Imagem Domínio óptico Freqüência de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pulmonares espécimes de ressecção: Obtenção de One to One Imagem para Histopatologia Correlação

Resumo

Um método para a imagem Ex vivo Espécimes de ressecção pulmonar com óptica no domínio da frequência de imagem (OFDI) e obter correlação precisa de histologia é descrito, o que é essencial para o desenvolvimento de critérios de interpretação específicos para OFDI patologia pulmonar. Este método é aplicável a outros tipos de tecidos e técnicas de imagiologia para obter imagens precisas para correlação histológica para a interpretação de imagens precisas e avaliação. Critérios de imagem criados com esta técnica, então, seria aplicável à avaliação de imagem no futuro In vivo Estudos.

Resumo

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths¹. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)^2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis^6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia^6,8-10.

Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways^11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways^16,23 and parenchyma^17,22 of animal models and in vivo human airway^14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa^11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)¹⁸. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described¹⁹. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface¹⁷.

While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology²⁴. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Protocolo

1. Imaging System

Os pormenores técnicos da OFDI foram descritos anteriormente ^4-6. OFDI circunferencial foi conduzido a uma velocidade de imagem, entre 25 e 100 imagens por segundo, e entre 512 e 2048 perfis de profundidade axial por imagem da secção transversal circular. Costume 2,4 Fr (0,8 mm de diâmetro) cateteres exploração helicoidal utilizados neste estudo foram concebidos para funcionar através da porta de acesso do broncoscópio padrão. Os cateteres consistiam de um núcleo interior óptico para focar a luz para a parede brônquica e uma bainha exterior de utilização única. O corpo do cateter permanece estacionária durante o exame, enquanto que o núcleo interno foi feito rodar a uma velocidade entre 25 e 100 Hz e traduzida, a uma velocidade de recuo entre 1,25 e 5 mm / seg. A resolução axial do sistema era de 6 mm de tecido e forneceu uma imagem profundidade que varia de 7,3 milímetros ^4-6. Cateter baseada OFDI foi realizada neste estudo para replicar in vivo broncoscópica OFDI (Figura 1). No entanto, este protocolo pode também ser aplicado à geração de imagens com um sistema de bancada óptica (Figura 3 e 4).

2. Imaging System Set-up

1. Ligue sistema de imagem
2. Definir e registrar os parâmetros de imagem (velocidade de rotação, velocidade de recuo, taxa de aquisição de imagem, etc.) Para o sistema de imagem OFDI utilizada neste estudo, foram obtidas imagens de 10-50 fps.
3. Anexar cateter de junção rotativa e um dispositivo de retirada.
4. Girar cateter e verificar a qualidade de imagem. Ajustar o alinhamento do sistema de deslocamento e, se necessário.

3. Preparação de Tecidos

1. Coloque uma mesa almofada absorvente descartável na bancada e amostras de pulmão conjunto na almofada.
2. Se a imagem de um espécime vivo cirúrgica ex de um paciente, não se esqueça de consultar o departamento de patologia para garantir que todas as margens de ressecção (margens brônquicas, vascular e parênquima) foram avaliados, documentados e / ou removido por um patoLogist.
3. Identificar as vias respiratórias brônquica entrar no espécime ressecção no hilo. Remova qualquer muco visível dentro da via aérea, utilizando uma seringa furo. Se necessário, instale um longo segmento de tubos de plástico para a seringa deu a aspiração mais profunda dentro da via aérea.
4. Apalpar a superfície exterior da amostra para identificar a lesão de interesse.
5. Usando uma sonda de metal fino, cautelosamente navegar pela árvore brônquica até perto da lesão de interesse.
6. Abrir as vias aéreas ao longo da sonda, até a lesão do interesse é visível ou palpável sob a mucosa das vias aéreas.
7. Remova cuidadosamente qualquer sangue ou muco da mucosa das vias aéreas que recobre a lesão com um aplicador com ponta de algodão.
8. Colocar o cateter OFDI acima da mucosa das vias aéreas e de obter uma imagem para confirmar a lesão é subjacente à mucosa das vias aéreas e para identificar uma região de imagem de alta qualidade de interesse para a correlação de histologia.

