加工的主要脑肿瘤组织的干细胞检测和流量排序

摘要

人脑肿瘤发病机制，鉴定的脑瘤开始的细胞（BTICs），罕见的一个异质性肿瘤具有干细胞特性的细胞内，提供了新的见解。我们已调整了特定的文化条件，以丰富BTICs，我们经常使用流式细胞仪检测，以进一步丰富这些人群。对这些孤立的细胞自我更新的检测和RT-PCR单细胞的转录分析可以随后进行。

摘要

脑肿瘤通常是由不同的形态的细胞，表达出各种神经谱系标记。只有小部分的肿瘤细胞与干细胞的特性，称为脑肿瘤启动细胞（BTICs），具备的能力以及多种细胞类型分化，自我更新，并启动体内的肿瘤。我们采用原本用于正常的神经干细胞（NS​​Cs）的各种人脑肿瘤，结果发现，这种文化的方法，具体选择干细胞样的人群的文化条件。无血清培养基（NSC）允许的未分化的干细胞状态的维持，和碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的添加允许多强有力的，自我更新，增殖和膨胀tumorspheres。

为了进一步刻画每个肿瘤的BTIC人口，我们通过流式细胞仪检测细胞表面标志物进行评估。我们也可以更具体的characteriz关注的群体排序BULLETIN。自我更新检测到96孔板上执行单BTICs排序条件的形成在37温育后的tumorspheres°C表示的干细胞或祖细胞的存在。某一特定人群的多个细胞的数量也可以在不同的井进行排序，有限稀释分析，分析的自我更新能力。我们也可以研究在一个特定的细胞群的差异表达基因的单细胞RT-PCR。

以下协议描述了我们的程序主人体标本的分离和培养，以丰富的BTIC人口，以及分离的tumorspheres。此外，还包括用于染色，流式细胞仪分析或排序，自我更新的检测，和单细胞RT-PCR方法的协议。

引言

脑肿瘤中最积极和异质性在人类癌症。虽然他们的早期检测和诊断提供了便利的现代神经影像学技术，我们仍然缺乏许多脑肿瘤的根治性治疗方法，特别是对弥漫性，浸润性，或者那些在大脑深处。

脑肿瘤由于他们的性质非常凶悍，经常无法治愈的儿童癌症死亡率的首要原因。胶质母细胞瘤（GBM），在成人中最常见的原发性脑肿瘤，是一种最积极的人类癌症，担心其均匀致命的预后^1。高度恶性星形细胞瘤（WHO 4级），通常发生在成人大脑半球，也可以发生在儿童和婴儿。它的增长是快速渗透，诊断的病理特征包括核多形性，微血管增生，坏死^2,3。对于adulTS新诊断为GBM，中位生存期很少超出12个月^1，所有治疗方法的普遍反应不佳。我们注意到，有许多共享的成体干细胞和癌细胞的功能和遗传相似性，在肿瘤的分子通路，调节大脑正常发育往往是失调的。在应用的研究脑肿瘤干细胞生物学范式，我们是第一个研究人员前瞻性地识别和纯化的人类的GBMS表现出增殖，自我更新的干细胞特性的细胞亚群^，4 和体外分化体内 ^5。我们最初用来描述正常的神经干细胞（NSCs） 体外 ^6,7到多个儿童和成人脑瘤的培养条件和检测应用，丰富这些干细胞样细胞的细胞分选的神经祖细胞表面标志CD133 ^，9。的CD133 +脑肿瘤馏分包含有高得多的频率的肿瘤起始细胞在NOD-SCID小鼠的大脑^5,10比CD133-馏分。这正式成立，只有一种罕见的脑肿瘤细胞与干细胞特性的子集是肿瘤起始，赢得他们的名称为"脑肿瘤启动细胞"或"BTICs"。新的识别BTICs到人脑肿瘤提供了新的见解，给予大力支持的癌症干细胞假说^10-13许多实体肿瘤的基础，并建立了一个新的细胞目标的更有效的癌症疗法^14-20。重点杀死大量的肿瘤的治疗，可能会错过难得的干细胞样的分数，使肿瘤继续增长。重点杀死癌症干细胞的治疗，可能为脑肿瘤患者提供更好的治疗和预后。

