切向流超：A胶体银纳米粒子的大小选择与集中“绿色”方法

摘要

切向流超滤（TFU），是一个循环的生物样品的重量为基础的分离方法。 TFU适于大小选择（1-20 nm直径）和高度集中大量的多分散性的银纳米颗粒（4 L的15.2微克毫升 ^{-1 -1}），以最小的聚集。

摘要

如今，AGNPS被广泛用于制造消费类产品，水消毒剂^，2疗法^，1，3和生物医学设备由于其强大的抗菌性能^。3-6这些纳米粒子的应用，我们强烈的AgNP大小和聚集状态的影响。存在许多挑战在受控制造⁷和未官能化的，同质的银奈米粒子从化学侵蚀性的上限/稳定剂或有机溶剂是免费的基于大小的隔离^{4,8 7-13}摆脱限制成本高的毒性试剂，或减少的AgNP合成或分离方法（ 例如 ，离心，尺寸相关的溶解度，尺寸排阻色谱法，等）的效率^。10,14-18为了克服这一点，我们最近发现，TFU允许更大的控制权的大小，浓度和（300克赖顿农业非点源污染的聚集态毫升15.3微克毫升^-1 198.7微克毫升^-1）下降到10毫升的¹⁹比传统的隔离方法，如超速离心。

TFU是常用的重量为基础的分离的蛋白质，病毒和细胞的再循环方法^。20,21简单地说，该液体样品通过中空纤维膜的孔径范围从1,000 kD的10 kD的一系列。较小的悬浮或溶解的样品中的成分将通过多孔隔板与溶剂（滤液）一起，而较大的成分被保留（滞留）。 TFU可能被认为是“绿色”的方法，因为它既不损害样品，也不需要额外的溶剂，以消除有毒过量的试剂和副产品。此外，TFU可能被应用到了大量的各种纳米粒子，作为疏水性和亲水性两种过滤器是可用的。

本研究的两个主要目标是：1）说明实验方面的的TFU方法通过一个被邀请的视频体验和2）表现出较大的胶体纳米粒子的体积和更小的体积，截留TFU方法的可行性。首先，unfuctionalized银奈米粒子（4升，15.2微克毫升^-1）的合成通过用NaBH ₄还原的AgNO ₃使用既定克莱顿方法^22,23。 AgNP多分散性，然后最小化通过使用50纳米的过滤器（460厘米^2），以除去银奈米粒子和AgNP-聚集体由两个100 kD的滤波器（200厘米²和20厘米^2）大于50nm，接着的3个步骤TFU集中银奈米粒子。有代表性的样品进行了表征，利用透射电子显微镜，紫外 - 可见吸收光谱法，拉曼光谱法，电感耦合等离子体发射光谱。最终阻滞高度集中（4毫升，8,539.9微克毫升^-1），但卑微的汇总和均匀银奈米粒子为1-20纳米的直径。这对应于约62％的银浓度收率。