4. Tecido Marcação

1. Selecione a região de interesse na via aérea com base em achados anteriores em Passo 3.8.
2. Escolha dois pontos sobre o tecido ao longo da linha desejada de imagem. Os pontos podem ser paralelas, quer ao longitudinal (Figura 2) ou circunferencial aspecto (Figura 3) das vias aéreas, dependendo dos resultados desejados. Pontos espaciais não mais do que 1,5 cm, de modo que a porção de tecido pode caber em um bloco de histologia para processamento. Se um comprimento de tecido> 1,5 cm é necessário, em seguida, dividir a extensão de tecido em vários 1,5 cm de comprimento com tinta regiões de interesse para criar imagens combinados múltipla: pares de histologia.
3. Mergulhe uma ponta fina agulha furo aberto (ou seja calibre 25 7/8 "de comprimento) para o tecido marcação corante (Triângulo Ciências Biomédicas, Durham, NC).
4. Limpar cuidadosamente o excesso de tinta para fora da parte externa da agulha com uma gaze, deixando apenas a marcação de tinta de tecido no interior da agulha de orifício.
5. Perfurar o tecido perpendicular à mucosa das vias aéreas noponto escolhido ao longo da linha de imagem.
6. Repita os passos de 3,3-3,5 para o segundo ponto sobre a mucosa das vias aéreas.
7. Se a tinta corre ao longo da superfície da mucosa para longe do local de punção, utilizar um aplicador derrubado algodão para remover cuidadosamente o excesso de tinta.
8. Remover o muco ou sangue na superfície da mucosa das vias aéreas com um algodão aplicador derrubado, se presente.
9. Se os pontos de tinta são colocados circunferencialmente dentro da via aérea, é útil para o pino aberto nos dois lados da via aérea para achatar o tecido no campo de imagem (Figura 3a).

5. Tecido de imagem

1. Coloque o cateter OFDI sobre cada marca de tinta e de imagem para assegurar as marcas são visíveis em OFDI. Marcas devem aparecer como rupturas focais dentro da estrutura do tecido com partículas altamente espalhamento sobrejacente e subjacente a atenuação de sinal rápida, a qual corresponde às partículas de tinta no interior do local de punção (Figura 3b, a figura 4a, Figura 4g ).
2. Se a tinta marca (s) não são visíveis na OFDI, repita os passos de 4,3-4,7 para as marcas não visíveis. Se as marcas de tinta são visíveis com OFDI, vá para o passo 5.3.
3. Colocar o cateter paralelo para as duas marcas de tinta sobre a superfície da mucosa das vias aéreas, tais que a óptica de cateter se sobrepor a tecido para além da marca de tinta primeiro (Figura 2b). A ancoragem da extremidade proximal do cateter com um objeto leve e fixando a extremidade distai pode ajudar a reduzir os artefactos de movimento.
4. Proceder com a coleta de um pullback OFDI.
5. Veja as imagens retirada OFDI para garantir ambas as marcas de tinta são visíveis na imagem e para verificar artefatos de movimento (Figura 3 e Figura 4). Se as marcas não são visíveis, repita os passos de 5,1-5,4.

6. Coleta e processamento de tecidos

1. Coloque uma tinta verde dot (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) sobre o tecido das vias respiratórias da mucosa para orientar o início do exame de imagem, 0,3 cm de distância do thmarca e tinta que apareceu primeiro na retirada de imagem (Figura 2c).
2. Remover o tecido que engloba as duas marcas de tinta preta e marca de tinta verde. Apare tecido para caber em um cassete padrão histologia processamento. No caso de corte de tecido fresco é difícil, em seguida, o tecido pode ser fixado antes da remoção do tecido para exame histológico.
3. Tecidos lugar em um cassete de processamento histologia e correção em formalina a 10% por pelo menos 48 horas.
4. Tecidos processo em um processador de tecidos, disponível através de qualquer departamento de histologia.
5. Incorporar tecido em parafina de tal modo que as secções de corte será paralelo às duas marcas de tinta preta na superfície das vias aéreas.
6. Use um micrótomo de tecido para enfrentar o bloco de parafina até que uma marca de tinta é visível ou a secção de tecido inteiro é visível, o que ocorrer primeiro.
7. Uma vez que ambas as marcas de tinta preta são visíveis, cortar uma secção de 5 um de espessura e montar sobre uma lâmina de vidro.
8. Continuar a cortar e montar 5 um de espessura cada50 mm até as marcas de tinta preta não são mais visíveis ou as extremidades do tecido, o que ocorrer primeiro.
9. Siga padrão hematoxilina e eosina (H & E) coloração protocolos para manchar e slides lamela.

