二维和三维活细胞成像的DNA损伤反应蛋白

摘要

该协议描述了一个可视化的DNA双链断裂以及其定位在有丝分裂过程中DNA损伤激活的信号蛋白的方法。

摘要

双链断裂（DSBs）是最有害的DNA病变的细胞可能会遇到。如果未修复，DNA双链断裂港口的巨大潜力产生突变和染色体畸变^1。为了防止这种创伤催化基因组的不稳定性，这是至关重要的，检测DNA双链断裂的细胞，激活DNA损伤反应（DDR），并修复DNA。解除武装，复员和重返社会工作的刺激时，通过触发细胞周期阻滞，以便维修发生或强制的细胞发生凋亡，以维持基因组的完整性。 DSB修复发生的主要机制通过非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HRR）（评论^2例 ）。有许多的蛋白质，其活动必须精确精心策划的解除武装，复员和重返社会正常运行。这里，我们描述了一种方法，2 - 和3 - 维（D）的可视化这些蛋白质之一，53BP1。

p53结合蛋白1（53BP1）定位于地区DNA双链断裂的修饰组蛋白^3,4结合，形成病灶在5-15分钟内^5。组蛋白修饰和招聘53BP1和其他DDR蛋白DSB网站被认为是染色质的结构重排，以方便周边地区的损失，并有助于DNA修复^6。除了 ​​直接参与修复，额外的角色被描述为53BP1在解除武装，复员和重返社会，如调节内-S检验点，G2 / M检验点，并激活下游DDR蛋白^7-9。最近，人们发现，53BP1没有形成病灶在有丝分裂过程中DNA损伤，而不是等待细胞进入G1前定位附近的DNA双链断裂^6。如53BP1 DDR蛋白质已被发现与有丝分裂的结构（如着丝粒）相关联的进展通过有丝分裂¹⁰期间。

在这个协议中，我们描述了使用2 - 和3-D的活细胞成像的可视化53BP1灶形成的DNA损伤剂喜树碱（CPT），以及53BP1在有丝分裂过程中的行为。喜树碱是拓扑异构酶I抑制剂，主要引起DNA双链断裂DNA复制过程中。要做到这一点，我们使用先前描述的53BP1 mCherry荧光融合蛋白结构的53BP1的蛋白质结构域的能够结合DNA双链断裂^11。此外，我们使用组蛋白H2B-GFP的荧光融合蛋白的构建，能够监控整个细胞周期，但在特定的染色质的动态，在有丝分裂^12。活细胞成像技术在多个方面，是一个很好的工具，以加深我们对DDR在真核细胞中的蛋白质的功能。

研究方案

A.细胞制备

1. 正常人体主要的成纤维细胞（GM02270）卡瑞尔细胞储存库，卡姆登，新泽西州，并与hTERT ⁶永生。细胞生长和扩大在蜂星6-cm培养皿在媒体（4毫升）组成的MEM培养基与20％的胎牛血清（GIBCO），的non-essential/essential氨基酸，维生素，丙酮酸钠，和青霉素/链霉素（HyClone公司）。
2. 人胚胎肾293（HEK293）细胞，从美国典型培养物保藏中心获得的，并在蜂星6-cm培养皿中生长和扩大。中，细胞保持在介质（4毫升）中组成的DMEM培养液与10％牛胎儿血清，非必需氨基酸，L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。
3. 53BP1 mCherry（N-MYC-53BP1 WT pLPC的普罗Addgene质粒19836）（pCLNR H2BG; Addgene质粒17735）和H2B-GFP融合基因的结构也表达嘌呤霉素或G418抗性基因，分别转（fibrobla针）或转染（HEK293）使用SuperFect（Qiagene）进入细胞，并保持在药物选择。荧光定期检查维护。
4. 图像采集前24-48小时，将细胞用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，并以较低的密度接种到的3.5厘米FluroDish玻璃底板。

B.显微镜设置和图像采集

该协议被开发使用的蔡司细胞观察SD旋转盘共聚焦显微镜配备了一个AxioObserver Z1架，双通道Yokagawa CSU-X1A 5000旋转的磁盘单元，配光QuantEM 512SC EMCCD相机，HXP 120C光纤为基础的照明灯，4激光器（一Lasos 100mW的多行，氩[458，488，514纳米，50 mW的405 nm二极管，40 mW的561 nm二极管，和30 mW的635 nm二极管），AOTF，一个Pecon的的XL multiS1阶段孵化体系，蔡司孵化模块（模块S O _{2，CO 2} TempModule模块S，S，供热机组XL小号）和前个月XY torized阶段与一个NanoScanZ的压电Z插入。为了尽量减少的活细胞成像的球面像差，而在水性介质中，一个C-复消色差63x/1.20水/更正物镜和蔡司Immersol W浸没流体（具有折射率n = 1.334）的支持。对于2通道共焦成像中，RQFT 405/488/568/647分色镜和BP525/50（绿色）和BP629/62（红色）排放过滤器被使用。所用的系统软件与AV4 Multi-channel/Z/T，快速成像，生理学，MosaiX，标记和查找，双摄像头，里面4D，自动对焦和3-D反褶积模块：蔡司Axiovision（版本4.8.2.0）。

