Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

Resumo

A identificação de células de tumor cerebral de iniciação (BTICs), as células raras dentro de uma heterogeneidade de tumores que possuem propriedades de células-tronco, fornece novas pistas sobre patogénese humana de tumor cerebral. Temos refinado condições específicas de cultura para enriquecer para BTICs, e usam rotineiramente citometria de fluxo para enriquecer ainda mais essas populações. A auto-renovação e ensaios de análise por transcrição única célula de RT-PCR pode ser realizada posteriormente nestas células isoladas.

Resumo

Os tumores cerebrais são tipicamente constituídos por células morfologicamente diferentes que expressam uma variedade de marcadores de linhagem neural. Apenas uma fracção relativamente pequena de células no tumor com propriedades de células estaminais, células cerebrais chamados de tumores de iniciação (BTICs), possuir uma capacidade de se diferenciar ao longo de várias linhagens, de auto-renovação e iniciar tumores in vivo. Aplicou-se as condições de cultura normais, inicialmente utilizadas para as células estaminais neurais (NSC) para uma variedade de tumores cerebrais humanos e verificou que este método de cultura, especificamente selecciona para a haste-como populações. Meio isento de soro (NSC) permite a manutenção de um estado indiferenciado de células estaminais, e a adição de bFGF e EGF permite a proliferação de multi-potentes, de auto-renovação e tumorspheres expansíveis.

Para caracterizar adicionalmente população BTIC cada tumor, avaliamos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo. Podemos também classificar as populações de interesse para characteriz mais específicosção. A auto-renovação ensaios são realizados em BTICs individuais ordenadas em placas de 96 poços, a formação de tumorspheres após a incubação a 37 ° C, indica a presença de uma haste ou de células progenitoras. O número de células múltiplas de uma dada população podem ser classificados em diferentes poços para análise de diluição limitante, para analisar a capacidade de auto-renovação. Podemos também estudar a expressão diferencial de genes dentro de uma determinada população celular, utilizando células único de RT-PCR.

Os protocolos que se seguem descrevem os processos para a dissociação e cultura de amostras humanas primárias para enriquecer as populações BTIC, bem como a dissociao de tumorspheres. Também incluídos estão os protocolos para coloração por análise de citometria de fluxo ou triagem, a auto-renovação ensaios e única célula de RT-PCR.

Introdução

Os tumores cerebrais estão entre os cânceres mais agressivos e heterogênea conhecidos em humanos. Embora a sua detecção precoce e diagnóstico ter sido facilitada pela tecnologia neuro-imagem moderna, ainda não temos terapias curativas para muitos tumores cerebrais, particularmente para difusas, as invasoras ou os localizados no fundo do cérebro.