在为了研究BTIC的人群，我们有完善我们的丘尔重新协议，专门选择在人类脑肿瘤的细胞群具有干细胞的特性。无血清，神经干细胞（NS​​C）媒介允许未分化的干细胞状态的维持，和此外，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），表皮生长因子（EGF），白血病抑制因子（LIF），允许多有力，自我更新，和可扩展的人类tumorspheres增殖。在这里，我们描述的原发性脑肿瘤的处理和培养NSC媒体，以丰富BTIC人口参与的方法， 我们都要求我们的实验模型系统"BTIC的的病人分离"强调一个事实，这些都只是最低限度的条件下培养干细胞选择的干细胞群的细胞条件。随后的关键干细胞标志物，如CD133和CD15和流式细胞仪分析免疫标记的BTIC人口中也有描述。然后，我们讨论有限稀释法，这有助于研究自我更新的BTICs潜力。最后，我们将探讨这些稀有细胞的基因表达分析的，分拣单细胞上AmpliGrid幻灯片和执行单细胞RT-PCR。这些技术也适用于其他脑肿瘤如髓母细胞瘤，室管膜瘤和儿科神经胶质瘤。

研究方案

1。对脑肿瘤的组织文化

1. 200μL解冻Liberase的（罗氏应用科学部）15毫升的人工脑脊液（ACSF 见表1），并放入37℃水浴。 liberase TM是用于解离主要的组织样本，以及培养tumorspheres的混合的蛋白水解酶。胰蛋白酶-EDTA不同中，Liberase方法保留了表面抗原CD133。对于一个约0.5厘米^3的组织样本，我们用200微升Liberase。如果组织是较小的，我们用100微升。
2. 带上的氯化铵溶液（干细胞技术）到室温。氯化铵溶液中轻轻地溶解红血细胞与其他细胞的影响最小。它不包含一个固定液。
3. 在无菌生物安全柜中，加入5毫升的脑脊液标本的容器，涡流冲洗组织，然后移液管关闭。此步骤有助于去除血红细胞（RBC）。
4. 脑肿瘤组织转移到无菌的100毫米的Petri二叔SH。
5. 使用剪刀或手术刀和镊子，分解组织浆的一致性。
6. 收集样品进入管预热的脑脊液Liberase的定期用10毫升的移液管或镊子和转让片段。
7. 放置在培养箱摇床（每分钟30转），并设定为37℃，持续15分钟。
8. 过滤器的组织裂解液通过70μm的细胞过滤网入50毫升的Falcon管中。
9. 附带滤液，在280×g离心5分钟。
10. 仔细移除上清液和评价所得到的细胞沉淀的大小和颜色:粒料是粉红色或红色，表明增加的红血细胞的数目。
11. 在1ml的PBS重悬沉淀。
12. 添加适当量的氯化铵溶液（4-12毫升），根据颗粒大小和红细胞污染（氯化铵溶液是非常温和的增加量不是有害细胞红细胞以外）。
13. 在室温下孵育5分钟。
14. 自旋细胞下降，在280×g离心5分钟。
15. 用10ml无菌PBS洗涤一次。
16. 重悬在5毫升NSC完全培养基（ 表2），并转移至超低结合60毫米组织培养板（Corning）。我们采用超低约束力的培养板共价键合的水凝胶表面的亲水性和电中性的，以减少细胞的粘附介导的分化。