1. 确保运行，CO ₂气体的CO ₂孵化系统的模块。如果在显微镜防振空气表支持的，打开空气供给（或N ₂气体）的空气表。
2. 打开显微镜支架的电源开关，旋转式磁盘装置，数码相机，孵化模块，HXP照明灯，电动载物台，氩气激光，和计算机。
3. 经过1分钟的热身时间，将点火钥匙的氩离子激光器为“开”。
4. 在蔡司激光控制面板中，打开要使用的激光线的开关。
5. 拨动开关切换为“待机”，“激光运行”，的Lasos氩离子激光器控制器，调光控制器的最佳水平（ 即正下方的绿色指示灯会变成红色）。
6. 启动AxioVision软件。 注 ：是专门针对特定的显微镜和组件，它控制的窗口和下拉菜单，可自定义的用户界面AxioVision。因此，每个系统都有可能是唯一的接口。因此，在随后的步骤中提供软件操作的一般说明，而不是特定的软件窗口，标签和/或下拉菜单的方向。
7. 成像前约1小时，在软件中，定位控制的孵化器和上部腔室的加热和镜台板的开启。把温度设置为37℃。打开的CO ₂的控制和设置在5％的水平。
8. 选择用于成像的物镜。在这项研究中，63x/1.20 NA C-复消色差水/更正物镜使用注 ：对于这样的镜头，需要浸没介质的折射率类似的水（蔡司Immersol W浸没流体）。
9. 如果在一个长的时间内将被采样的多个单独的位置，某些应用足够量的液浸介质中，以确保它从一个位置到另一个进行。
10. 放置在舞台上的菜带来物镜成与底部接触。
11. 在显微镜控制或软件，直接发出的光目镜，选择“适当的广角过滤器的设置荧光信号的利息（这项研究中，”红“过滤器设置53BP1和”绿色荧光蛋白“过滤器设置为H2B ）。/ P>
12. 查看通过眼透镜，图像聚焦，细胞中找到一个合适的领域。
13. 使用软件或显微镜控制，直接发射的光远离共焦旋转圆盘​​单元到端口的目镜。
14. 在软件中，打开相应的激光（这项研究中，561纳米激光53BP1和H2B的氩离子激光器的488 nm线）。
15. 对于每个通道，调整的激光的强度的声光可调谐滤波器（AOTF）控制通过调节到适当的水平。
16. 选择适当的的分色镜（RQFT 405/488/568/647）和发射滤波器（BP62分之62953BP1和BP五十○分之五百二十五的的H2B）。打开快门纺丝盘单元。
17. 选择“实时”窗口，显示当前的视野。
18. 在软件中，打开“相机”控制，选择相机使用（如果是双相机系统），并设定曝光时间约为100毫秒。调整％和EM获得其他埃森。 注：53BP1 mCherry结构显得有些暗淡。我们发现它有利于提高EM增益。
19. 在软件中，打开控制的共聚焦转盘单位和调整转盘的速度进入相机的曝光时间，捕捉到一个合适的图像（ 例如 〜100毫秒）。单击“设置”锁定的变化。
20. 打开“多维收购”。选择通道“选项卡，加载/选择合适的渠道。在这项研究中，我们将使用红色荧光蛋白（561 nm激光激发和BP 629/62过滤器的排放）和GFP（488 nm激光激发和BP525/50过滤器的发射线）定义的通道。
21. 为了确保图像配准中，一个共同的分色镜（RQFT 405/488/568/647）用于两条通道。设置软件的“自动对焦”。 注意 ：工具→设置编辑器调整的MDA设置。确保有足够的激光功率设置（“足够的激光功率”是指设置，让您激发适当的荧光基团，同时最大限度地减少光漂白）。
22. 在“MDA”窗口中，选择“Z-Stack的标签。选择“Z-堆栈在当前的焦点位置”。设置范围〜10微米的Z-Stack，然后选择“最佳”的一些步骤，以确保奈奎斯特采样到Z 注意：确切的Z-Stack的大小将取决于你的细胞的高度。相应的调整。
23. 23。单击“开始”，产生的Z-Stack的图像进行分析，以确保设置适合你调查（ 例如在这项研究中的，这是非常重要的，整个核）。
24. 选择“T”（时间）选项卡。对于喜树碱我们的实验中，我们设置了成像时间点之间的时间间隔为5分钟和1小时的控制（非处理的细胞）视频会议期间的整体。 注意：尽量减少光漂白细胞，实验应该被配置为使得在AOTF激光成像的时间点之间的空白。
25. F多点成像几个细胞的菜，在MDA“窗口中，选择”位置“选项卡。确保“应用”设定时间点的每个位置前/后“被选中。 ，选择“Mark_Find”。使用“现场”视图，将周围的菜，并选择合适的视野。
26. 多维收购菜单中单击“开始”，开始进行实验，并记录控制视频（未经处理的细胞）。
27. 控制视频后，添加适当的处理（在这种情况下，10μM喜树碱）。我们记录了实验（药物处理的细胞）的视频在5-10分钟的时间间隔为2-4小时。 注：要考虑的是速度，一个给定的效果，治疗后出现的一个重要问题。在视频中可以看出，53BP1灶开始〜5分钟后，加入CPT。虽然一个相对容易的过程，手动添加药物的菜和重新校准的显微镜，确实需要时间。设计实验时，必须考虑到这。
28. 为了监测米itosis，我们的间隔设为7.5分钟，并记录为4-5小时（特定的设置取决于使用的细胞系和其细胞周期的长度）。可能需要进行调整，在较长的录音，以防止光漂白。

