Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung eines DNA Doppelstrangbruch Signalprotein als Reaktion auf DNA-Schäden sowie seine Lokalisierung während der Mitose aktiviert.

Zusammenfassung

Doppelstrangbrüche (DSB) sind die meisten schädlichen DNA-Läsionen eine Zelle begegnen kann. Wenn links unrepariert, um DSBs Hafen ein großes Potenzial zu generieren Mutationen und chromosomalen Aberrationen ^1. Um dieses Trauma Katalysieren genomische Instabilität zu verhindern, ist es von entscheidender Bedeutung, damit Zellen DSBs detektieren, die DNA-Schäden Reaktion (DDR) zu aktivieren, und die Reparatur der DNA. Wenn angeregt, arbeitet der DDR zur genomischen Integrität durch das Auslösen des Zellzyklus zu ermöglichen für die Reparatur stattfinden oder zwingen die Zelle zur Apoptose bewahren. Die vorherrschenden Mechanismen der DSB-Reparatur entstehen durch homologe end-joining (NHEJ) und homologe Rekombination Reparatur (HRR) (bewertet in ^2). Es gibt viele Proteine, deren Tätigkeiten müssen genau orchestriert werden für die DDR, um richtig funktionieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren für 2 - und 3-dimensionale (D) Visualisierung von einem dieser Proteine, 53BP1.

Das p53-bindendes Protein 1 (53BP1) lokalisiert BereichenDSBs durch Bindung an modifizierten Histonen ^3,4 bilden Schwerpunkte innerhalb von 5-15 Minuten ^5. Die Histon-Modifikationen und Rekrutierung von 53BP1 und andere DDR Proteine ​​DSB Seiten werden geglaubt, um die strukturelle Neuordnung der Chromatin um Bereiche des Schadens erleichtern und dazu beitragen, DNA-Reparatur ^6. Über die direkte Beteiligung der Reparatur wurden zusätzliche Rollen für 53BP1 worden in der DDR beschrieben, wie die Regulierung eines Intra-S Kontrollpunkt, einen G2 / M Kontrollpunkt, und Aktivieren stromabwärts DDR Proteine ^​​7-9. Vor kurzem wurde entdeckt, dass 53BP1 bildet keine Foci in Reaktion auf DNA-Schäden während der Mitose induziert, anstatt abzuwarten, bevor Zellen G1 Lokalisierung zu der Nähe DSBs ⁶ einzugeben. DDR Proteine ​​wie 53BP1 haben sich mit mitotischen Strukturen (wie Kinetochoren) während der Progression durch Mitose ¹⁰ zuzuordnen.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von 2 - und 3-D Live Cell Imaging zu visualisierendie Bildung von 53BP1 Foci in Reaktion auf das DNA-schädigende Mittel Camptothecin (CPT) sowie das Verhalten 53BP1 während der Mitose. Camptothecin ist ein Topoisomerase-I-Inhibitor, der in erster Linie verursacht DSBs während der DNA-Replikation. Um dies zu erreichen, haben wir eine bisher beschriebenen 53BP1-mCherry fluoreszierende Fusionsprotein zu konstruieren, bestehend aus einem 53BP1 Proteindomäne können DSBs ¹¹ binden. Darüber hinaus haben wir ein Histon H2B-GFP fluoreszierende Fusionsprotein zu konstruieren können Chromatin Dynamik während des Zellzyklus, insbesondere aber zu überwachen während der Mitose ^12. Live Cell Imaging in mehreren Dimensionen ist ein hervorragendes Werkzeug, um unser Verständnis der Funktion der DDR Proteine ​​in eukaryotischen Zellen zu vertiefen.