文化的最初几天中， 不改变介质上，只用1-2毫升媒体，然后继续观察文化和变革媒体的媒体时的颜色变成微黄色。

2。 Tumorsphere解离流式细胞仪分析

1. 评估tumorspheres显微镜下:如果球体大小是> 100微米，解离被推荐为在中心，较大的球可能成为坏死。
2. 转移至15毫升锥形管中的文化。
3. 加入2-3毫升无菌PBS彻底冲洗板，锥形管。
4. 280×g离心5分钟离心。
5. 去除上清，重悬在1 - 2毫升无菌PBS。
6. 加入10微升Liberase。
7. 在37℃水浴孵育3分钟。删除和视觉评估暂停，如果看到多个团块，轻轻捣碎使用1000微升移液器吸头。
8. 如果丛生仍然存在，潜伏期为1-2分钟。
9. 洗涤细胞，加入5毫升无菌PBS中，并在280×g离心5分钟离心。
10. 去除上清，重悬在500-1000μl无菌PBS +2 MM EDTA。
11. 评估使用台盼蓝染色的细胞数和存活率。
12. 调整细胞计数为100万/ ml的PBS +2 MM EDTA。

3。表面染色

1. 100μl的1×10 ⁶ / ml的细胞悬浮液，每次测试传输12x75毫米的流量管的。
2. 加入适量的抗体。匹配的抗体同种型控制应该被用于各种抗体（ 见表3）。
3. 在冰上孵育30分钟。
4. 每个流管中加入2ml PBS +2毫米EDTA。
5. 在200 XG离心4分钟，滗和印迹。
6. 在300μlPBS +2 MM EDTA重新悬浮颗粒。
7. 每个管中加入10μl7AAD生存能力染料和至少15分钟，在冰上孵育。
8. 用流式细胞仪分析。

4。流式细胞仪采集和分析

的具体内容的流数据的采集和分析仪器依赖。代表阴性样品的运行和仪器设置为正向（大小）和侧面（粒度）分散。这种分散的模式，允许最终用户查看所有细胞样品中，包括碎片。通常是一个区域周围绘制所关注的细胞。 （ 图4a）的设置，然后建立了荧光检测器，定位阴性细胞内的第一个十年AFluorescence强度的情节。当使用一个以上的染料或荧光染料，单染色控件必须运行建立颜色补偿值（减法干扰荧光发射）。运行时的活细胞，如7-AAD（7 -氨基放线菌素D - 655激发488/emission）被使用并排除死细胞（ 图4b）的第二区域绘制生存能力染料。这些区域都被施加到样品的任何进一步的分析。

5。自我更新的含量

关键的是极大地促进通过克隆球体生长的测定是在体外试验的自我更新的能力，极限稀释法。 Tumorspheres分离，在的稀释降低到一个单细胞，每孔分布，计算和随后的球体形成率超过7天中文化。第7天，井的百分比不含有球体为每个细胞电镀密度（F _0）的计算和绘制对每孔的细胞的数量（x）的。形成在每一个孔的至少一个tumorsphere所需的细胞的数目来确定的点，在该点的线穿过0.37的水平（F ₀ = ^e-x的 ）。在一个泊松分布的细胞，F ₀ = 0.37对应于一个细胞每孔的稀释，因此，该计算（37％相交）反映人口（ 图5）在整个细胞集落形成的干细胞的频率。

