DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Özet

Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.

Özet

Çift iplikli sonları (DSBs) en zararlı DNA olan bir hücre karşılaşabilirsiniz Lezyon. Onarılamayan bırakılırsa, DSBs liman büyük potansiyel mutasyonlar ve kromozomal anomaliler ^1. üretmek. DSBs algılamak için hücreler, DNA hasar cevabı (DDR) etkinleştirmek ve DNA tamir için genomik instabilite katalizleyen bu travma önlemek için çok önemlidir. Uyarıldığında, DDR onarım gerçekleşecek ya da apoptoz geçmesi hücre zorlamak için izin vermek için hücre döngüsü tutuklama tetikleyerek genomik bütünlüğünü korumak için çalışır. DSB onarım baskın mekanizmaları nonhomologous sonu katılmadan (NHEJ) ve homolog rekombinasyon tamiri (HRR) ⁽² yorum) yoluyla meydana gelir. Olan faaliyetleri kesin DDR düzgün çalışması için düzenledi gereken pek çok protein vardır. Ve bu proteinlerin birinin, 53BP1 3-boyutlu (D) görselleştirme - Burada, bir 2 için yöntem açıklanmaktadır.

P53-bağlayıcı protein 1 (53BP1) alanlarına lokalize5-15 dakika ⁵ içinde odaklarının oluşturulması, modifiye histon ^3,4 bağlanarak DSBs. DSB sitelerine 53BP1 ve diğer DDR proteinlerin histon modifikasyonlar ve alım hasar bölgelerinin çevresinde kromatin yapısal yeniden düzenlenmesini kolaylaştırmak ve DNA tamir ⁶ katkıda bulunduğuna inanılmaktadır. Tamir doğrudan katılım da ötesinde, ilave rollerin, bir intra-S kapısı, bir G2 / M kontrol noktası, düzenleyici ve aşağı doğru DDR proteinleri ^7-9 aktive olduğu gibi, DDR de 53BP1 için tarif edilmiştir. Son zamanlarda, 53BP1 yerine DSBs ⁶ civarına lokalize önce G1 girmek hücreleri bekliyor, mitoz sırasında indüklenen DNA hasarına yanıt olarak odaklar teşkil etmemektedir keşfedilmiştir. Bu tür 53BP1 gibi DDR proteinleri mitoz ile ^{10 arasındaki} ilerlemesi esnasında mitotik yapılar (kinetochores gibi) ile ilişkilendirmek için tespit edilmiştir.

Bu protokolü biz 2 kullanılmasını tanımlamak - ve 3-D canlı hücre görüntüleme görselleştirmek içinDNA hasarına neden olan ajan kamptotesin (CPT) yanı sıra, mitoz sırasında 53BP1 davranışı yanıt olarak 53BP1 odaklarının oluşumu. Kamptotesin öncelikle DNA replikasyonu sırasında DSBs neden ben inhibitörü bir topoizomeraz olduğunu. Bunu başarmak için, biz daha önce açıklanan 53BP1-mCherry floresan füzyon proteini DSBs ¹¹ bağlamak mümkün bir 53BP1 proteinin etki oluşan inşa kullanılır. Buna ek olarak, bir histon H2B-GFP füzyon proteini floresan mitoz sırasında ¹² hücre döngüsü boyunca ama özellikle kromatin dinamik izlemek mümkün yapı kullanılır. Birden fazla boyutta canlı hücre görüntüleme ökaryotik hücrelerde DDR proteinlerin fonksiyonu anlayışımızı derinleştirmek için mükemmel bir araçtır.