Os tumores cerebrais representam a principal causa de mortalidade por câncer em crianças devido à sua natureza altamente agressiva e muitas vezes incurável. Glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais comum em adultos, é um dos cancros mais agressivos humanos, temidos por seu prognóstico uniformemente fatal ^1. Este tumor altamente maligno astrocitária (OMS grau 4) geralmente ocorre nos hemisférios cerebrais de adultos, e também pode ocorrer em crianças pequenas e bebês. Seu crescimento é rápido e infiltrativo, e de diagnóstico características patológicas incluem pleomorfismo nuclear, a proliferação microvascular e necrose ^2,3. Para adulst com GBM recém-diagnosticado, a sobrevida média raramente se estende para além de 12 meses ^1, com respostas geralmente pobres para todas as modalidades terapêuticas. Notamos que existem muitas similaridades funcionais e genéticos partilhados pelas células estaminais somáticas e células cancerosas, e que as vias moleculares que regulam o desenvolvimento normal do cérebro são frequentemente desregulado no cancro. Ao aplicar paradigmas estaminais biologia de células para o estudo de tumores no cérebro, que foram os primeiros investigadores a identificarem prospectivamente e purificar uma sub-população de células a partir de GBMs humanos, que exibiram as propriedades de células-tronco da proliferação, a auto-renovação e diferenciação in vitro e em ^quatro vivo ^5. Nós aplicamos as condições de cultura e ensaios originalmente utilizados para caracterizar normais células-tronco neurais (NCCC) in vitro ^6,7 para vários tumores cerebrais em crianças e adultos, e enriquecida para estas células-tronco, como por célula neural de classificação para o marcador de superfície de células progenitoras CD133 ^{8 ,}9. O CD133 + fração de tumor no cérebro continha células que tiveram uma freqüência muito maior de iniciação do tumor do que a fração CD133 em cérebros NOD-SCID ^5,10 mouse. Este formalmente estabelecido que apenas um subconjunto raro de células de tumor cerebral com propriedades de células-tronco são o tumor de iniciação, eles ganham o nome de "tumor cerebral iniciar células" ou "BTICs". A identificação romance de BTICs fornece novas pistas sobre a tumorigênese cérebro humano, dando um forte apoio para a hipótese de células-tronco do câncer ^10-13 como base para muitos tumores sólidos, e estabelece um novo alvo celular para terapias mais eficazes de câncer ^14-20. Terapias que se concentram em matar a maior parte do tumor podem perder a fracção haste-como rara, permitindo que o tumor continue a crescer. Terapias com foco em matar as células-tronco do câncer podem fornecer um melhor tratamento e prognóstico de pacientes com tumores cerebrais.

A fim de estudar as populações BTIC, temos refinado nossa culture protocolos para selecionar especificamente para populações de células em tumores cerebrais humanos que possuem propriedades de células-tronco. Isento de soro, de células estaminais neurais (NSC) meio permite a manutenção de um estado indiferenciado de células estaminais, e a adição de factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), e factor inibidor de leucemia (LIF), permite a proliferação de multi-potentes, de auto-renovação, e expansíveis tumorspheres humanos. Aqui, descrevemos os métodos envolvidos no processamento de tumores cerebrais primários e cultura los em NSC meio de enriquecer para populações BTIC. Chamamos nosso sistema modelo experimental "isolados de pacientes BTIC" para enfatizar o fato de que estas células são apenas minimamente cultivadas em tronco Condições de células à selecção de populações de células progenitoras. imunomarcação subsequente de populações BTIC para os marcadores de células-tronco-chave, tais como CD15 e CD133 e análise de citometria de fluxo é também descrito. Em seguida, discute a análise de diluição limitante,que ajuda no estudo do potencial de auto-renovação de BTICs. Finalmente, exploramos a análise da expressão do gene dessas células raras por triagem de células individuais em lâminas AmpliGrid e realizando única célula de RT-PCR. Estas técnicas são também aplicáveis ​​a outros tumores cerebrais, tais como meduloblastoma ependimoma e gliomas pediátricos.