6。单细胞RT-PCR

不同人群的单细胞进行排序Beckman Coulter公司MoFlo的XDP反应的AmpliGrid幻灯片的网站（Beckman Coulter公司猫＃AG480F）。单细胞RT-PCR根据制造商的说明使用AmpliGrid单一步法RT-PCR系统（Beckman Coulter公司猫＃OAX04515）。简要地说，一个单一的单元被存入每个反应部位的AmpliGrid幻灯片的存在下，在每一个单元格在显微镜下观察反应现场确认。后立即进行排序，以防止样品受到反转录（RT）。 RT预混新鲜配制，根据试剂盒说明书（ 表4）。我们使用0.03微升25μM的随机引物（Promega）中，每个反应; 1μl反应混合液添加到每个反应部位的中心。这立即涂覆与5μl的密封解决方案（Beckman Coulter公司猫＃OAX04503）。使用一个AmpliSpeed​​的滑动循环仪（Beckman Coulter公司;猫＃OAX04101），幻灯片孵育在25℃下为10分钟，42℃下为10分钟，和55℃下45分钟。反转录反应后，3微升DNA酶/无RNase的水被添加到每个反应位点，并且转移到PCR管（1管/部位）整个混合物。在PCR板，反应体积为10μl的用于定量PCR:8微升定量PCR的master mix（5微升的SYBR Green（广达），1微升的水混合，1微升10μM的正向和反向引物混合物）加2及万亩; L的RT混合物。对于实时定量，样品在BioRad公司循环仪运行使用下面的程序:95℃10分钟，45个循环的95℃30秒，60℃60秒，72℃60秒，随后通过10分钟在72℃，熔解曲线分析。使用:OPTICON监视器3（BioRad公司）测定Ct值。每个单元格可以评估三种基因，包括作为管家基因的GAPDH的。基因表达被归一化到GAPDH表达，根据^2-ΔCT。从相同的排序相同的人口至少有十几个单细胞可以被用作生物复制，以弥补缺乏技术复制。

7。代表性的成果

图1显示了磁共振成像（MRI）扫描的代表与GBM患者。脑肿瘤样本后立即手术，获得病人同意批准的汉密尔顿健康科学/麦克马斯特健康小号ciences研究伦理委员会。每个标本的一部分用于临床常规诊断的神经病理学家。剩余的样品进行处理，如在图2中示出。的肿瘤细胞，一旦镀完整的神经干细胞培养基中，如在图3中示出与生长因子，形式tumorspheres。

表面与神经干细胞标志物CD133和CD15标记的肿瘤细胞中，并通过流式细胞术分析，如在图4中所示。

单细胞不同人群例如 ，CD15 + / CD133 +，CD15 + / CD133-，CD15-/CD133 +，CD15-/CD133-，然后到96孔板（ 图5a）或成AmpliGrid幻灯片（ 图6a）排序。

在96孔板中，单细胞，这些细胞具有自我更新的能力（ 例如，CD133 +细胞），（ 图5b），可以形成tumorspheres（ 图5c）INCUcDNA克隆。可以绘制一个自我更新的图形（ 图5d），计算领域形成每口井的数量。单细胞的排序条件到反应部位的Ampligrid滑动件（ 图6a）。可以从单细胞提取的RNA逆转录使用Advalytix AmpliSpeed（ 图6b）。使用获得的cDNA进行实时RT-PCR（ 图6c）。

图1。磁共振成像（MRI）的病人的GBM。一个月悠久的历史，头痛，呕吐，嗜睡，视力模糊为期一周的历史与一个16岁的女孩的大脑MRI扫描。轴向FLAIR序列显示了一个大的双半球（"蝴蝶"）GBM。

图2。脑肿瘤脑肿瘤样本的处理。要想获取立即手术后病人同意的独立非执行董事。机械分离的，如图所示，（a）和然后酶解法分离通过在每分钟30转的摆动培养箱温育在37℃下为15分钟（二）在脑脊液与Liberase。

图3。 BTIC的人群形成tumorspheres文化。游离脑肿瘤细胞的生长因子与完整的神经干细胞培养基铺在形成tumorspheres。

图4。流式细胞仪分析BTIC人群。（a）远期与侧散射特性提供了一个图像的所有细胞，包括碎片（二）7-AAD的可行性染料染色的细胞从分析中排除。 （三）的统计象限的位置，确定使用相应的同型对照（D）的肿瘤细胞染色，麻面rkers CD15-PE和CD133-APC。 （四）Moflo XDP的细胞分拣机。 点击此处查看大图 。

图5。限制稀释的BTICs分析显示其自我更新的能力。（一）细胞的不同稀释度进行排序NSC（b）单细胞每孔含200微升到96口井。 （三）经过7天的潜伏期，tumorsphere形成。的二次tumorspheres形态是相同初级tumorspheres的。 （d）本平均x截距值，可以计算出从有限稀释分析，以显示每孔形成的至少一个tumorsphere所需的细胞数量的每个肿瘤亚型。

