Обработка первичной опухолевой ткани мозга для стволовых клеток Анализы и поток Сортировка

Резюме

Выявление опухоли головного мозга начала клеток (BTICs), редкие клетки в гетерогенной опухоли, обладающих свойствами стволовых клеток, обеспечивает новому взглянуть на человека патогенезе опухоли головного мозга. Мы усовершенствовали конкретных условиях культуры для обогащения BTICs, и мы обычно используют проточной цитометрии для дальнейшего обогащения этих групп населения. Самообновление Анализы и расшифровка анализа одной ячейки RT-PCR впоследствии могут быть выполнены на этих изолированных клеток.

Аннотация

Опухоли головного мозга, как правило, состоят из морфологически различных клеток, которые выражают различные нейронные маркеры линии. Лишь относительно небольшая часть клеток в опухоли со свойствами стволовых клеток, называемых опухолей головного мозга начала клеток (BTICs), обладают способностью дифференцироваться по нескольким линиям, самообновлению и инициировать опухолей в естественных условиях. Мы обратились условий культивирования первоначально использовались для нормальных нервных стволовых клеток (НСК) на различные человеческие опухоли головного мозга и обнаружили, что эта культура метод специально выбирает для стволовых как и население. Бессывороточной среде (NSC) позволяет для поддержания недифференцированного состояния стволовых клеток, а также добавление шФРФ и EGF позволяет за распространение нескольких мощных, самообновлению, и расширяемой tumorspheres.

Для дальнейшего характеризуют BTIC населения каждой опухоли, мы оцениваем маркеры клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии. Мы также можем разобраться населения, представляющие интерес для более конкретных характеризующихчения. Самообновление анализы выполняются на одном BTICs сортируются в 96-луночные планшеты, формирование tumorspheres после инкубации при температуре 37 ° C указывает на присутствие стволовых клеток-предшественников или. Несколько номеров клетки частности населением также может быть отсортирован в разных скважин для ограничения разведения анализ, анализ самообновления мощности. Мы также можем изучить дифференциальное выражение гена в определенной популяции клеток с помощью одной ячейки RT-PCR.

Следующие протоколы описывают наши процедуры для диссоциации и культивирования первичных человеческих образцов для обогащения BTIC населения, а также диссоциация tumorspheres. Кроме того, включены протоколы для окрашивания для анализа потока цитометрии и сортировки, самообновлению анализы, и одна ячейка RT-PCR.

Введение

Опухоли головного мозга являются одними из самых агрессивных и гетерогенных рака известна в людях. Хотя их раннего выявления и диагностики были способствовать современных нейро-технологий визуализации, мы все еще не имеют лечебных терапий для многих опухолей головного мозга, в частности, для диффузных, инвазивные те, или те, которые расположены в глубине мозга.