Protokol

A. Hücre Hazırlanması

1. Normal insan primer fibroblast (GM02270) Coriell Hücre Deposu, Camden, New Jersey, elde ve hTERT ⁶ ile ölümsüzleştirdi edilmiştir. Hücreler CellStar yetiştirilen ve genişletilmiştir% 20 fetal bovin serumu (Gibco), non-essential/essential amino asitler, vitaminler, sodyum piruvat, ve penisilin / streptomisin (HyClone ile desteklenmiş MEM oluşan ortam içinde, 6 cm tabaklar (4 ml) ).
2. İnsan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri, American Type Culture Collection'dan temin edilebilir ve CellStar 6 cm tabaklar içinde yetiştirilen ve genişletilmiştir. Hücreler,% 10 fetal bovin serumu, zaruri olmayan amino asitler, L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM, ve penisilin / streptomisin içeren ortam (4 mi) içinde tutuldu.
3. 53BP1-mCherry (N-myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene plazmid 19836) ve H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene plazmid 17735) füzyon geni de puromisin veya G418 direnç genleri ifade yapıları, sırasıyla, (fibrobla transdüklü edildiSTS) ya da transfekte (HEK293) hücrelerin içine SuperFect (Qiagene) kullanarak ve ilaç seçimi altında yapılmaktadır. Floresans Bakım periyodik olarak kontrol edildi.
4. 24-48 saat görüntü elde etme önce, hücreleri tek bir hücre süspansiyonu içine tripsinize edildi ve 3,5 cm FluroDish cam alt plakalar üzerine düşük bir yoğunlukta ekildi.

B. Mikroskop Kurulum ve Image Acquisition

Bu protokol bir AxioObserver Z1 standı, çift kanallı Yokagawa CSU-X1A 5000 iplik disk birimi, 2 Fotometrik QuantEM 512SC emCCD kameralar, bir HXP 120C fiber tabanlı aydınlatıcı, 4 ile donatılmış Zeiss Cep Gözlemci SD iplik diski konfokal mikroskop kullanılarak geliştirilmiştir lazerler (Bir Lasos 100mW multi-line Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm diyot, 40 mW 561 nm diyot, ve 30 mW 635 nm diyot), AOTF bir Pecon XL multiS1 sahne kuluçka sistemi, Zeiss inkübasyon modülleri (O ₂ Modül S, CO ₂ Modül G, TempModule S, Isıtma Ünitesi XL S) ve Geçmiş moBir NanoScanZ piezo Z ekiyle torized XY tablası. Görüntüleme canlı hücreleri sulu bir ortamda, bir C-Apochromat 63x/1.20 Su / Corr objektif lens ve Zeiss İmmersol W daldırma sıvısı (bir kırılma indisi n = 1.334) ile desteklenir ise küresel sapmaları en aza indirmek için kullanılmıştır. 2 kanal konfokal görüntüleme, bir RQFT 405/488/568/647 dikroik ayna ve BP525/50 (yeşil) ve BP629/62 için (kırmızı) emisyon filtresi kullanılmıştır. Kullanılan sistem yazılımı AV4 Multi-channel/Z/T, Hızlı Görüntüleme, Fizyoloji, Mosaix, Mark & ​​Bul, Çift Kamera, 4D İçeride, Otofokus ve 3-D Dekonvolüsyon modülleri ile Zeiss Axiovision (vers. 4.8.2.0) idi.