Protocolo

1. Cultura de tecido de tumor cerebral

1. Adicionar 200 ul de Liberase descongelado (Roche Applied Science) para 15 ml de CSF artificial (aCSF-ver Tabela 1) e colocar em banho de água a 37 ° C. Liberase TM é uma mistura de enzimas proteolíticos utilizadas para dissociar amostras de tecidos primários, assim como tumorspheres cultivadas. Ao contrário de tripsina-EDTA, o método de Liberase preserva o antigénio de superfície da CD133. Para obter uma amostra de tecido de cerca de 0,5 cm ^3, usamos 200 ul de Liberase. Se o tecido for menor, usamos 100 ul.
2. Traga solução cloreto de amónio (tecnologias de células-tronco) à temperatura ambiente. Solução de cloreto de amónio suavemente lisa os glóbulos vermelhos com um efeito mínimo sobre outras células. Ele não contém um fixador.
3. Na cabine de segurança biológica estéril, adicionar 5 ml de aCSF a girar espécime recipiente, para lavar o tecido, em seguida, pipetar fora. Este passo ajuda a remover as células vermelhas do sangue (RBC).
4. Transferir o tecido de tumor cerebral a uma estéril 100 milímetros Petri dish.
5. Com uma tesoura fina ou bisturis e pinças, desagregar o tecido de consistência da pasta.
6. Recolha de amostra, utilizando uma pipeta de 10 ml regular ou fórceps e fragmentos de transferência para dentro do tubo que contém pré-aquecido com aCSF Liberase.
7. Lugar em incubadora-agitadora (30 rpm) e ajustado para 37 ° C, durante 15 min.
8. Filtrar o lisado de tecido através do filtro 70 uM em células de um tubo de 50 ml Falcon.
9. Girar-se o filtrado para baixo a 280 xg durante 5 min.
10. Remover o sobrenadante com cuidado e avaliar o tamanho ea cor do resultado agregado de células: pelotas, que são cor de rosa ou vermelho indicam aumento do número de células vermelhas do sangue.
11. Ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS.
12. Adicionar uma quantidade apropriada de solução de cloreto de amónio (4-12 ml), com base no tamanho do grânulo e da contaminação de glóbulos vermelhos (solução de cloreto de amónio é muito suave e quantidades aumentadas não são prejudiciais para as células que não sejam de células vermelhas).
13. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
14. Células de spinpara baixo a 280 xg durante 5 min.
15. Lavar uma vez com 10 ml de PBS estéril.
16. Ressuspender em 5 ml de meio de NSC completo (Tabela 2) e transferir para um ultra-baixo de ligação placa de 60 mm de cultura de tecidos (Corning). Usamos ultra-baixas placas de cultura com as superfícies de ligação de hidrogel ligados covalentemente que são hidrofílicas e com carga neutra, para minimizar a diferenciação celular mediada por ligação.

Para os dias iniciais na cultura, não altere a mídia: top-up só com 1-2 ml de mídia, conforme necessário, em seguida, continuar a observar os meios de cultura e de mudança quando a cor da mídia torna-se um pouco amarelo.

2. Tumorsphere dissociação de Citometria de Fluxo

1. Avaliar tumorspheres sob microscópio: se o tamanho da esfera é> 100 um, a dissociação é recomendada como esferas maiores podem tornar-se no centro necrótico.
2. Transferir a cultura para 15 ml tubo cónico.
3. Adicionar 2-3 ml estéril PBS para enxaguar a chapa cuidadosamente e adicionar ao tubo cônico.
4. Centrifugar a 280 xg durante 5 min.
5. Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 - 2 ml de PBS estéril.
6. Adicionar 10 ul de Liberase.
7. Incubar em banho de água a 37 ° C durante 3 min. Remover e avaliar visualmente a suspensão, se aglomerados várias vistas, tritura-se cuidadosamente com uma pipeta de ponta de 1000 ul.
8. Se aglomeração persistir, continuar a incubação de uma min 1-2 adicional.
9. Lave as células por adição de 5 ml de PBS estéril e centrifugar a 280 xg durante 5 min.
10. Remover o sobrenadante e ressuspender em 500-1.000 ul de PBS estéril, 2 mM de EDTA.
11. Avaliar o número de células e viabilidade utilizando azul de tripan.
12. Ajustar a contagem de células a 1 milhão / ml em PBS 2 mM de EDTA.

3. A coloração da superfície

1. Transferir 100 uL de suspensão de células a 1x10 ⁶ ml / por teste de fluxo de tubos de 12x75 mm.
2. Adicionar uma quantidade adequada de anticorpos. Controles isotipo devem ser utilizados para cadade anticorpos (ver Tabela 3).
3. Incubar durante 30 min em gelo.
4. Adicionar 2 ml de PBS 2 mM de EDTA a cada tubo de fluxo.
5. Centrifugar a 200 xg durante 4 min, decantar e blot.
6. Ressuspender o sedimento em 300 ul de PBS 2 mM de EDTA.
7. Adicionar 10 ul de corante de viabilidade 7AAD a cada tubo e incubar durante pelo menos 15 min em gelo.
8. Analisar por citometria de fluxo.