Protokoll

A. Cell Preparation

1. Normale menschliche Fibroblasten (GM02270) wurden aus Coriell Zelle Repository, Camden, New Jersey, erhalten und verewigte mit hTERT ^6. Die Zellen wurden gezüchtet und in CellStar expandiert 6-cm-Schalen in Medien (4 ml) bestehend aus MEM mit 20% fötalem Rinderserum (GIBCO), non-essential/essential Aminosäuren, Vitamine, Natriumpyruvat, und Penicillin / Streptomycin (HyClone ergänzt ).
2. Menschliche embryonale Nieren-293 (HEK293) Zellen wurden von American Type Culture Collection erhalten und gezüchtet und in CellStar 6-cm-Schalen erweitert. Die Zellen wurden in Medien (4 ml) bestehend aus DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, nicht-essentielle Aminosäuren, L-Glutamin und Penicillin / Streptomycin gehalten.
3. 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene Plasmid 19.836) und H2B-GFP (PCLNR-H2BG; Addgene Plasmid 17.735) Fusionsgen Konstrukte auch exprimieren Puromycin oder G418-Resistenz-Gene wurden jeweils transduziert (fibroblaM.) oder transfizierten (HEK293) mit SuperFect (Qiagene) in Zellen und gepflegt unter Drogen Auswahl. Wartung der Fluoreszenz wurde periodisch überprüft.
4. 24-48 Std. vor Bildaufnahme, wurden Zellen in eine Einzelzell-Suspension trypsiniert und ausgesät in einer niedrigen Dichte auf 3,5-cm FluroDish Glasbodenplatten.

B. Mikroskop Setup und Image Acquisition

Dieses Protokoll wurde entwickelt, mit dem Zeiss Cell Observer SD Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop mit einem AxioObserver Z1 Stand, ein Dual-Channel-Yokagawa CSU-X1A 5000 Spinning-Disk-Einheit, 2 Photometrics QuantEM 512SC emCCD Kameras, ein HXP 120C Faser-basierten Illuminator, 4 ausgestattet Laser (a Lasos 100mW mehrzeiligen Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm Diode, 40 mW 561 nm Diode und 30 mW 635 nm Diode), AOTF ein Pecon XL multiS1 Stufe Inkubationssystem, Zeiss Inkubation Module (O _2-Modul S, CO _2-Modul S, TempModul S, Heating Unit XL S) und einer Vor mozed XY Bühne mit einer NanoScanZ Piezo Z-Einsatz. Um sphärische Aberrationen zu minimieren, während Bildgebung lebende Zellen in einem wässrigen Medium, einem C-Apochromat 63x/1.20 Wasser / Corr Objektivlinse und Zeiss Immersol W Immersionsflüssigkeit (mit einem Brechungsindex n = 1,334) gelagert wurden verwendet. Für 2-Kanal konfokale Abbildung, eine RQFT 405/488/568/647 dichroitischen Spiegel und BP525/50 (grün) und BP629/62 (rot) Emissionsfilter wurden verwendet. Die System-Software verwendet wurde, war Zeiss Axiovision (Version 4.8.2.0) mit AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Physiologie, MosaiX, Mark & ​​Find, Dual-Kamera, Inside 4D, Autofokus und 3-D Dekonvolution Module.

