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Method Article
Ultrafiltration à flux tangentiel (AFT) est un procédé de recirculation utilisée pour la séparation en fonction du poids du échantillons biologiques. TFU a été adapté à la taille de sélection (1-20 nm de diamètre) et très concentrer une grande quantité de nanoparticules d'argent polydisperses (4 L de 15,2 mg ml -1 Jusqu'à 4 ml de 8,539.9 mg ml -1) Avec agrégation minimale.
De nos jours, AGNPS sont largement utilisés dans la fabrication de produits de consommation, 1, 2 désinfectants de l'eau thérapeutique, 1, 3 et 4 dispositifs biomédicaux en raison de leurs puissantes propriétés antimicrobiennes. 6.3 Ces applications des nanoparticules sont fortement influencées par la taille et l'état d'agrégation AGNP . De nombreux défis existent dans la fabrication contrôlée 7 et basée sur la taille de l'isolement 4,8 non fonctionnalisées, AGNPS homogènes qui sont exempts de produits chimiques agressifs plafonnement / agents stabilisants ou des solvants organiques. 7-13 Limites sortir de la toxicité des réactifs, des coûts élevés ou réduits l'efficacité des méthodes de synthèse ou l'isolement AGNP (par exemple, la centrifugation, dépendant de la taille solubilité, chromatographie d'exclusion stérique, etc.) 10,14-18 Pour y remédier, nous avons récemment montré que TFU permet un meilleur contrôle sur la taille, la concentration et état d'agrégation de Creighton AGNPS (300ml de 15,3 pg ml -1 jusqu'à 10 ml de 198,7 pg -1 ml) que les méthodes classiques de séparation telles que l'ultracentrifugation. 19
AFT est un procédé de recyclage couramment utilisé pour l'isolement en fonction du poids de protéines, de virus et de cellules. 20,21 Brièvement, l'échantillon liquide est passé à travers une série de membranes à fibres creuses avec une taille de pores comprise entre 1.000 kD à 10 kD. Petits constituants en suspension ou dissous dans l'échantillon passe à travers la barrière poreuse avec le solvant (filtrat), tandis que les constituants plus grandes sont retenues (rétentat). TFU peut être considéré comme un "vert" méthode car elle ni dommages, ni de l'échantillon nécessite un supplément de solvant pour éliminer l'excès de réactifs toxiques et sous-produits. En outre, AFT peuvent être appliqués à une grande variété de nanoparticules que les deux filtres hydrophobes et hydrophiles sont disponibles.
Les deux principaux objectifs de cette étude étaient: 1) pour illustrerles aspects expérimentaux de l'approche TFU à travers une expérience vidéo invités et 2) de démontrer la faisabilité de la méthode TFU pour les grands volumes de nanoparticules colloïdales et les petits volumes de rétentat. Tout d'abord, AGNPS unfuctionalized (4 L, 15,2 mg -1 ml) ont été synthétisés selon la méthode bien établie Creighton 22,23 par la réduction de AgNO 3 avec NaBH4. AGNP polydispersité est ensuite réduit par l'intermédiaire d'un AFT 3-étape à l'aide d'un filtre 50-nm (460 cm 2) pour enlever et AGNPS AGNP-agrégats supérieure à 50 nm, suivi par deux 100-kD (200 cm 2 et 20 cm 2) filtres de concentrer les AGNPS. Des échantillons représentatifs ont été caractérisés par microscopie électronique à transmission, la spectrophotométrie d'absorption UV-Vis, spectroscopie Raman et plasma à couplage inductif spectroscopie d'émission optique. Le rétentat final comprenait très concentré (4 ml, 8,539.9 mg -1 ml) et pourtant humble agrégée et homogèneAGNPS de 1-20 nm de diamètre. Cela correspond à un rendement concentration d'argent de l'ordre de 62%.
1. Synthèse des AGNPS colloïdal
Le mécanisme réactionnel de la méthode Creighton (légèrement modifié, peu coûteux) 22 est décrite en détail dans l'information de référence Soutenir Pavel et.al avec l'hydrolyse indésirable réaction secondaire de NaBH4 à la température ambiante ou plus 23.