研究方案

1。胶体银奈米粒子的合成

克莱顿法（略作修改，廉价的^）22的反应机制中很详细的描述，在辅助信息的参考帕维尔et.al一起的不需要的水解侧的NaBH _4，在室温或更高温度下反应²³

1. 12-24小时，在10％HNO _3的浴，然后清洁所有的玻璃器皿为4-12小时，在1.25 M的NaOH在40％的乙醇浴中，最后的高压釜。玻璃器皿应彻底漂洗最低五次后，用超纯水（17MΩ或更高）的酸和碱浴步骤。
2. 准备2 mM的NaBH ₄溶液的300毫升和100毫升1mM的AgNO ₃溶液，使用灭菌水冷却在10℃下的较低的温度下，将防止侧的NaBH ₄反应。
3. 加入300毫升2mM的NaBH ₄溶液到500毫升锥形反应烧瓶中续癌宁搅拌棒和烧瓶用铝箔包裹，以防止银氧化。将烧瓶放置在冰浴上搅拌盘和搅拌溶液10分钟，在325 rpm的转速下。
4. 总理25毫升滴定管具有列满的超纯水漂洗。浸水后，填写滴定管AgNO ₃溶液和包装用铝箔。
5. 在一个黑暗的房间中，添加1mM的AgNO ₃溶液50毫升，在连续搅拌下（ 图1A）的NaBH ₄溶液1滴秒^-1的速率。量的装置与一个“箔帐篷”的中间部分，以尽量减少在AgNO _3的除了曝光。 _硝酸银除了将需要30-40分钟。定期补货冰浴。
6. AgNO _3的除了完成后，补充冰浴，并继续搅拌该胶体溶液中的一个额外的45-50分钟。信号形成的胶体银奈米粒子颜色的变化由无色金黄色，这是表面等离子体共振最多AGNPS（ 图1B）的特征。
7. 一旦反应完成后，冷藏胶体。胶体AgNP批次可以合并在一个星期后的胶体保持一致， 即胶体溶液不会合并，和批量使用紫外-可见吸收光谱法和拉曼光谱的特点，以确定可能的聚集或污染物。

2。胶体银奈米粒子的特性

在Cary 50 UV-VIS-NIR分光光度计（Varian公司）和一个LabRamHR的800拉曼系统（HORIBA Jobin Yvon公司，公司），配有奥林巴斯BX41共焦拉曼显微镜，用于AgNP特性。 ，LabSpec的卡里WinUV软件第5节地8.0软件的数据收集和分析。

注：采集参数将必须进行优化FOR其他仪器模型。

通过紫外 - 可见分光光度法测定胶体银奈米粒子的表面等离子体共振

1. 填写1厘米³的一次性反应杯与克莱顿胶体和超纯水在1:10的体积比。填写另1 cm ^3的比色皿，用超纯水为空白的基线校正。擦拭与Kimwipe两个比色皿的外侧。
2. 设置的分光光度计吸光度模式从-0.5 Y最小的Y的最大值为1.0。设置X到200-800纳米扫描窗口，并选择较快的扫描速度为4800 nm的基线校正分钟^-1。
3. 将装满水的试管中，放入仪器和运行基准扫描。如有必要，重复上述步骤，直到一个非零的基线控制的实现。
4. 更换空比色皿与样品比色皿和启动的吸光度扫描收集的胶体样品的UV-Vis吸收光谱（ 图1C）。

通过拉曼光谱纯度的胶体银奈米粒子

由于视频演示（10-15分钟的视频）的时间限制和空间限制的协议文本（最多3页），这个实验的部分将不会进行录像。

5. 设定仪器参数设置如下：激励源（632.8 nm波长的He-Ne），过滤器（没有过滤器，样品〜17毫瓦的激光功率），共焦孔（300微米），光谱仪（730厘米^-1），全息光栅（600园/毫米），物镜（50倍长的工作距离空气物镜），曝光时间（30秒），和积累周期（5）。
6. 使用干净的移液管，以填补与胶体2毫升的石英比色皿，并轻轻地插入插头。使用Kimwipe的比色皿的表面，清洁过的指纹，污迹或胶体。显着降低，在显微镜阶段。选择50倍的物镜和搬上舞台，将试管。
7. 聚焦拉斯维加斯呃束上​​的AgNP的胶体直接的比色皿使用仪器和奥林巴斯相机的视频模式下的内壁。关闭室内灯光，并获得拉曼光谱（ 图1D）。

3。胶体银奈米粒子的大小选择和集中，通过切向流超滤（TFU）

甲KrosFlo II研究过滤系统（Rancho Dominguez的频谱实验室，CA）用于限制的AgNP的多分散性和浓缩（ 图2）。 TFU过程的三个步骤：（1）尺寸银奈米粒子和AgNP-聚集体的50-nm的直径和较大的使用50纳米MidiKros聚砜模块（460厘米^2），2）大小的选择和浓度的选择银奈米粒子1-20纳米的直径，使用一个100 kD的MicroKros的聚砜过滤器（20厘米^2）（ 图3），使用100 kD的MidiKros过滤器（200厘米^2），和（3）进一步减容。