4. Aquisição e Análise de Citometria de Fluxo

As especificidades da aquisição e análise de dados de fluxo são o instrumento-dependente. Representante amostras negativas são executados e configurações do instrumento estabelecido para frente (tamanho) e lateral (granularidade) dispersão. Este padrão de dispersão permite que o usuário final para ver todas as células na amostra, incluindo detritos. A região é normalmente desenhada em torno das células de interesse. (Figura 4a) Definições são então estabelecidos para todos os detectores de fluorescência necessários para posicionar as células negativas dentro da primeira década do afenredo intensidade luorescence. Quando mais de um corante ou fluorocromo é usada, simples controles manchadas devem ser executados para estabelecer os valores de compensação de cor (subtração de interferir emissões de fluorescência). Ao executar as células vivas, um corante de viabilidade, como 7-AAD (7-amino-actinomicina D - 488/emission excitação 655) é usado e uma segunda região traçada para excluir as células mortas (Figura 4b). Ambas as regiões são aplicados a uma análise mais aprofundada das amostras.

5. Auto-renovação de Ensaio

O ensaio de chave que é muito facilitada pelo crescimento clonal esfera é o ensaio in vitro da capacidade de auto-renovação, o ensaio de diluição limitante. Tumorspheres são dissociados e distribuídos em diluições para baixo para uma única célula por poço, e a taxa de formação de esfera posterior ao longo de 7 dias em cultura, é calculada. No dia 7, a percentagem de poços não contendo esferas para cada densidade de plaqueamento de células (F ₀₎ é calculada e traçadacom o número de células por poço (x). O número de células necessário para formar pelo menos um tumorsphere em cada poço é determinada a partir do ponto em que a linha cruza o nível de 0,37 (F ₀ = ^e-x). Em uma distribuição de Poisson de células, F ₀ = 0,37 corresponde à diluição de uma célula por cavidade, de modo que este cálculo (37% intersectam) reflecte a frequência de células estaminais clonogénicas na população celular total (Figura 5).

6. Single Cell RT-PCR

Células individuais de diferentes populações são classificadas pela Beckman Coulter MoFlo XDP em sites de reação em um slide AmpliGrid (Beckman Coulter gato # AG480F). Única célula RT-PCR é realizada utilizando AmpliGrid Único One Step RT-PCR system (Beckman Coulter cat # OAX04515) de acordo com as especificações do fabricante. Resumidamente, uma única célula é depositado em cada local de reacção de um slide AmpliGrid, a presença de uma única célula em cadalocal de reacção confirmada por microscopia. A transcrição reversa (RT) é realizado imediatamente após a triagem para evitar que a amostra seja comprometido. A RT mistura principal é preparada, de acordo com as instruções do kit (Tabela 4). Foram utilizados 0,03 ul de 25 uM iniciadores aleatórios (Promega) por reacção, 1 uL de mistura principal é adicionado ao meio de cada local de reacção. Isto é imediatamente revestido com 5 ul de solução de vedação (Beckman Coulter cat # OAX04503). Usando uma lâmina AmpliSpeed ​​cycler (Beckman Coulter, cat # OAX04101), as lâminas são incubadas a 25 ° C durante 10 min, 42 ° C durante 10 min, e 55 ° C durante 45 min. Após a transcrição reversa, 3 ul de DNase / RNase livre de água são adicionados a cada local de reacção, e toda a mistura transferida para um tubo de PCR (1 tubo / local). Em uma placa de PCR, num volume de reacção de 10 uL é utilizado para a PCR quantitativa: 8 uL qPCR master mix (5 ul Sybr Green (Quanta), 1 ul de água, 1 ul de 10 uM para a frente e de mistura iniciadora reversa) mais 2 μ l da mistura de RT. Para a quantificação em tempo real, as amostras são executados em um termociclador BioRad usando o seguinte programa: 95 ° C durante 10 min, 45 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 60 segundos, 72 ° C durante 60 segundos, seguido por 10 min a 72 ° C e análise da curva de fusão. Valores Ct foram determinados utilizando Opticon Monitor 3 (BioRad). Três genes pode ser avaliada por célula, incluindo o GAPDH como gene housekeeping. A expressão genética é normalizado para a expressão de GAPDH, de acordo com a ^2-ΔCt. Pelo menos uma dezena de células individuais de uma mesma população do mesmo tipo podem ser utilizados como biológico replica para compensar a falta de técnicas repetições.