2. Caractérisation des AGNPS colloïdal
Un spectrophotomètre Cary 50 UV-VIS-NIR (Varian Inc) et un LabRamHR 800 Système Raman (Horiba Jobin Yvon, Inc) équipé d'un Olympus BX41 microscope confocal Raman, ont été utilisées pour la caractérisation AGNP. La Cary WinUV logiciel, LabSpec v.5 et 8,0 Origine du logiciel ont été utilisées pour la collecte des données et l'analyse.
Remarque: Les paramètres d'acquisition devra être optimisé fomodèles R Instrumentation autres.
Détermination de résonance plasmonique de surface de AGNPS colloïdal par spectrophotométrie UV-VIS
Test de pureté de AGNPS colloïdal par spectroscopie Raman
En raison de la limitation dans le temps de la vidéo de démonstration (10-15 min video) et la limitation de l'espace de texte du protocole (3 pages maximum), cette partie expérimentale ne sera pas filmé.
3. Taille-sélection et concentration des AGNPS colloïdal par ultrafiltration à flux tangentiel (TFU)
Un KrosFlo II recherche un système de filtration (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, Californie) a été utilisé pour limiter la polydispersité AGNP et de se concentrer entre eux (figure 2). Les trois étapes du processus de TFU étaient les suivants: (1) Taille-sélection de AGNPS et AGNP-agrégats de 50 nm de diamètre et de plus en utilisant un 50-nm MidiKros polysulfone module (460 cm 2), 2) choix de la taille et de la concentration des AGNPS de 1-20 nm de diamètre à l'aide d'un 100-kD MidiKros filtre (200 cm 2), et (3) la réduction du volume utilisant en outre une MicroKros 100-kD polysulfone filtre (20 cm 2) (Figure 3).
Etape 1
Étape 2
Étape 3
4. Quantification de la quantité d'argent colloïdal dans AGNPS par plasma à couplage inductif spectroscopie d'émission optique (ICP-OES)
Chaque échantillon a été chimiquement colloïdale digérée et la quantité d'argent a été quantifiée par ICP-OES utilisant un spectromètre Un 710E (Varian Inc.) Une courbe de régression linéaire d'étalonnage pour l'argent (figure 4) a été construit en utilisant huit normes d'argent (0, 3, 7, 10, 15, 25, 50 et 100 mg L -1), qui ont été préparés à partir d'un standard de 10.000 pg ml -1 pour l'argent analyse des métaux traces (Ultra scientifique).
5. Répartition par taille des AGNPS colloïdal par microscopie électronique à transmission (MET)
A Phillips EM 208S TEM a été utilisé pour visualiser les AGNPS colloïdales. Les micrographies électroniques ont été capturées à l'aide d'une haute résolution Gatan Bioscan caméra et analysées dans le logiciel ImageJ 24.
6. Les résultats représentatifs
Synthèse et caractérisation de AGNPS colloïdal
Quatre litres de AGNPS Creighton colloïdales ont pu être synthétisés en utilisant la configuration présentée à la figure 1A. La finale colloïde a une couleur caractéristique jaune d'or (figure 1B). 22, 23 Le spectre d'absorption UV-Vis de ce colloïde eu une forte typique, symétrique pic de plasmon de surface (SPR) à 394 nm (figure 1C). Le spectre Raman de l'original colloïde Creighton et la finale du 100 kD rétentat présenté que trois modes de vibration, à savoir la flexion (1640 cm -1) et symétriques et asymétriques modes d'étirement de H 2 O (3245 cm -1 et 3390 cm -1 , respectivement) (figure 1D).