C.图像处理与分析

Volocity软件（珀金埃尔默），该协议的开发利用。获得这些数据（AxioVision）所使用的软件也有能力来处理和分析图像。我们鼓励用户利用该软件提供给他们，并查阅相关文献，对他们的应用程序。

1. 打开Volocity软件。创建并命名一个新的库，并导入你的视频文件。
2. 要查看的文件，我们通常会发现使用“扩展聚焦方式”设定有极大的帮助。这叠加的Z-Stack片，此协议，使我们能够可视化53BP1灶在不同领域的核。
3. 在必要时调整的影片。 VOlocity配备了一系列的工具，以提高采集到的图像质量。很多时间通过确保在显微镜上的设置是合适的，可以被保存在编辑以后。通常情况下，它是有帮助，反卷积您的图像，调整亮度/对比度。实验的基础上，你的特定的编辑需求会有所不同。
4. 添加一个相对时间戳和比例尺。
5. 要查看单元格中的3-D，切换到“3-D不透明度”设置。这允许在空间的3-D渲染细胞的旋转，从而提供利益的结构的细胞内的多个角度。 注：这是有助益的可视化细胞在不同的平面中，以确定结构感兴趣的旅行。例如，在“扩展聚焦方式”设定，它是很难辨别53BP1不，其实，游离在有丝分裂过程中从DNA。然而，这是显而易见的，在3-D。
6. 动画和静止图像可以导出成多种文件类型，根据用户的喜好。 I>

D.代表性的成果

响应对CPT 53BP1灶形成的一个例子的图1中所示。中华映管灶的细胞暴露在5-10分钟范围内，并保持这些病灶在整个持续时间的记录。正如在图2中所示，53BP1解离染色质在有丝分裂的发病，冷凝染色体周围形成薄膜的雾度。末期发生有丝分裂结束，53BP1再次聚集成不同的病灶。虽然HEK293细胞没有接触到CPT，但它们形成丰富的，自发的53BP1所产生的内源性DNA损伤的修复病灶。这一观察结果使我们得出结论，53BP1没有形成病灶早期有丝分裂过程中，在与以前的报告显示，类似的效果后，细胞暴露于电离辐射和radiomimetic的药物^5。

从图1“SRC =”/ files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg“/>
图1。喜树碱（10μM）引起DNA双链断裂和向培养基中添加药物后的30分钟内，在骑自行车的成纤维细胞的53BP1灶形成。

图2。，53BP1并不构成灶在HEK293细胞中有丝分裂过程中，直到telophase/G1。

讨论

维持基因组的完整性，细胞的生存是至关重要的。如果保存的基因组会导致过早衰老，癌变，死亡^8。有浓厚的兴趣，挑剔的DDR功能，源于其基础和临床研究的重要性。多年来，以帮助在细胞如何检测和修复DNA损伤的研究已开发了许多技术。传统的方法，如免疫细胞化学和西方墨点法领域的支柱，尽管最近的技术进步已经使日益复杂的方法发展。活细胞成像，在该协议中详细说明，使我们?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
产品	公司
陕西蜂星的培养皿	格雷纳生物一
FluroDish玻璃底菜	世界精密仪器公司
MEM媒体	GIBCO
非必需氨基酸	GIBCO
氨基酸	GIBCO
维生素	GIBCO
丙酮酸钠	Invitrogen公司
青霉素/链霉素	胎牛血清
胎牛血清	GIBCO
N-MYC-53BP1 WT pLPC的普罗; 质粒19836	Addgene
pCLNR H2BG质粒17735	Addgene
SuperFect	Qiagen公司
蔡司观察SD细胞成像系统	蔡司
AxioVision（版本4.8.2）	蔡司
蔡司Immersol W油	蔡司
Volocity软件（版本6.0）	珀金埃尔默