7. Processamento de Imagem

Se as imagens foram obtidas com um digitalizador de bancada, ou outra técnica de exploração em que ambas as marcas de tinta eram visíveis em uma imagem em corte transversal único, em seguida, a imagem pode ser directamente correlacionada com a histologia correspondente. Se dados volumétricos foram adquiridos com um cateter de varredura helicoidal, as imagens terão de ser re-interpolada, de modo que uma única imagem 2D corta ambas as marcas de tinta para a correlação com a histologia. Isto pode ser conseguido usando ImageJ ou outro software de processamento de imagem. Em alguns exemplos, a tinta pode não ser facilmente visível, caso em que as secções adjacentes / slides devem ser examinadas.

Resultados

As marcas de tinta preta deve estar entre 1 - 1,5 cm para além de indicar a região de imagem de interesse. A marca de tinta verde deve ser colocado no início da análise de imagem, antes da primeira marca de tinta preta para orientar o espécime (Figura 2 e Figura 3a). Marcas de tinta de tecido devem ser visíveis em ambos OFDI imagem e histologia (Figura 3 e 4). Em porcos normais (Figura 3) e das vias respiratórias humanas (Figura 4), ​​em camadas da via aérea normal deve ser visível. O epitélio (E) é visível como uma fina camada de sinalizar moderadamente densa e homogénea no aspecto luminal das vias respiratórias. A lâmina própria consiste organizada sinal intenso de sinal pobre em tecido, correspondendo a vários componentes da lâmina própria (LP), tais como os tecidos conjuntivos de sinais intensos incluindo elastina e colagénio (EL), eo tecido salivar sinal de tipo glandular pobre (G ). Há canais de sinal ocasionalmente visíveis pobres (D) que atravessam a respiepitélio respiratório para se conectar com a luz brônquica. O músculo liso aparece como descontínuas, intercaladas fascículos musculares lisas e não é, portanto, na identificação OFDI. Na H & E e manchas tricrômicos, camadas das vias aéreas pode ser visualizado (figura 3c, 3d, 3f, 3g, 4b, 4c, 4e e 4f), em que em tricromo superficiais densos tecidos elásticos e colagenosa aparecer azul profundo e o músculo subjacente suave manchas vermelhas (SM). Anéis cartilaginosos (C) aparecem como um sinal fraco em forma de crescente estruturas com limites bem definidos, que se sobrepõem nas vias aéreas suína e não se sobrepõem nas vias respiratórias humanas. O pericôndrio em torno dos anéis de cartilagem aparece como uma fina camada de tecido forte de sinal do sinal englobando os anéis de cartilagem pobres. No periférico humano das vias aéreas (figura 4g e 4h), ligações alveolares (A) são visíveis como finas, sinal intenso lattice-como paredes alveolares com espaços vazios de sinal alveolares. Espaços vasculares no interior da lâmina própria são visible como estruturas de sinal vazio linear ou circular com artefato sombreamento leve subjacente (setas).