Опухоли головного мозга представляют ведущей причиной смертности от рака у детей в связи с их крайне агрессивно и часто неизлечимые природы. Глиобластомы (GBM), наиболее распространенные первичные опухоли головного мозга у взрослых, является одной из наиболее агрессивных злокачественных опухолей человека, опасается за свою равномерно роковой прогноз ^1. Это очень злокачественная опухоль астроцитов (ВОЗ степень 4) обычно происходит в полушариях головного мозга у взрослых, а также может возникнуть у маленьких детей и младенцев. Его рост является быстрым и инфильтративных и диагностики патологических функции включают в себя ядерный плеоморфизм, капиллярная пролиферация и некрозы ^2,3. Для AdulTS с недавно диагностированной глиобластомой, медиана выживаемости редко выходит за пределы 12 месяцев, ^1, в целом плохо ответы на все терапевтические методы. Мы отметили, что существует множество функциональных и генетических сходств разделяет соматических стволовых клеток и раковых клеток, и что молекулярные пути, которые регулируют нормальное развитие мозга часто дизрегуляции в рак. При применении стволовых парадигм биологии клетки к изучению опухолей головного мозга, мы были первыми исследователями перспективно идентифицировать и очистить субпопуляции клеток из человеческих GBMS которые выставлены стволовых клеток свойствами распространения, самообновления и дифференцировки в пробирке ⁴ и в естественных условиях ^5. Мы обратились условий культивирования и анализов первоначально использовались для характеристики нормальных нервных стволовых клеток (НСК) в пробирке ^6,7 до нескольких детей и взрослых опухоли головного мозга, и обогащенные для этих стволовых клеток, подобных по мобильному сортировки для нервной маркер на поверхности клеток предшественников CD133 ^{8 ,}9. CD133 + опухоль головного мозга фракция содержала клетки, которые имели гораздо более высокую частоту раковых клеток, чем CD133-фракции в NOD-SCID мышей мозг ^5,10. Это официально установлено, что только в редких подмножество мозге опухолевых клеток со свойствами стволовых клеток опухоли инициирования, зарабатывая их название "опухоль мозга начала клеток" или "BTICs". Роман идентификации BTICs обеспечивает новому взглянуть на человеческое опухолей головного мозга, давая сильную поддержку для клетки раковых стволовых гипотезу ^10-13 в качестве основы для многих солидных опухолях, и устанавливает новый сотовый мишенью для более эффективных методов лечения рака ^14-20. Терапия, направленные на убийство большую часть опухоли может пропустить редкие стволовые как фракции, позволяя опухоль продолжает расти. Терапия, направленные на убийство раковых клеток стволовые может обеспечить лучшее лечение и прогноз для пациентов с опухолями головного мозга.

С целью изучения BTIC населения, мы усовершенствовали нашу cultuповторно протоколов конкретно выбрать для клеточных популяций в человеческих опухолях головного мозга, которые обладают свойствами стволовых клеток. Бессывороточной, нейронные стволовые клетки (НСК) среды позволяет для поддержания недифференцированного состояния стволовых клеток, а кроме основного фактора роста фибробластов (шФРФ), эпидермальный фактор роста (EGF), и лейкемия ингибирующего фактора (LIF) позволяет распространение нескольких мощных, самообновлению, и расширяемой человека tumorspheres. Здесь мы описываем методы, участвующих в обработке первичных опухолей головного мозга и культивирования их в среде НСК для обогащения BTIC населения. Мы назвали нашу экспериментальную модель системы "BTIC изолятов пациентов", чтобы подчеркнуть тот факт, что эти клетки лишь в минимальной степени культивируют в стволовые ячейку условия, чтобы выбрать для населения стволовых клеток. Последующие immunolabelling из BTIC населения по ключевым стволовых клеток маркеры, такие как CD133 и CD15 и анализа проточной цитометрии также описан. Затем мы обсудим предельного разбавления анализа,которая помогает в изучении самообновления потенциал BTICs. Наконец, мы исследуем анализ экспрессии генов этих редких клеток сортировки одиночных камерах на AmpliGrid слайдов и выполнение одной ячейке RT-PCR. Эти методы применимы также к другим опухоли головного мозга, таких как медуллобластомой, эпендимома и детских глиомы.