7. Resultados representativos

A Figura 1 mostra uma ressonância magnética (RM) de um paciente com um representante GBM. Amostras de tumores cerebrais são obtidos de pacientes que consentiram imediatamente após a cirurgia, conforme aprovado pelo Ministério da Saúde Hamilton Ciências / Saúde McMaster Sciences Pesquisa Conselho de Ética. Uma parte de cada amostra é dado ao neuropatologista para o diagnóstico clínico de rotina. A amostra restante é processada como se mostra na Figura 2. As células de tumor, uma vez que, semeadas em meios completos de células estaminais neurais, com factores de crescimento, tumorspheres forma como mostrado na Figura 3.

As células tumorais são marcadas com marcadores neurais de superfície de células estaminais CD133 e CD15 e analisados ​​por citometria de fluxo como mostrado na Figura 4.

Células isoladas a partir de diferentes populações de por exemplo, CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- são então ordenados em placas de 96 poços (Figura 5a) ou em slides AmpliGrid (Figura 6a).

Na placa de 96 poços, as células individuais que possuem a capacidade de auto-renovação (por exemplo, células CD133 +), (Figura 5b), pode formar tumorspheres (Figura 5c), seguindo INCUexacerbação. Um gráfico de auto-renovação pode ser representada (Figura 5d) por contagem do número de esferas formadas por poço. Células individuais ordenadas no sítio da reacção da corrediça Ampligrid (Figura 6a). O RNA extraído a partir de células isoladas pode ser transcrito de forma inversa utilizando o AmpliSpeed ​​Advalytix (Figura 6b). O ADNc obtido é usado para realizar em tempo real de RT-PCR (Figura 6c).

Figura 1. A ressonância magnética (RM) de um GBM paciente. Exame de ressonância magnética do cérebro de uma menina de 16 anos com uma história de um mês de duração de dor de cabeça e uma história de uma semana de letargia, vômitos e visão turva. Seqüência FLAIR axial mostra um grande bi-hemisférica GBM ("borboleta").

Figura 2. Processamento de tumor cerebral. Amostras de tumores cerebrais são obtaINED de consentir pacientes imediatamente após a cirurgia. Eles são dissociados mecanicamente como se mostra (a) e, em seguida, são enzimaticamente dissociada em aCSF com Liberase por incubação numa incubadora de balanço 30 rpm a 37 ° C durante 15 min (b).

Figura 3. Populações BTIC formar tumorspheres em cultura. Células cerebrais Dissociated tumorais, semeadas em meios completos células-tronco neurais com fatores de crescimento formam tumorspheres.

Figura 4. A análise citométrica de fluxo de populações BTIC. (A) Encaminhar versus propriedades de dispersão laterais proporcionam uma imagem de todas as células, incluindo detritos (b) As células que coram com o corante de viabilidade 7-AAD são excluídos da análise. (C) A posição dos quadrantes estatística é determinada utilizando controlos isotípicos apropriados (d) As células de tumor coradas com superfície markers CD15-PE e CD133-APC. (D) MoFlo seleccionador de células XDP. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 5. Limitando a análise de diluição BTICs revela a sua capacidade de auto-renovação. (A) Células de diluições variadas são classificados em 96 poços contendo 200 ul de NSC para (b) uma única célula por poço. (C) Após um período de incubação de 7 dias, um tumorsphere é formado. A morfologia das tumorspheres secundárias é idêntico ao do tumorspheres primárias. (D) A média x-intercept valores podem ser calculados a partir de análise de diluição limitante para cada subtipo de tumor para revelar o número de células necessário para formar pelo menos um tumorsphere por poço.