Figura 1. OFDI de suínos das vias aéreas. Nas imagens in vivo obtidos a partir de uma das vias respiratórias de suínos em ventilação mecânica. (A) ODFI secção transversal da via aérea proximal. (B) OFDI secção transversal da via aérea distal. (C) seção longitudinal da via aérea ODFI proximal, imagem maior ampliação do painel e na região destacado em vermelho. (D) seção longitudinal OFDI de via aérea distal, imagem maior ampliação de e painel na região destacada verde. (E) seção longitudinal ODFI das vias respiratórias de proximal para distal (esquerda para direita). Diâmetro do cateter é de 0,8 mm e marcas de escala representam incrementos de 0,5 mm. Embora diferentes camadas da parede das vias aéreas e ligações alveolares são discerníveis nas imagens OFDI, é difícil de interpretar precisamente o co anatómicarrelate dos sinais OFDI sem histologia directamente registadas. e: lp epitélio,: lâmina própria, sm: submucosa, c: cartilagem, um: ligações alveolares.

Figura 2. Marcação de tecido das vias respiratórias de suínos. (A) das vias aéreas aberta com duas marcas de tinta preta na superfície luminal colocada paralelamente à face longitudinal da via aérea, a 1,5 cm de distância. (B) OFDI cateter colocado sobre duas marcas de tinta preta de modo a incluir ambas as marcas dentro do recuo OFDI. (C) das vias aéreas com marca de tinta verde adicional para orientar o início da análise de imagem do espécime.

Figura 3. OFDI e histologia suína vias aéreas demonstrando cor precisorelação usando tecido de marcação. (a) das vias aéreas aberta com duas marcas de tinta preta na superfície luminal colocada paralelamente à face periférica da via aérea. Pinos são utilizados para abrir ainda mais as vias aéreas (setas). (B) OFDI de suíno vias aéreas com a tinta marca visível (asteriscos) com (c) manchado histologia precisamente correlacionada com H & E (asteriscos: tinta preta marca visível no epitélio respiratório) e (d) correlacionada tricromo. Barra de escala: 2 mm. (E) Maior aumento de vista OFDI imagem com (f) histologia correspondente corados com H & E e (g) correlacionada tricrômico. E: epitélio respiratório, EL: colagénio denso e tecidos elásticos, SM: músculo liso, C: anéis de cartilagem (artefato histológica resultou na separação artificial dos anéis de cartilagem), G: tecido da glândula salivar, D: ducto salivar entrar epitélio. Barra de escala: 250 m. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 4. OFDI e histologia vias respiratórias humanas demonstrando correlação precisa usar tecido de marcação. (A) OFDI da via aérea proximal humano com a tinta marca visível (asteriscos). (B) histologia corado Precisamente correlacionada com H & E, com tinta preta marca visível no epitélio respiratório (asteriscos) e (c) correlacionada tricromo. Barra de escala: 2 mm. (D) exibição de imagem Maior ampliação OFDI e (e) histologia correspondente corados com H & E e (f) tricromo. Barra de escala: 250 m. E: epitélio respiratório, LP: lâmina própria, G: tecido da glândula salivar, C: anéis cartilaginosos, PC: pericôndrio. Nas vias respiratórias humanas, em camadas típica é visível. Dentro do tecido conjuntivo frouxo, não são intercaladas fascículos de coloração vermelho-do músculo liso (SM, painéis c e f), Que não formam uma banda contínua e, assim, não são visíveis como uma camada distinta no OFDI. (G) OFDI de via aérea distal humana e (h) precisamente correlacionada histologia H & E, com marcas de tinta preta visíveis no epitélio respiratório (asteriscos). Barra de escala: 2 mm. Ligações alveolares (A) são visíveis como sinal intenso lattice-como paredes alveolares com espaços alveolares sinal vazio. Espaços vasculares no interior da lâmina própria também são visíveis como sinal de vácuo-estruturas com sombreamento ligeiro subjacente (setas).