протокол

1. Культура ткани головного мозга Опухоль

1. Добавить 200 мкл талой Liberase (Roche Applied Science) в 15 мл искусственной CSF (ACSF-см. Таблицу 1) и поместить в 37 ° С водяной бане. Liberase TM представляет собой смесь протеолитических ферментов, используемых отделить первичные образцы тканей, а также культурные tumorspheres. В отличие от трипсина-EDTA, Liberase метод сохраняет CD133 поверхностный антиген. Для образца ткани около 0,5 см ^3, мы используем 200 мкл Liberase. Если ткань меньше, мы используем 100, ул.
2. Принесите хлорида аммония решения (технологии стволовых клеток) до комнатной температуры. Раствор хлорида аммония мягко лизирует эритроциты с минимальным влиянием на другие клетки. Он не содержит фиксатор.
3. В стерильных бокс биологической безопасности, добавляют 5 мл ACSF к образцу контейнер, вихрем для полоскания тканей, а затем пипеткой прочь. Этот шаг поможет удалить эффект красных кровяных клеток (эритроцитов).
4. Передача ткани опухоли головного мозга в стерильный 100 мм Петри диш.
5. Использование тонких ножниц или скальпеля и пинцета, разбивку тканей суспензии консистенции.
6. Сбор образцов с использованием 10 мл регулярные пипетки или щипцы и передачи фрагментов в пробирку, содержащую предварительно нагретой ACSF с Liberase.
7. Место на инкубатор-шейкер (30 мин) и установить до 37 ° C, в течение 15 мин.
8. Фильтр тканей лизат через 70 мкм фильтр клетки в 50 мл трубки Falcon.
9. Побочные фильтрата вниз на 280 мкг в течение 5 мин.
10. Удалить супернатант тщательно и оценить размер и цвет в результате осадок клеток: гранулы, которые являются розовые или красные указывают на увеличение числа красных кровяных клеток.
11. Ресуспендируют осадок в 1 мл PBS.
12. Добавить соответствующее количество хлорида аммония раствор (4-12 мл) на основе гранул размером и красным загрязнения клетки (раствор хлорида аммония очень нежный и увеличение суммы не являются вредными для клеток, кроме эритроцитов).
13. Выдержите при комнатной температуре в течение 5 мин.
14. Спин клетоквниз на 280 мкг в течение 5 мин.
15. Мыть раз с 10 мл стерильной PBS.
16. Ресуспендируют в 5 мл НСК полной среде (табл. 2) и передачи ультра-низким связыванием 60 мм культуре ткани пластины (Corning). Мы используем ультра-низким связыванием пластин культуры с ковалентно связанными гидрогель поверхностей, которые являются гидрофильными и нейтрально заряженных, чтобы свести к минимуму прикрепления клеток-опосредованной дифференциации.

Для первых дней в культуре, не меняют СМИ: пополнить только с 1-2 мл средства массовой информации по мере необходимости, а затем продолжать соблюдать культуру и средства массовой информации, когда изменение цвета среды становится слегка желтой.

2. Tumorsphere диссоциации для проточной цитометрии

1. Оцените tumorspheres под микроскопом: если сфера размером> 100 мкм, диссоциация рекомендуется как большие сферы может стать некротических в центре.
2. Передача культуры в 15 мл коническую трубку.
3. Добавить 2-3 мл стерильного PBS для промывки пластины тщательно и добавить в конической трубе.
4. Центрифуга при 280 мкг в течение 5 мин.
5. Удалите супернатант и ресуспендируют в 1 - 2 мл стерильной PBS.
6. Добавить 10 мкл Liberase.
7. Инкубировать при 37 ° С водяной бане в течение 3 мин. Удалите и визуально оценить подвеску, если несколько сгустков видел, мягко растирают использованием 1.000 мкл кончика пипетки.
8. Если слипания остается, инкубации в течение еще 1-2 мин.
9. Вымойте клеток путем добавления 5 мл стерильной PBS и центрифугирования при 280 мкг в течение 5 мин.
10. Удалите супернатант и ресуспендируют в 500-1000 мкл стерильной PBS +2 мм ЭДТА.
11. Оценка числа клеток и жизнеспособность с использованием трипанового синего.
12. Отрегулируйте клеток до 1 млн / мл в PBS +2 мм ЭДТА.

3. Поверхностное окрашивание

1. Передача 100 мкл 1х10 ⁶ / мл клеточной суспензии на тест, чтобы 12x75 мм трубами потока.
2. Добавить соответствующее количество антител. Контрольной Изотип должна использоваться для каждогоантитела (см. таблицу 3).
3. Выдержите в течение 30 минут на льду.
4. Добавить 2 мл PBS +2 мм ЭДТА в каждом потоке трубку.
5. Центрифуга при 200 мкг в течение 4 минут, сцедить и промокните.
6. Ресуспендируют осадок в 300 мкл PBS +2 мм ЭДТА.
7. Добавить 10 мкл 7AAD красителя жизнеспособность в каждую пробирку и инкубировать в течение 15 мин на льду.
8. Анализ методом проточной цитометрии.