1. Sicherzustellen, dass CO _2-Gas mit dem CO _2-Modul der Inkubation System läuft. Wenn das Mikroskop durch einen Anti-Vibrations Lufttisch unterstützt wird, auf der Luftzufuhr (oder N _2-Gas) für das Lufttisch einzuschalten.
2. Schalten Sie die Stromversorgung für das Stativ, Spinning-Disk-Einheit, Kameras, Inkubation Module, HXP Illuminator, motorisierten Bühne, ArgonLaser und Computer.
3. Nach 1 min Aufheizzeit, drehen Sie den Zündschlüssel für den Argon-Laser auf "On".
4. Auf dem Zeiss Laser Bedienfeld auf den Schalter für die Laser-Linien genutzt werden kann.
5. Schalten Sie den Schalter für die Lasos Argon-Laser-Controller von "Standby" auf "Laser run" und stellen Sie die Licht-Controller auf das optimale Niveau (dh knapp unterhalb der Stelle, wo die grüne Anzeige leuchtet rot).
6. Starten Sie die Software AxioVision. Hinweis: die Benutzeroberfläche für AxioVision kann mit Fenstern und Pull-Down-Menüs, die spezifisch für die jeweilige Mikroskop und Komponenten, die es steuert sich den Kundenwünschen angepasst werden. Als solche hat jedes System eine potenziell einzigartige Schnittstelle. Daher sind allgemeine Anweisungen für die Software-Manipulation in den nachfolgenden Schritten vorgesehen, anstatt Richtungen für spezifische Software-Fenster, Tabs und / oder Pull-down-Menüs.
7. Ungefähr 1 Stunde vor der Bildgebung in der Software, Finden die Bedienelemente für den Inkubator undEinschalten der Heizung für die obere Kammer und der Tischplatte. Stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Schalten Sie den CO _2-Steuerung und den Pegel bei 5%.
8. Wählen der Objektivlinse zum Abbilden. In dieser Studie wurde ein 63x/1.20 NA C-Apochromat Wasser / Corr Objektivs verwendet. Hinweis: Für dieses Objektiv, ein Immersionsmedium mit einem ähnlichen Brechungsindex Wasser (Zeiss Immersol W Immersionsflüssigkeit) benötigt.
9. Wenn mehrere getrennte Positionen über einen langen Zeitraum hinweg abgetastet werden, sicher sein, um eine ausreichende Menge an Immersionsmedium anwenden, um sicherzustellen, dass sie von einer Position zu einer anderen durchgeführt wird.
10. Setzen Sie die Schüssel auf der Bühne und bringen das Objektiv bis in Kontakt mit dem Boden.
11. Verwenden Sie entweder das Mikroskop Kontrollen oder die Software, leiten das emittierte Licht zu den Okularen und wählen Sie die entsprechende Weitfeld Filter für das Fluoreszenz-Signal von Interesse (für diese Studie, "Red"-Filter für 53BP1 und einem "GFP"-Filter gesetzt für H2B gesetzt ).
12. Blick durch die Augenlinsen, das Bild scharf, und suchen Sie einen geeigneten Bereich der Zellen.
13. Verwenden Sie entweder die Software oder das Mikroskop Kontrollen richten das emittierte Licht von der Okulare in den Hafen mit dem konfokalen Spinning Disc Einheit.
14. In der Software auf den entsprechenden Laser (für diese Studie, die 561 nm Laser für 53BP1 und der 488 nm-Linie des Argon-Laser für H2B) drehen.
15. Für jeden Kanal, um die Intensität des Lasers durch Einstellen der akustooptische abstimmbare Filter (AOTF)-Steuerung auf einen geeigneten Pegel.
16. Wählen Sie den entsprechenden dichroitischen Spiegel (RQFT 405/488/568/647) und Emissionsfilter (BP 629/62 für 53BP1 und BP 525/50 für die H2B). Öffnen Sie den Rollladen in die sich drehende Scheibe Einheit.
17. Wählen Sie die "Live"-Fenster, um das aktuelle Sichtfeld angezeigt.
18. In der Software, öffnen Sie die "Kamera"-Steuerung, wählen Sie die Kamera verwendet werden (wenn ein Dual-Kamera-System) und die Belichtung der Zeit auf etwa 100 ms. Passen Sie die% und EM zu gewinnen, wie ang. Essary Hinweis: Die 53BP1-mCherry Konstrukt erscheint etwas dunkler. Wir fanden es hilfreich, die EM gewinnen zu erhöhen.