第1步

1. 连接尺寸为17 MASTERFLEX进料管的蠕动泵，根据图2A。一个Y字路口和管交界处，将需要的设置。连接管到的50纳米MidiKros的模块。一定要确保管道过滤器采用拉链关系。选择管道尺寸17 SIZE按钮。
2. 选择使用DIR“按钮逆时针泵方向。确保MODE按钮是INT。
3. 前启动泵，泵的速度降低到低于300毫升分钟^-1。根据所使用的管材的尺寸，应调节的泵速率。它应该是一个小的设置，以允许操作者及时反应潜在的泄漏，但足够大的起动系统的效果仍然有。为了创建需要绘制胶体从水库进入管件和过滤器的真空，剪切，导致从过滤器的底部部分的Y结的顶部部分中的中间的油管油管。
4. 放置的管道部分，导致从储液瓶过滤器进入和夹紧用卡子或手的底部附近的Y结油管。打开在泵上。开始创建的真空虹吸胶体。
5. 一旦自由流动的液体通过管子，关闭泵，加入破碎的部分管与管接头和保护带拉链的关系。再次开启泵，继续过滤。
6. 检查油管回路的泄漏。如果发现泄漏，，调整装修或重新用扎带确保，修复泄漏。一旦管道系统是无泄漏，泵的流速可以增加，以不大于700毫升分钟^-1。该泵的速度值，根据管道大小，以避免管道发生故障，应进行优化。继续过​​滤在储液瓶，直到液体被耗尽到几乎为零。
7. 一旦完成过滤，收集滤液，其中包含银奈米粒子的直径为50纳米以及小型LER。滞留物可被保存根据具体AgNP应用程序以供进一步分析。

第2步

8. 冲洗管与2％HNO ₃和超纯水之前安装100 kD的MidiKros的过滤器使用相同的设置为50纳米的模块。
9. 重复步骤3.3使用100 kD的MidiKros的模块。
10. 一旦过滤完成后，收集的油管和过滤器（100-kD的滞留物）的内容。的体积应为约50毫升。

第3步

11. 连接大小14 MASTERFLEX管和100 kD的MicroKros的过滤器根据图2B蠕动泵。所有路口固定带拉链的关系。选择油管尺寸14对泵使用的大小按钮，降低泵的速度分^-1〜30毫升。
12. 开始过滤过程。检查油管回路的泄漏。如果发现泄漏，修复泄漏，通过调整合适婷安全与扎带。
13. 一旦管道系统是无泄漏，泵的流速可以增加，以不大于90毫升分钟^-1。继续过​​滤直至剩余的液体中的储液瓶包含最小量的浓缩物。
14. 通过除去从瓶泵仍在运行时的进料管，油管和过滤器的剩余的内容可以被收集到储液瓶。一旦管和过滤器的内容是在储液瓶，泵可被关闭。

4。银量的定量胶体银奈米粒子的电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）

每个胶体样品化学消化和使用A 710E光谱仪（Varian公司）用ICP-OES的银的量进行定量。银（ 图4）的线性回归的校准曲线是使用八个银标准（0，3构造，7，10，15，25，50，和100微克^L-1），制备了10000微克毫升^-1银痕量金属分析标准，（超低科学）。

1. 化学消解样品用HNO _3。的有代表性的样品是原来的胶体（步骤1），50-nm的滤液（步骤1），100-kD的滞留物（步骤2），和最后的100-kD的滞留物（步骤3）（ 图3）。
2. 应是稀释后的样品用2％的HNO ₃使用下面的体积比：1:1000原始胶体的1:1000的50-nm的滤液，1:25,000头100-kD的滞留物，和1:250,000为最后的100 kD的滞留物。为了防止银浸出，所有的样品应当存放在低密度的聚丙烯容器中。
3. ICP-OES仪器参数设置如下：对Ag（328.068 nm）的波长，功率（1.20千瓦），血浆流量（最小15.0 L ^-1），辅助流量（1.50 L最小^-1），雾化器压力（200千帕）。
4. 每个SA复制时间为10秒，mple应在一式三份。之间的测量的稳定化时间为15秒和30秒的样品的吸收延迟应该被使用。每个样品之​​间应采用的方法空白，以减少潜在的交叉污染。