4. Поток Приобретение цитометрии и анализа

Специфика сбора и анализа потока данных инструмента-зависимыми. Представитель отрицательных проб выполняются и настройки прибора, установленного для Forward (размер) и Side (детализации) разброс. Этот разброс шаблон позволяет конечному пользователю просматривать все клетки в образце, в том числе мусора. Региона, как правило, обращается вокруг клетки интерес. (Рис. 4а), Настройки, затем установлена ​​для всех флуоресценции детекторы необходимы для размещения негативных клеток в течение первого десятилетия AFluorescence участок интенсивности. Когда более чем один краситель или флуорохромом использовании одного окрашенные элементы управления должны быть запущены для создания цветовой коррекцией значений (вычитание помехи флуоресценции выбросов). При запуске живых клеток, жизнеспособность красителей, таких как 7-AAD (7-амино-актиномицин D - возбуждение 488/emission 655) используется и вторая области обращается, чтобы исключить мертвые клетки (рис. 4б). Оба этих регионов применена к любому дальнейшему анализу образцов.

5. Самообновление анализа

Ключевым анализа, который в значительной степени способствует клонального роста сферы в пробирке испытание самообновления мощности, предельное разведение анализа. Tumorspheres разобщены и распространен в разведениях до одной клетки на лунку, и скорость последующего формирования сфере в течение 7 дней в культуре рассчитывается. На 7-й день, процент скважин не содержащих сферы для каждой плотности покрытия ячейки (F _0), рассчитаны и построеныпо отношению к числу клеток на лунку (х). Число клеток, необходимых для формирования хотя бы одного tumorsphere в каждой скважины определяется от точки, в которой линия пересекает уровень 0,37 (F ₀ = ^е-х). В распределению Пуассона клеток, F ₀ = 0,37 соответствует разбавлению одной ячейки на ячейку, так что этот расчет (37% пересекаются) отражает частоту клоны стволовых клеток в популяции в целом ячейки (рис. 5).

6. Single Cell RT-PCR

Отдельные клетки из разных популяций сортируются по Beckman Coulter MoFlo XDP на реакцию сайтов на слайде AmpliGrid (Beckman Coulter кошки # AG480F). Single Cell RT-PCR осуществляется с помощью AmpliGrid одноместный One Step RT-PCR система (Beckman Coulter кошки # OAX04515) в соответствии со спецификациями завода-изготовителя. Короче говоря, одной клетки на хранение в каждой реакции сайте слайд AmpliGrid, наличие одной ячейки в каждойРеакция сайт подтверждается микроскопии. Обратной транскрипции (RT) выполняется сразу же после сортировки, чтобы предотвратить образца от несанкционированного доступа. Смеси RT мастера готовят свежий, в соответствии с комплектом инструкций (табл. 4). Мы использовали 0,03 мкл 25 мкМ случайных праймеров (Promega) на реакцию, 1 мкл смеси мастера добавляют в центр каждой реакции сайте. Это сразу же покрыты 5 мкл уплотнительной решение (Beckman Coulter кошки # OAX04503). Использование AmpliSpeed ​​слайд циклер (Beckman Coulter, кошки # OAX04101), слайды инкубировали при 25 ° С в течение 10 мин, 42 ° С в течение 10 мин, 55 ° С в течение 45 мин. После обратной транскрипции, 3 мкл ДНКазы / РНКазы без воды добавляют к каждой реакции сайте, и всю смесь переносят в пробирку ПЦР (1 труба / сайт). В пластине ПЦР, реакция объемом 10 мкл используют для количественной ПЦР: 8 мкл КПЦР Master Mix (5 мкл SYBR Green (Quanta), 1 мкл воды, 1 мкл 10 мкМ прямого и обратного смеси грунтовки) плюс 2 &му; л смеси RT. Для реальном времени количественный, образцы будут работать на BioRad циклер с помощью следующей программе: 95 ° C в течение 10 мин, 45 циклов 95 ° C в течение 30 сек, 60 ° С в течение 60 сек, 72 ° C в течение 60 секунд, затем на 10 мин при 72 ° C и анализ кривых плавления. Ct значения были определены с использованием Opticon Monitor 3 (BioRad). Три гена может быть оценена на ячейку, в том числе GAPDH как гена домашнего хозяйства. Экспрессия генов нормирована на выражение GAPDH, в соответствии с ^2-ΔCt. По крайней мере, десятка одиночных клеток одного и того же населения из того же рода могут быть использованы в качестве биологического повторяет, чтобы компенсировать отсутствие технических повторов.