19. In der Software, öffnen Sie die Steuerung für die konfokale Spinning Disc-Einheit und stellen Sie den drehenden Scheibe Geschwindigkeit durch Eingabe der Kamera-Belichtungszeit, die auf ein geeignetes Bild (zB ~ 100 ms) zu erfassen war. Klicken Sie auf "Set" in der Änderung zu sperren.
20. Öffnen Sie "multi-dimensionale Erfassung". Wählen Sie den Kanal Registerkarte und laden / Auswahl geeigneter Kanäle. Für diese Studie verwenden wir Kanäle für dsRed (561 nm Laser-Anregung und BP 629/62 Filter für Emission) und GFP (488 nm Laserlinie für die Anregung und BP525/50 Filter für Emission) definiert.
21. Um Bildregistrierung zu gewährleisten, wurde eine gemeinsame dichroitischen Spiegel (RQFT 405/488/568/647) für beide Kanäle verwendet. Stellen Sie die Software auf "Autofokus". Hinweis: Gehen Sie zu Extras → Einstellungen Editor, um die MDA-Einstellungen anpassen. Stellen Sie sicher, dass eine angemessene Laserleistung eingestellt wird ("Adequate Laserleistung" bezieht sich auf eine Einstellung, die es Ihnen ermöglichtdie entsprechende Fluorophor erregt bei gleichzeitiger Minimierung Fotobleichen).
22. Im MDA-Fenster, wählen Sie die z-Stapel Registerkarte. Wählen Sie "Z-Stapel an der aktuellen Fokus Position". Stellen Sie den Bereich für ~ 10 um Z-Stapel und wählen Sie "optimal" für die Anzahl der Schritte zur Nyquist bis Z. Hinweis zu gewährleisten: Die genaue Größe des z-Stack wird von der Höhe Ihrer Zellen ab. Entsprechend anpassen.
23. 23. Klicken Sie auf "Start" und analysieren die resultierende z-Stapel-Aufnahme zu gewährleisten, die Einstellungen entsprechend für das, was Sie untersuchen (z. B. in dieser Studie war es wichtig, zur Abbildung des gesamten Kern).
24. Wählen Sie die "T" (Zeit)-Registerkarte. Für unser Experiment mit Camptothecin, setzen wir das Intervall zwischen Bildgebung Zeitpunkten bis 5 min und die gesamte Dauer der Sitzung für 1 h bei einer Kontrolle (unbehandelte Zellen) Video. Hinweis: zu minimieren Fotobleichen der Zellen, das Experiment sollten so konfiguriert sein, dass der AOTF Zuschnitte den Laser zwischen Bildgebung Zeitpunkten.
25. Foder Multi-Punkt-Darstellung von mehreren Zellen in der Schale, im MDA-Fenster, wählen Sie die Registerkarte Position. Stellen Sie sicher, "Apply"-Einstellung vor / nach dem Zeitpunkt "pro Position" aktiviert ist. Wählen Sie "Mark_Find". Mit der "Live"-Ansicht, bewegen Sie den Teller um und wählen Sie die entsprechenden Sichtfelder.
26. Klicken Sie auf "Start" in der multi-dimensionalen-Akquisition Menü, um das Experiment zu beginnen und aufzuzeichnen eine Steuerung Video (von unbehandelten Zellen).
27. Nach der Kontrolle Video, fügt die entsprechende Behandlung (in diesem Fall 10 uM Camptothecin). Wir nahmen die experimentelle (drug-behandelten Zellen) Video bei 5-10 min Intervalle für 2-4 Std. Hinweis: Eine wichtige Frage zu prüfen, ist die Geschwindigkeit, mit der ein bestimmter Effekt tritt nach der Behandlung. Wie im Video zu sehen, beginnen 53BP1 Herde von ~ 5 min nach Zugabe von CPT. Obwohl ein relativ einfacher Vorgang, indem Arzneimittels für die Spiegel manuell und wieder Kalibrierung des Mikroskops braucht Zeit. Dabei müssen diese angegeben werden bei der Gestaltung Experimente.
28. Für die Überwachung mitosis setzen wir den Abstand zu 7,5 min und aufgezeichnet für 4-5 h (die spezifischen Einstellungen hängen von der verwendeten Zelllinie und der Länge seiner Zellzyklus). Anpassungen müssen vorgenommen werden, um Fotobleichen bei längeren Aufnahmen zu verhindern.

