрашивали H & E и (г) коррелированных трехцветный пятно. E: респираторный эпителий, EL: плотная коллагеновых и эластичных тканей, SM: гладкие мышцы, C: хрящи кольца (гистологическое артефактов привело к искусственному разделению кольца хряща), G: слюнные железы ткани, D: слюнных протоков ввода эпителия. Шкала бар: 250 мкм. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 4. Вывоз ПИИ и гистология человеческого дыхательных путей демонстрирует точную корреляцию с использованием ткани маркировки. (А) Вывоз ПИИ из человеческих проксимальных дыхательных путей с обеих чернил отмечает видимым (звездочки). (Б) точно коррелировали гистологии окрашивали H & E с черными чернилами отмечает видно на дыхательного эпителия (звездочки) и (с) коррелированных трехцветный пятно. Шкала бар: 2 мм. (Г) большее увеличение зрения имиджа ПИИ и (е), соответствующее гистологии окрашивали H & E и (е) трехцветный. Шкала бар: 250 мкм. E: респираторный эпителий, LP: собственная пластинка, G: слюнные железы ткани, C: хрящи кольца, PC: надхрящница. В дыхательных путей человека, типичных слоев видна. В свободной соединительной ткани, там перемежаются пучки красного окрашивания гладких мышц (SM, панелей С и Р), Которые не образуют сплошной полосы и, следовательно, не видны в качестве отдельного слоя в ВПИИ. (Г) Вывоз ПИИ из человеческих дистальных дыхательных путей и (ч) точно коррелировали H & E гистологии с черными чернилами знаки видны на дыхательного эпителия (звездочки). Шкала бар: 2 мм. Альвеолярные вложений (A) видны как сигнал интенсивной решетки, как стенки альвеол с сигналом пустотах альвеолярные. Сосудистые помещения в пределах собственной пластинки видны также как сигнал недействительным структур с базовым мягким слежки (стрелки).

Обсуждение

Оценка ранних злокачественных опухолей легких может быть чрезвычайно сложной из-за отсутствия симптомов и невозможности визуализации ранних неопластических изменений радиологической или bronchoscopically. Вывоз ПИИ обеспечивает практически гистологического резолюции, большая площадь 3-мерные виды тканей микроструктуры в режиме реального времени ^2-6. Эндобронхиальная ПИИ была продемонстрирована у пациентов как безопасный метод, который может быть использован для получения высокого разрешения объемных наборов данных в течение длительных отрезков дыхательных путей в легочных дыхательных путей ^11-13 (анимация). Тем не менее, лишь небольшое биопсии, как гистопатологические коллегами в в естественных условиях установки, которые не обеспечивают достаточной коррелирует с ПИИ для развития визуализации критерии легочной патологии. Для того, чтобы точно оценить особенности ПИИ видели в легочной визуализации, важно получить точно соответствует изображению, чтобы гистологии корреляции. Мы представляем простой и эффективный метод для точного, один в опе корреляции между ПИИ и гистологии применяться к визуализации дыхательных путей бывших естественных образцов легочной резекции, которая применима практически к любому типу ткани бывших естественных условиях. После визуализации критерии были установлены бывшие естественных условиях с согласованными один-на-один гистологии, эти критерии могут быть применены в визуализации естественных условиях.

Ткани красителя используется для обозначения изображений область интереса отчетливо видна в обоих ПИИ и гистологии. С помощью методов проста ориентироваться ткани, краски знаки могут быть связаны в обоих изображений и гистологии, чтобы позволить 12:59 сравнение особенностей ПИИ и гистологии результаты, чтобы определить идентифицируемых характеристик изображения тканей патологии. Этот метод является недорогим и практичным, что делает ее полезной во многих оптических приложений визуализации.

В естественных условиях в настройки, такие методы, как лазерная маркировка может быть использован для ткани ориентации ^25. Тем не менее, тОн небольшого размера бронхиальной биопсии еще ограничивающим фактором в использовании в естественных условиях исследования разработать конкретные критерии для визуализации легочной патологии. Хотя бывший исследования естественных условиях служить адекватным заместителя изображений в живом организме, есть некоторые ограничения. Ex образцах легких естественных условиях являются uninflated и часто демонстрируют хирургически индуцированной ателектаз, который изменяет внешний вид нормальных альвеолярных структур. Раздувание хирургически удаленных легочной ткани с маркировкой ткани для гистологического корреляции является технически сложной задачей, поскольку большинство хирургических образцах легких получены после патологии замороженных оценки разделе в течение которого плевральной поверхности нарушается, вмешиваясь в образце инфляции. Non-патологических ателектазов не является артефактом видели в в естественных условиях установки, таким образом, это ограничение не будет иметь отношение к легочным в естественных условиях изображений. Кроме того, отсутствие крови в сосудах, в бывших образцы естественных условиях может сделать это трудно distinguиш сосудистых структур из других структур недействительным сигнала. В естественных условиях в настройки, кроме доплеровского октября / ПИИ ^26-28 структурных октября / ПИИ бы помочь в идентификации судов.

Артефакты движения можно увидеть в естественных условиях, где их нет естественных отл. Это может быть потенциально проблематичными в стандартном октября системах с медленными темпами приобретения. Тем не менее, высокие темпы рамках системы ПИИ в настоящее время> 200 кадров в секунду ^29-31. Таким образом, он не ожидал, что артефакт движения будет серьезной проблемой. Назад в естественных условиях октябре и ПИИ изображений исследования показали успешные визуализации тонкие черты изображения ^14,15,18,19.

В этом исследовании мы показали, объемные ПИИ с точной корреляции с тканью на основе диагностики для оценки легочной патологии. Процедура, описанная предназначен для обеспечения точно соответствуют гистологическим для использования в качестве золотого Standaго для интерпретации изображений ВПИИ.

После конкретные критерии для визуализации легочной патологией были разработаны и утверждены бывшим естественных условиях с согласованными один-на-один гистологии, критерии могут быть применены к последующим в естественных условиях исследования изображений с использованием бронхиальной биопсии, как золотой стандарт оценки изображений особенности видел. Этот метод представлен в качестве приложения к легочной образцов резекции, но может быть применена практически в любой тип ткани, чтобы обеспечить точное отображение, чтобы гистологии корреляции, необходимых для определения тонких особенностей визуализации нормальных и патологических тканей.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Ткань маркировке красителей	Треугольник биомедицинских	TMD-BK, TMD-G