5。胶体银奈米粒子的粒径分布，通过透射电子显微镜（TEM）

十字EM 208S TEM用于可视化的胶体银奈米粒子。电子显微照片，使用高解析度的加坦BIOSCAN相机捕获和分析在ImageJ软件²⁴

1. 用超纯水（1:100的体积比）稀释100 kD的滞留样本。存款原始胶体和稀释的100-kD的滞留物（步骤3）对20μl的300目福尔瓦被覆金网格（电子显微学）。允许电网在干燥器中干燥。在一天之内。
2. 设置在70千伏可视化农业非点源瞬变电磁仪的加速潜力。 Çapture电子显微照片（ 图5），使用高清晰度的摄像头，并保存为标签图像文件格式（TIFF）。

6。代表性的成果

胶体银奈米粒子的合成与表征

使用设置显示在图1A，成功地合成了4升的克赖顿胶体银奈米粒子。最终的胶体的特性的金黄色的颜色（ 图^1B）22，23在此胶体的UV-Vis吸收光谱有一个典型的尖锐，对称的表面等离子体振子峰（SPR），在394纳米（ 图1C）。原始克莱顿胶体和最后的100-kD的滞留物的拉曼光谱中提出只有三个振动模式，即在弯曲（1640 cm ^-1）的对称和非对称伸缩模式的H _{2 O（3245}厘米^-1和3390厘米^-1 ，分别）（ 图1D）。/ P>

TFU胶体AGNPS

的TFU安装和3步TFU过程的示意图在图2和图3所示，分别50纳米的过滤器（460厘米^2）在步骤1中，利用尺寸选择，以除去银奈米粒子和AgNP-聚集体的50-nm的直径和较大的从原来的胶体（约100毫升的50-nm的滞留物）。这一步也从原来的胶体4 L，3.9 L的50纳米滤液的体积小，减少陪同。无反洗或流量中断步骤使用。量最大的降低（ 即 ，除去水），得到在步骤2中，当通过一个100-kD的过滤器（200厘米^2）的50-nm的滤液，随后运行。将所得的100-kD的滞留物的总体积为50ml。大部分的合成副产物和过量的试剂，在此步骤中，通过水溶剂（3.850毫升100 kD的滤液的）销。另外，AgNP浓度由ADDIT实现离子先前报道的方法的第三过滤工序¹⁹在该步骤3中，一个100-kD的滤波器的一个较小的表面区域（20厘米^2）100-kD的滞留体积减少至4.0毫升。 TEM测量表明，这最后的100 kD的滞留物主要是由直径为1-20纳米的的弱旅汇总AGNPS的。

ICP-OES和TEM的胶体AGNPS

从八个标准（0，3，7，10，15，25，50，和^100μgL-1）的线性回归校准曲线（ 图4）构建银。在每一个四个有代表性的胶体样品的银的量，然后确定从ICP-OES校准曲线通过外推法：原始胶体（15.2 ppm的， 图3A），50-nm的滤液（14.1 ppm的， 图3B），第一个100 - kD的滞留物（683.1 ppm的， 图3C）和最后的100-kD的滞留物（586.5 ppm的， 图3D）。15.2 ppm的实际产量是非常接近的克莱顿反应的典型的理论产率的15.4 ppm的。极端的银奈米粒子浓度（4毫升586.5 PPM），反映了一个戏剧性的变化，颜色从原来的胶体金黄色到深褐色的最后100 kD的滞留物（ 图3，插图的小瓶的图片）。被发现的过滤器的质量是至关重要的的TFU过程，特别是步骤1。最终阻滞浓度为446.5 ppm的9,333.3百万分之根据过滤器的条件（大量使用与全新）。如果膜毛孔成为损害，还可以具有的直径小于50纳米的银奈米粒子将保留，并随后将降低整体收集在滤液中的银奈米粒子量。过滤过程的优化，包括压力监测和适当的清洁可以提高过滤器的寿命。