C. Bildverarbeitung und-analyse

Dieses Protokoll wurde entwickelt, mit Volocity Software (PerkinElmer). Die Software verwendet werden, um diese Daten (AxioVision) erwerben hat auch die Fähigkeit, Bilder zu verarbeiten und zu analysieren. Benutzer werden aufgefordert, die Software zur Verfügung, um sie zu nutzen, und wenden Sie sich entsprechende Literatur im Hinblick auf ihre Anwendung.

1. Öffnen Volocity Software. Erstellen und benennen Sie eine neue Bibliothek, und importieren Sie Ihre Video-Dateien.
2. Zum Öffnen der Dateien haben wir in der Regel finden es sehr hilfreich, um die "Extended Focus"-Einstellung verwenden. Dies überlagert die Z-Stapel Scheiben und, für dieses Protokoll, ermöglicht es uns, 53BP1 Foci in verschiedenen Bereichen des Kerns zu visualisieren.
3. Passen Sie Videos wie nötig. Volocity wird mit einer Reihe von Tools, um die Qualität der aufgenommenen Bilder zu verbessern ausgestattet. Durch die Sicherstellung der Einstellungen am Mikroskop angemessen waren, kann viel Zeit bei der Bearbeitung später gespeichert werden. Oft ist es hilfreich, Ihre Bilder deconvolve, und passen Sie die Helligkeit / Kontrast. Ihre spezifische Bearbeitung Bedürfnisse werden auf der Grundlage des Experiments variieren.
4. Fügen Sie einen relativen Zeitstempel und Maßstab.
5. Um Zellen in 3-D zu sehen, die "3-D Deckkraft" Einstellung. Dies erlaubt eine Drehung der 3-D gerendert Zellen im Raum, wodurch mehrere Perspektiven von Strukturen von Interesse in den Zellen. Hinweis: Es ist hilfreich, um Zellen in unterschiedlichen Ebenen visualisieren zu bestimmen, wo Strukturen von Interesse anzeigen. Zum Beispiel wird in dem "Extended Focus"-Einstellung ist es schwierig zu erkennen, dass die 53BP1 bedeutet in der Tat von der DNA dissoziiert während der Mitose. Dies ist jedoch ohne weiteres ersichtlich in 3-D.
6. Filme und Standbilder können in einer Vielzahl von Dateitypen auf Benutzer Präferenz exportiert werden. i>

D. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel für 53BP1 Foci-Bildung in Abhängigkeit von CPT wird in Abbildung 1 gezeigt. Cells CPT Form Brennpunkte innerhalb von 5-10 min ausgesetzt, und pflegen diese Schwerpunkte während der gesamten Dauer der Aufnahme. Wie in 2, 53BP1 dissoziiert von Chromatin zu Beginn der Mitose gezeigt, Bilden einer dünnen Dunst um den kondensierenden Chromosomen. Als Telophase auftritt und Mitose zu einem Ende kommt, 53BP1 wieder Aggregate in verschiedene Schwerpunkte. Während die HEK293-Zellen wurden nicht CPT ausgesetzt, sie dennoch gebildet reichlich, spontane 53BP1 Reparatur Brennpunkte durch endogene DNA-Schäden erzeugt. Diese Beobachtung erlaubt uns zu dem Schluss, dass 53BP1 nicht bilden Schwerpunkte in der frühen Mitose, im Einklang mit einem früheren Bericht zeigt einen ähnlichen Effekt nach der Exposition von Zellen gegenüber ionisierender Strahlung und radiomimetische Drogen ^5.

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Abbildung 1. Camptothecin (10 uM) und bewirkt DSBs 53BP1 Foci-Bildung in Fibroblasten Rad innerhalb von 30 min der Zugabe des Arzneimittels an das Medium.

Abbildung 2. 53BP1 nicht bilden Schwerpunkte während der Mitose bis telophase/G1 in HEK293 Zellen.

Diskussion

Aufrechterhaltung der genomischen Integrität ist entscheidend für das Überleben der Zelle. Die Nichtbeachtung der Genom führt zu vorzeitigem Altern, Karzinogenese oder Tod ⁸ erhalten. Es gibt intensive Interesse an anspruchsvollen, wie die DDR-Funktionen, die sich aus ihrer Bedeutung sowohl Grundlagen-und klinischen Forschung. Viele Techniken wurden im Laufe der Jahre entwickelt, um bei der Untersuchung, wie Zellen erkennen und zu reparieren DNA-Schädigung zu unterstützen. Traditionelle Methoden wie Imm...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Produkt	Firma
CellStar Kulturschalen	Greiner Bio-One
FluroDish Glasboden Gerichten	World Precision Instruments, Inc.
MEM-Medien	GIBCO
Nicht-essentielle Aminosäuren	GIBCO
Aminosäuren	GIBCO
Vitamine	GIBCO
Natriumpyruvat	Invitrogen
Penicillin / Streptomycin	HyClone
Fötales Rinderserum	GIBCO
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Plasmid 19836	Addgene
PCLNR-H2BG; Plasmid 17735	Addgene
SuperFect	Qiagen
Zeiss Cell Observer SD Imaging Systems	Zeiss
AxioVision (Release 4.8.2)	Zeiss
Zeiss Immersol W Oil	Zeiss
Volocity Software (Version 6,0)	PerkinElmer