Discussão

Avaliação de neoplasias malignas pulmonares iniciais pode ser extremamente difícil devido à falta de sintomas e incapacidade de visualizar iniciais de alterações neoplásicas radiologicamente ou broncoscopia. OFDI fornece perto histológica resolução, grande área 3-dimensional vista microestrutura do tecido em tempo real ^2-6. Endobrônquica OFDI tem sido demonstrada em pacientes como uma técnica segura, que pode ser usada para obter os conjuntos de dados de alta resolução volumétricas mais longos segmentos das vias aéreas na via aérea pulmonar ^11-13 (Animação). No entanto, apenas pequenas biópsias são obtidas como contrapartes histopatológicas no in vivo configuração, que não proporcionam correlatos adequados para OFDI para o desenvolvimento de critérios de imagiologia para a patologia pulmonar. A fim de avaliar com precisão as características OFDI visto na imagem pulmonar, que é essencial para a obtenção da imagem precisamente de acordo com a correlação da histologia. Apresenta-se um método simples e eficaz para precisão, um para one correlação entre OFDI e histologia aplicada nas vias aéreas de imagiologia ex vivo amostras de ressecção pulmonar, que é aplicável a quase qualquer tipo de tecido ex vivo. Uma vez que os critérios de imagiologia foram estabelecidas ex vivo com correspondência histologia um-para-um, estes critérios podem então ser aplicada a imagem in vivo.

O corante do tecido usado para marcar a região de imagem de interesse é claramente visível em ambos OFDI e histologia. Usando técnicas simples de orientar o tecido, marcas de tinta pode ser correlacionado tanto em imagem e histologia para permitir 1-1 comparações das características OFDI e descobertas histológicas para determinar as características de imagem de identificação do tecido da patologia. A técnica é barato e prático, tornando-se assim útil em muitas aplicações de imagem ópticos.

Na configuração em vivo, tais como os métodos de marcação a laser pode ser utilizado para a orientação do tecido ^25. No entanto, tele pequeno tamanho da biópsia brônquica ainda é um fator limitante na utilização de estudos in vivo para desenvolver critérios de imagem específicos para a patologia pulmonar. Embora estudos ex vivo servir como uma alternativa adequada para imagem in vivo, existem algumas limitações. Espécimes pulmonares ex vivo são uninflated e muitas vezes exibir atelectasia cirurgicamente induzida, o que altera a aparência de estruturas alveolares normais. Inflando tecido pulmonar cirurgicamente ressecada com tecido marcação para correlação histologia é tecnicamente desafiador como a maioria dos espécimes pulmonares cirúrgicas são recebidos após avaliação seção patologia congelado durante o qual a superfície pleural é interrompido, interferindo com a inflação espécime. Não-patológica atelectasia não é um artefato visto no na definição vivo, portanto, essa limitação não seria pertinente na imagem pulmonar vivo. Além disso, a falta de sangue dentro dos vasos em amostras ex vivo pode tornar difícil a distinguish estruturas vasculares a partir de estruturas de vazios de outros sinais. Na configuração em vivo, a adição de Doppler OCT / OFDI ^26-28 de outubro estrutural / OFDI iria ajudar na identificação dos navios.

Artefactos de movimento pode ser observado in vivo em que eles não são ex vivo presente. Isto poderia ser potencialmente problemáticos na norma outubro sistemas com taxas mais lentas de aquisição. No entanto, as taxas de quadro rápidas de sistemas OFDI atualmente> 200 fps ^29-31. Assim, não se espera que artefacto de movimento irá ser um problema significativo. Anterior, em outubro vivo e estudos de imagem OFDI demonstraram visualização bem-sucedida de recursos de imagem finas ^14,15,18,19.

Neste estudo nós demonstramos OFDI volumétrico com correlação precisa de tecido baseado diagnóstico para avaliar patologia pulmonar. O processo descrito destina-se a fornecer histologia combinados com precisão para ser usada como o ouro Standaª para a interpretação da imagem OFDI.

Critérios de imagem uma vez específicos para a patologia pulmonar, foram desenvolvidos e validados ex vivo com correspondência histologia um-para-um, os critérios podem então ser aplicada para subsequente estudos in vivo de imagens com o uso de uma biópsia brônquica como uma avaliação padrão de ouro da imagiologia Características visto. Esta técnica é apresentada como uma aplicação para amostras de ressecção pulmonar, mas pode ser aplicado a praticamente qualquer tipo de tecido para proporcionar a imagem precisa de histologia correlação necessários para determinar as características de imagem finas de tecidos normais e patológicos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Tintura do tecido marcação	Triângulo Biomédica	DTM-BK, DTM-G