TFU de AGNPS colloïdal
La configuration TFU et le schéma du processus en 3 étapes TFU sont représentés aux figures 2 et 3, respectivement. À l'étape 1, un filtre de 50 nm (460 cm 2) a été utilisée pour sélectionner la taille et de supprimer AGNPS et AGNP-agrégats de 50 nm de diamètre et plus de l'original colloïde (environ 100 ml de 50-nm rétentat). Cette étape a également été accompagnée d'une réduction faible volume de 4 litres d'origine colloïde à 3,9 L de 50-nm filtrat. Aucune étape de lavage ou de perturbation d'écoulement a été utilisé. La réduction de volume le plus important (par exemple, l'élimination de l'eau) a été obtenu à l'étape 2, lorsque le filtrat 50-nm a été exécutée par la suite à travers un filtre 100-kD (200 cm 2). La résultante 100-kD rétentat a un volume total de 50 ml. La plupart des sous-produits de synthèse et des réactifs en excès ont été éliminés à cette étape à travers le solvant de l'eau (3.850 ml de 100 kD filtrat). En outre, la concentration AGNP a été réalisé par le addition d'un troisième étape de filtration à la procédure précédemment. 19 Dans cette étape 3, un filtre 100-kD d'une surface plus petite (20 cm 2) réduit le volume 100-kD rétentat à 4,0 ml. Les mesures TEM va démontrer que cette finale du 100 kD rétentat est principalement constitué de modestes AGNPS agrégées de 1-20 nm de diamètre.
ICP-OES et TEM de AGNPS colloïdal
Une courbe de régression linéaire d'étalonnage (Figure 4) pour de l'argent a été construit à partir de huit critères (0, 3, 7, 10, 15, 25, 50 et 100 mg L -1). La quantité d'argent dans chacune des quatre échantillons représentatifs colloïdales a été déterminée à partir de la courbe d'étalonnage par ICP-OES extrapolation: original colloïde (15,2 ppm, figure 3A), 50-nm filtrat (14,1 ppm, figure 3B), d'une part 100 - kD rétentat (683,1 ppm, figure 3C) et finale du 100 kD rétentat (8,538.9 ppm, figure 3D).Le rendement réel de 15,2 ppm est très proche du rendement théorique typique de 15,4 ppm pour la réaction Creighton. La concentration extrême de AGNPS (4 ml de 8,538.9 ppm) a été traduit par un changement dramatique dans la couleur du jaune d'or à l'original colloïde à brun foncé pour la finale du 100 kD rétentat (figure 3, encarts de photos flacon). La qualité des filtres a été jugée cruciale pour le processus de TFU, en particulier à l'étape 1. Les concentrations finales de rétentat variait entre 3,390.1 9,333.3 ppm ppm à fonction de l'état des filtres (largement utilisé contre neuf). Si les pores de la membrane est compromis, AGNPS qui ont un diamètre inférieur à 50 nm seront également retenues et seront par la suite diminuer le montant global des AGNPS qui sont recueillies dans le filtrat. Optimisation du processus de filtration d'inclure surveillance de la pression et un nettoyage correct peut augmenter la durée de vie des filtres.
Micrographies MET représentatifs de l'original Creighton colloïde et la finale du 100 kD rétentat (étape 3) sont présentés dans la figure 5A et 5C, respectivement. Dans leur état non agrégé, AGNPS apparaissent comme des zones noires rondes sur un fond gris pâle. Environ 800 AGNPS ont été identifiés dans les micrographies TEM de chacun des deux échantillons et analysées en utilisant le logiciel Image J. Une particule est définie par un périmètre complet et clos. Une valeur seuil de domaine a été fixé à 1,0 nm 2 selon la résolution des micrographies MET. Les chiffres et les données de la zone AGNP ont ensuite été exportées dans Microsoft Excel et les diamètres AGNP ont été extrapolés. Le diamètre moyen AGNP dans l'original colloïde et la finale du 100 kD rétentat ont été déterminées à 9,3 nm et 11,1 nm, respectivement. Les mesures du diamètre des AGNPS ont ensuite été exportés vers le logiciel Origin 8.0 et un histogramme de taille TEM a été construit pour chaque échantillon (figure 5B et 5D).