Figura 6. A análise da expressão do gene de uma única célula BTICÉ possível, utilizando tecnologia de célula única de RT-PCR. (a) as células individuais de uma população BTIC podem ser classificados em lâminas AmpliGrid. (B) a síntese de ADNc é realizada em células individuais em slides AmpliGrid usando o AmpliSpeed ​​Advalytix. (C) em tempo real quantitativa de PCR é realizada no ADNc sintetizado a partir de células individuais BTIC.

2M NaCl	62 ml
1M KCl	5 ml
1M de MgCl2	3,2 ml
155 mM de NaHCO3	169 ml
A glicose 1M	10 ml
108 mM CaCl 2	0,9256 ml
Purelab Ultra H 2 0	749,84 ml

Tabela 1 fluido cerebrospinal artificial (aCSF) -. 1,000 ml.

Mídias em estoque basais	500 ml
01:01 DMEM: F12	480 ml
Suplemento N2	5 ml
HEPES 1M	5 ml
Glicose	3,0 g
N-acetilcisteína (60 ug / ml)	1 ml
Factor-1 a sobrevivência neural (NSF-1)	10 ml

Tabela 2. Meio das células estaminais neurais.

Mídia NSC completas (feito logo antes do uso):
Meios basais NSC + 20 ng / ml de EGF (factor de crescimento epidérmico) + 20 ng / ml de bFGF (factor de crescimento de fibroblastos básico) + 10 ng / ml LIF (factor inibidor de leucemia) * + 10 ul / ml de antibiótico-antimicótico

* Factor inibidor da leucemia (LIF): Este reagente de Millipore contém uma citocina interleucina classe 6, um protein que suprime diferenciação espontânea de células estaminais que promovem a manutenção a longo prazo de culturas de células estaminais.

Anticorpos	Fornecedor / CAT #	il / teste (em 100 uL)
CD133 / 2 APC (293C3)	Miltenyi Biotec/130-090-854	5
IgG2b APC (controlo de isotipo)	Miltenyi Biotec/130-092-217	5
CD15PE	Beckman Coulter/IM1954U	5
IgG2a PE (controlo de isotipo)	Beckman Coulter/A09141	5
7AAD	Beckman Coulter/A07704	10

Tabela 3. Anticorpos de fluxo.

Componente	Volume (uma reacção)	Volume (48 reacção)
2x Único Célula de Armazenamento reacção RT	0,50 ul	30,0 ul
Inibidor de RNase (10 U ^ l /)	0,02 ul	1,2 ul
5X única célula RT enhancer	0,15 ul	9,00 ul
Única célula RT Enzyme Mix	0,04 ul	2,4 ul
Advablue (OAX04227)	0,1 ul	6,00 ul
Água livre de nuclease	tornar-se a 1 ul	fazer até 60 ul

Tabela 4. Composição da RT master mix para RTPCR única célula (cat # OAX04515).

Discussão

O cancro da hipótese de células estaminais ^10, com base no trabalho em leucemia ^21, cancro da mama e cancro do cérebro ^{11 4,5,} sugere que apenas uma fracção relativamente pequena de células do tumor, as células estaminais chamadas cancerosas, possuem a capacidade de proliferar e de auto extensivamente -renovar. A maioria das células tumorais perdem a capacidade de proliferar e de se auto-renovar como se diferenciam em células que se tornam a assinatura fenotípica do tumor. Loca...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
01:01 DMEM: F12	Invitrogen	11320-082
Suplemento N2	Invitrogen	17502-048
HEPES 1M	Wisent	330-050 EL-
Glicose	Invitrogen	15023-021
N-acetilcisteína	Sigma Aldrich	A9165-25g
Neural sobrevivência fator -1 (NSF-1)	Lonza Clonetics	CC-4323
Fator de crescimento epidérmico (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
Factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF)	Invitrogen	PHG0261
Factor inibidor de leucemia (LIF)	Millipore	LIF1010
Antibiótico / micótico	Wisent	450-115 EL-
Liberase TM	Roche	05 401 119 001
Solução de cloreto de amónio	Stem Cell Technologies	07850