代表的TEM照片原始克莱顿胶体和最后的100-kD的滞留物（步骤3）在图5A和图5C所示，分别。在他们的非聚集状态下，AGNPS的浅灰色背景显示为黑色的圆形区域。大约有800银奈米粒子中确定的每一个，两个样品的TEM显微照片，使用Image J软件进行分析。一个粒子定义的一个完整的和封闭的周边。一个面积阈值定为1.0纳米²的TEM照片的分辨率。的的AgNP数和面积数据，然后导出到Microsoft Excel的AgNP直径推算。在原来的胶体和最后的100-kD的滞留物的的平均AgNP直径测定，分别为9.3 nm和11.1纳米。的银奈米粒子的直径测量，然后将其导出到来源地8.0软件对每个样品和大小的TEM直方图构建（ 图5B和图5D）。

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图1：A）合成的设置，B）的典型色泽，C），紫外-可见吸收光谱，和D）的克赖顿胶体银奈米粒子的拉曼光谱。

图2。TFU实验装置A）步骤1和步骤2：I）水库克赖顿胶体银奈米粒子。 II）水库滤液收集。 III）Y-交界处的管道。 IV）蠕动泵头。 V）为50纳米或100 kD的南部库洛过滤器。B）步骤3：I）水库的克赖顿胶体银奈米粒子。 II）水库滤液收集。 III）100 kD的微：库洛过滤器。

图3的流程图描绘的TFU过程。蓝色阴影框马克银奈米粒子的胶体悬浮液中以供进一步分析收集。瓶photographs表明甲）原本的胶体批处理，B）的 50-nm的滤液收集处理后的原始胶体通过50纳米的过滤器（460厘米^2），C）的头100-kD的滞留物后得到的体积减少使用100-kD的南比利库洛过滤器（200厘米^2）， 和D）最后100-kD的滞留物从使用100 kD的微：库洛过滤器（20厘米^2）的体积减小所导致。 100 kD的滤液看起来像水。

图4。ICP-OES线性的校准采用八银标准：0，3，7，10，15，25，50，和^{100μg·L-1。}

A）原克赖顿农业非点源污染和 C的TEM照片如图5所示。）最后的100 kD的滞留物（比例尺为为100nm）。 TEM建造的规模直方图分析约800 AGNPS B）原克赖顿AGNPS，D）最后100 kD的截留的。 图5B中的插图显示了展开的的41-75纳米尺寸范围内作比较。 点击此处查看大图 。

讨论

胶体银奈米粒子的紫外 - 可见吸收光谱法和拉曼光谱

这是众所周知的，数量的表面等离子体共振一种胶体的吸收光谱的峰的对称性的AGNPS增加而减小。此外，AgNP聚合导致的外观更广泛或红移的峰^。25,26的存在下，在394 nm处的一个单一的，尖锐的和对称的SPR峰值表示中度聚集和粒度分布的小的，球形的银奈米粒子。

前和超滤后的胶体样品的纯度，证明...

材料

硝酸银（AgNO 3的 ）	Acros Organics公司	CAS：7761-88-8
硼氢化钠（加入NaBH 4）	Acros Organics公司	CAS：16940-66-2
硝酸（HNO 3，远舰）	默飞世尔科技公司	A467-1	ICP分析痕量金属级
10,000微克毫升-1银标准，EnviroConcentrate	超科学	美IAA-047
KrosFlo研究（二） 我切向流过滤系统	频谱检测实验室公司	SYR2-U20-01N
0.05微米PS（0.5毫米）460厘米	频谱检测实验室公司	X30S-900-02N
南部100 kD的PS 200平方厘米	频谱检测实验室公司	X3-100S-901-02N
micro100 kD的PS 20 cm 2的	频谱检测实验室公司	X1AB-300-10N
MASTERFLEX的C-Flex管L / S尺寸17	科尔 - 帕默仪器有限公司	06424-17
MASTERFLEX的C-Flex管L / S尺寸14	科尔 - 帕默仪器有限公司	06424-14
卡里50 UV-VIS-NIR分光光度计	瓦里安公司
的LabRam HR 800系统	HORIBA Jobin Yvon公司公司
瓦里安710ES ICP-OES	瓦里安公司