图6。的一个单一的BTIC细胞的基因表达分析可以使用单细胞RT-PCR技术。（一）单细胞到，可以进行排序从BTIC人口的AmpliGrid幻灯片。 （二）进行cDNA合成对单细胞在AmpliGrid幻灯片使用Advalytix AmpliSpeed​​。 （三）定量实时PCR进行的cDNA合成从单一BTIC细胞。

2M的NaCl	62毫升
1M氯化钾	5毫升
1M MgCl 2的	3.2毫升
155毫米碳酸氢钠	169毫升
1M葡萄糖	10毫升
108毫米氯化钙	0.9256毫升
PURELAB超H 2 0	749.84毫升

表1中。人工脑脊液（ACSF） - 1,000毫升。

库存基本培养基	500毫升
1:1的DMEM:F12	480毫升
N2补充	5毫升
1M HEPES	5毫升
葡萄糖	3.0克
N-乙酰半胱氨酸（60微克/毫升）	1毫升
神经存活因子1（NSF-1）	10毫升

表2中。神经干细胞培养基。

NSC完整的媒体 （前取得了新的使用）:
NSC基础培养基+ 20 ng / ml的EGF（表皮生长因子）+20 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子（碱性成纤维细胞生长因子）+ 10纳克/毫升LIF（白血病抑制因子）* + 10微升/毫升的抗生素 - 抗真菌剂

*白血病抑制因子（LIF）:此试剂从Millipore包含类细胞因子的白细胞介素6，某otein抑制自发分化的干细胞促进干细胞培养长期的维护。

抗体	供应商/ CAT＃	微升/测试（在100μl）
CD133 / 2 APC（293C3）	美天旎Biotec/130-090-854	5
IgG2b的APC（同种型对照）	美天旎Biotec/130-092-217	5
CD15PE	贝克曼Coulter/IM1954U	5
IgG2a的PE（同种型对照）	贝克曼Coulter/A09141	5
7AAD	贝克曼Coulter/A07704	10

表3流量抗体。

元件	量（反应）	成交量（48反应）
2个单细胞RT反应缓冲液	0.50微升	30.0微升
RNA酶抑制剂（10 U /μL）	0.02μL	1.2μL
5倍的单细胞RT增强	0.15微升	9.00微升
单细胞逆转录酶混合	0.04微升	2.4微升
Advablue（OAX04227）	0.1μL	6.00微升
无核酸酶的水	1微升	至60微升

表4。单细胞RT-PCR（CAT＃OAX04515）的反转录（RT）混合组成。

讨论

癌干细胞假说^10，是根据工作²¹在白血病，乳腺癌¹¹和脑癌^4,5，表明仅有一个相对小的部分的细胞在肿瘤中，称为肿瘤干细胞，具有客户广泛增殖和自我 - 更新。大多数的肿瘤细胞失去增殖的能力和自我更新，因为它们分化成细胞，成为表型的肿瘤签名。找到关键脑肿瘤的人口能够维持肿瘤细胞的脑肿瘤发生的机制和深入了解，使我们能够追溯起源的细胞。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号
1:1的DMEM:F12	Invitrogen公司	11320-082
N2补充	Invitrogen公司	17502-048
1M HEPES	欧洲野牛	330-050-EL
葡萄糖	Invitrogen公司	15023-021
N-乙酰半胱氨酸	Sigma Aldrich公司	A9165-25G
神经的生存因子-1（NSF-1）	龙沙Clonetics	CC-4323
表皮生长因子（EGF）	Sigma Aldrich公司	E9644
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Invitrogen公司	PHG0261
白血病抑制因子（LIF）	密理博	LIF1010
抗生素/霉菌性	欧洲野牛	450-115-EL
Liberase TM	罗氏公司	05 401 119 001
氯化铵溶液	干细胞技术	07850