7. Представитель Результаты

На рисунке 1 показана магнитно-резонансная томография (МРТ) представителя пациента с GBM. Образцы опухоли головного мозга получают от согласию пациентов сразу после операции, утвержденной Hamilton Health Sciences / МакМастер Здоровье Sciences по этике исследований Совета. Часть каждого образца дается к невропатологу для рутинного клинического диагноза. Остальные образцы обрабатываются как показано на рисунке 2. Опухолевых клеток, раз помещали в полном нейронных стволовых клеток СМИ с факторами роста, формы tumorspheres, как показано на рисунке 3.

Опухолевые клетки помечены с помощью нейронной поверхности стволовых клеток маркеры CD15 CD133 и и анализировали с помощью проточной цитометрии, как показано на рисунке 4.

Отдельные клетки из различных популяций, например, CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- затем сортируются в 96-луночные планшеты (рис. 5а) или в AmpliGrid слайдов (рис. 6а).

В 96 лунками, одно клетки, которые обладают самообновления мощности (например, CD133 + клеток), (рис. 5б), могут образовывать tumorspheres (рис. 5, в) после инкубаторывозмущений. Самообновления график может быть построен (рисунок 5г) путем подсчета числа сфер формируются на лунку. Отдельные клетки сортируются по реакции сайте слайд Ampligrid (рис. 6а). РНК, выделенная из одной клетки может быть обратной транскрипции помощью Advalytix AmpliSpeed ​​(рис. 6б). КДНК, полученной используется для выполнения в режиме реального времени RT-PCR (рис. 6).

Рисунок 1. Магнитно-резонансная томография (МРТ) пациентов GBM. МРТ головного мозга 16-летняя девушка с месячной истории головную боль и одна неделя истории рвота, вялость и визуального размытия. Осевой последовательности FLAIR показывает большой би-полушария («бабочка») GBM.

Рисунок 2. Опухоль головного мозга обработки. Образцы опухоли головного мозга являются obtaINED от согласию пациентов сразу после операции. Они механически диссоциированных как показано на рисунке (а), а затем ферментативно диссоциированных в ACSF с Liberase путем инкубации в 30 оборотов в минуту качалки инкубаторе при 37 ° С в течение 15 мин (б).

Рисунок 3. BTIC населения образуют tumorspheres в культуре. Диссоциированные мозге опухолевых клеток высевали в полном нейронных стволовых клеток СМИ с факторами роста образуют tumorspheres.

Рисунок 4. Проточной цитометрии анализа BTIC населения. (А) вперед по сравнению с разбросом свойств сторона обеспечивает изображение всех клеток, в том числе мусора (б) Клетки, которые окрашиваются жизнеспособность красителя 7-AAD исключены из анализа. (С) Положение статистических квадрантов определяется с помощью соответствующего контроля Изотип (г) Опухолевые клетки окрашивают поверхность маrkers CD15-PE и CD133-APC. (Г) Moflo XDP клетки сортировщика. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 5. Ограничение разведения анализ BTICs показывает их самообновление мощности. (А) Клетки различных разведениях разбиты на 96 лунок, содержащих 200 мкл НБК (б) одной ячейки на ячейку. (C) После 7-дневного инкубационного периода, tumorsphere формируется. Морфология вторичном tumorspheres идентична первичной tumorspheres. (Г) средняя X-перехват значения могут быть вычислены из предельного разбавления анализа для каждого подтипа опухолей выявить количество клеток, необходимых для формирования хотя бы одного tumorsphere на лунку.