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Figure 1. A) Synthèse de configuration, B) couleur caractéristique, C) Spectre d'absorption UV-Vis et D) spectre Raman du AGNPS Creighton colloïdales.
Figure 2 TFU montage expérimental pour A deux pas) 1 et 2:. I) Réservoir contenant AGNPS Creighton colloïdales. II) du réservoir de collecte de filtrat. III) Y-jonction en tuyau. IV) tête de pompe péristaltique. . V) Soit 50-nm ou 100-kD Midi Kros filtre B) étape 3: I) Réservoir contenant AGNPS Creighton colloïdales. II) du réservoir de collecte de filtrat. III) 100-kD Micro Kros filtre.
Organigramme Figure 3. Représentant le processus TFU. Les boîtes bleutées marquer les suspensions colloïdales de AGNPS collectées pour analyse ultérieure. P Vialhotographs voir A) d'origine colloïde lot, B) 50-nm filtrat recueilli après le traitement initial du colloïde à travers le filtre 50-nm (460 cm 2), C) 100-kD premier rétentat obtenu après réduction de volume à l'aide du 100-kD Midi Kros Filtre (200 cm 2), et D) rétentat final 100-kD résultant de la réduction de volume à l'aide du 100-kD Micro Kros filtre (20 cm 2). Le 100-kD filtrat ressemble à de l'eau.
Figure 4 ICP-OES étalonnage linéaire construit en utilisant huit normes d'argent:. 0, 3, 7, 10, 15, 25, 50 et 100 pg L -1.
Micrographies MET Figure 5. AGNPS de A) original Creighton et C) finale du 100 kD rétentat (barre d'échelle est100 nm). Histogrammes de taille TEM construite en analysant environ 800 AGNPS pour B) d'origine AGNPS Creighton, et D) rétentat final de 100 kD. L'encart dans la figure 5B montre l'étendue 41-75 gamme de taille nm à des fins de comparaison. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Spectrophotométrie d'absorption UV-Vis et spectroscopie Raman de AGNPS colloïdal
Il est bien connu que le nombre de pics de résonance plasmonique de surface dans le spectre d'absorption d'un colloïde diminue à mesure que la symétrie des augmentations AGNPS. En outre, AGNP agrégation conduit à l'apparition de pics plus larges ou plus décalée vers le rouge. 25,26 La présence d'un seul pic pointu et symétrique à 394 nm SPR est révélateur de petits AGNP...
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Le financement de la National Science Foundation à travers le NUE dans l'ingénierie et les programmes LEADER Consortium est grandement appréciée.
Le nitrate d'argent (AgNO3) | Acros Organics Inc | CAS: 7761-88-8 | |
Le borohydrure de sodium (NaBH4) | Acros Organics Inc | CAS: 16940-66-2 | |
L'acide nitrique (HNO 3, Optima) | Fisher Scientific Inc | A467-1 | Trace de qualité en métal pour analyse ICP |
10.000 mg ml -1 d'argent standard, EnviroConcentrate | Ultra scientifique | États-IAA-047 | |
KrosFlo recherche II i tangentiel Système de filtration à flux | Spectrum Laboratories Inc | SYR2-U20-01N | |
0,05 um (0,5 mm) PS 460 cm 2 | Spectrum Laboratories Inc | X30S-900-02N | |
Midi 100 kD PS 200 cm 2 | Spectrum Laboratories Inc | X3-100S-901-02N | |
Micro100 kD PS 20 cm 2 | Spectrum Laboratories Inc | X1AB-300-10N | |
Taille MasterFlex tubes C-Flex L / S 17 | Cole-Palmer Instrument Co. | 06424-17 | |
Taille MasterFlex tubes C-Flex L / S 14 | Cole-Palmer Instrument Co. | 06424-14 | |
Spectrophotomètre Cary 50 UV-VIS-NIR | Varian Inc | ||
LabRam RH 800 Système | Horiba Jobin Yvon Inc | ||
Varian 710ES ICP-OES | Varian Inc |
Tableau 1. Réactifs et équipements spécifiques.
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