Рисунок 6. Анализ экспрессии генов из одной клетки BTICможно с помощью одной ячейки RT-PCR технологии. (а) Одиночные клетки от BTIC населения могут быть отсортированы на AmpliGrid слайдов. (Б) синтез кДНК проводят на одной клетки на слайдах AmpliGrid помощью Advalytix AmpliSpeed. (С) Количественная ПЦР реального времени осуществляется на ДНК синтезируются из одного BTIC клеток.

2М NaCl	62 мл
1M KCl	5 мл
1M MgCl 2	3,2 мл
155 мм NaHCO 3	169 мл
Глюкоза 1M	10 мл
108 мм CaCl 2	0,9256 мл
PURELAB Ультра H 2 0	749,84 мл

Таблица 1 Искусственный цереброспинальной жидкости (ACSF) -. 1.000 мл.

Базальная со СМИ	500 мл
1:01 DMEM: F12	480 мл
N2 добавка	5 мл
1M HEPES	5 мл
Глюкоза	3,0 г
N-ацетилцистеин (60 мкг / мл)	1 мл
Нейронные фактор-1 выживание (NSF-1)	10 мл

Таблица 2. Нейронные СМИ стволовых клеток.

НСК полной среде (производство свежей до использования):
НСК основные среды + 20 нг / мл EGF (эпидермальный фактор роста) + 20 нг / мл шФРФ (основной фактор роста фибробластов) + 10 нг / мл LIF (фактор ингибирования лейкемии) * + 10 мкл / мл антибиотик противогрибкового

* Лейкемия ингибирующего фактора (LIF): Этот реагент содержит от Millipore интерлейкина-6 класс цитокинов, пр.otein которые подавляют спонтанную дифференцировку стволовых клеток поощрения долгосрочного поддержания культур стволовых клеток.

Антитела	Поставщик / CAT #	мкл / тест (в 100 мкл)
CD133 / 2 APC (293C3)	Miltenyi Biotec/130-090-854	5
IgG2b APC (Изотип управления)	Miltenyi Biotec/130-092-217	5
CD15PE	Beckman Coulter/IM1954U	5
IgG2a PE (Изотип управления)	Beckman Coulter/A09141	5
7AAD	Beckman Coulter/A07704	10

Таблица 3. Поток антител.

Компонент	Том (1 реакция)	Том (48 реакций)
2x Single Cell RT реакции буфера	0,50 мкл	30,0 мкл
Ингибитор РНКазы (10 ед / мкл)	0,02 мкл	1,2 мкл
5X Single Cell RT усилитель	0,15 мкл	9,00 мкл
Single Cell RT ферментов Mix	0,04 мкл	2,4 мкл
Advablue (OAX04227)	0,1 мкл	6,00 мкл
Нуклеазы свободной воды	сделать до 1 мкл	составляют до 60 мкл

Таблица 4. Состав RT мастер микс для одного сотового ОТ-ПЦР (Cat # OAX04515).

Обсуждение

Раковой клетки стволовые гипотеза ^10, по работе в лейкозом ^21, рак молочной железы ¹¹ и раком мозга ^4,5, показывает, что лишь сравнительно небольшая часть клеток в опухоли, называемые раковые стволовые клетки, обладающие способностью широко распространяться и самост...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
1:01 DMEM: F12	Invitrogen	11320-082
N2 добавка	Invitrogen	17502-048
1M HEPES	Зубр	330-050-EL
Глюкоза	Invitrogen	15023-021
N-ацетилцистеин	Sigma Aldrich	A9165-25G
Нейронные фактор выживания -1 (NSF-1)	Lonza Clonetics	CC-4323
Эпидермальный фактор роста (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
Основной фактор роста фибробластов (шФРФ)	Invitrogen	PHG0261
Лейкемия ингибирующего фактора (LIF)	Millipore	LIF1010
Антибиотик / грибковым	Зубр	450-115-EL
Liberase TM	Roche	05 401 119 001
Раствор хлорида аммония	Стволовые клетки технологий	07850