1. O CO ₂ gazı kuluçka sisteminin CO ₂ Modül için çalışıyor olduğundan emin olun. Mikroskop bir anti-titreşim hava tablo tarafından destekleniyorsa, hava tablo için hava beslemesi (veya N ₂ gazı) açın.
2. Iplik disk birimi, kameralar, kuluçka modülleri, HXP aydınlatıcı, motorlu sahne, Argon, mikroskop standı için gücü açınlazer ve bilgisayar.
3. Isınma süresi 1 dakika sonra, "On" Argon lazer için kontak anahtarını açın.
4. Zeiss lazer kontrol panelinde kullanılacak lazer çizgileri için anahtarları açın.
5. "Lazer run" için "bekleme" dan Lasos Argon lazer denetleyicisi için geçiş anahtarı açın ve optimum düzeyde (sadece aşağıdaki yani yeşil gösterge kırmızı yanar noktası) ışık denetleyicisi ayarlayın.
6. AxioVision yazılımını başlatın Not:. AxioVision için kullanıcı arayüzü, denetlediği özel mikroskop ve bileşenler için belirli olan pencere ve açılan menüleri ile özelleştirilmiş olabilir. Bunun gibi, her sistem potansiyel olarak benzersiz bir arayüze sahiptir. Bu nedenle, yazılım manipülasyonu için genel talimatlar yerine özel yazılım pencereler, sekmeler ve / veya açılır menüler için yön daha sonraki adımlarda verilmiştir.
7. Görüntüleme öncesinde yaklaşık 1 saat, yazılım, kuvöz için denetimlerini bulmak veüst kamara ve sahne plaka ısıtma açın. 37 ° C'ye sıcaklığı ayarlayın CO ₂ kontrol açın ve% 5 seviyesini ayarlayın.
8. Görüntüleme için objektif lens seçin. Bu çalışmada, bir 63x/1.20 NA C-Apochromat Su / Corr objektif lens kullanılmıştır Not:. Bu lens için, su (Zeiss İmmersol B daldırma sıvı) 'e benzer bir kırılma indisi olan bir daldırma ortamı ihtiyaç vardır.
9. Birden fazla ayrı konumları, uzun bir süre boyunca örneklenmesi için ise, bu bir konumdan diğerine yapılmasını sağlamak için daldırma orta yeterli bir miktarı uygulamak için emin olmak.
10. Sahnede çanak yerleştirin ve alt temas objektif lens getirmek.
11. Mikroskop denetimleri veya yazılımı kullanarak, göz mercekleri için yaydığı ışığın yönlendirmek ve uygun Widefield filtre ilgi floresan sinyal (bu çalışma için, "Kırmızı" filtresi 53BP1 ve "GFP" filtre için ayarlanan H2B için belirlenen için belirlenen seçin ).
12. , Oküler lensler sayesinde görüntüle Görüntüyü odaklamak ve hücrelerin uygun bir alan bulun.
13. Yazılım veya mikroskop denetimlerini kullanarak, konfokal dönen disk ünitesi ile bağlantı noktasına okuler dan yayılan ışık uzak yönlendirmek.
14. Yazılım, uygun lazer (Bu çalışmada, 53BP1 için 561 nm lazer ve H2B için Argon lazer 488 nm hattı için) açın.
15. Her kanal için uygun bir seviyeye acousto-optik ayarlanabilir filtre (AOTF) kontrol ayarlayarak lazer yoğunluğunu ayarlayın.
16. Uygun dikroik ayna (RQFT 405/488/568/647) ve emisyon filtresi (H2B için 53BP1 ve BP 525/50 BP 629/62) seçin. Dönen disk ünitesi için deklanşör açın.
17. Görüş mevcut alanı görüntülemek için "Canlı" penceresini seçin.
18. Yazılımda, "Kamera" kontrol açmak, kamera (çift kamera sistemi varsa) kullanılacak seçin ve yaklaşık 100 ms pozlama süresini ayarlayın. % Ayarlayın ve EM kazanmak yerde sınıflandırılmamış olarak. Gerekli veri Not: 53BP1-mCherry yapı biraz loş görünür. Biz EM kazancı artırmak için yararlı buldu.
19. Yazılımda, konfokal dönen disk ünitesi için kontrol panelini açmak ve uygun bir görüntü (örneğin ~ 100 ms) yakalamak için kuruldu kamera pozlama süresini girerek dönen disk hızını ayarlayabilirsiniz. Değişiklik kilitlemek için "Set" i tıklayın.
20. "Çok boyutlu kazanım" açın. Kanal sekmesini seçin ve yük / uygun kanalları seçmek. Bu araştırma için, DsRed (561 nm lazer uyarma ve BP 629 / emisyon için 62 filtre) ve GFP (eksitasyon ve emisyon için BP525/50 filtresi için 488 nm lazer hattı) için tanımlanan kanalları kullanarak ediyoruz.
21. Görüntü kaydı sağlamak için, ortak bir dikroik ayna (RQFT 405/488/568/647) iki kanal için kullanılmıştır. "Otofokus" için yazılım ayarlayın Not:. MDA ayarlarını yapmak için Araçlar → Ayarlar editörü gidin. Yeterli lazer güç ("Yeterli lazer güç" sağlayan bir etken olarak ayarlandığından emin olunfoto-ağartma azaltırken) uygun fluorofor heyecanlandırmak için.
22. MDA penceresinde, z-yığını sekmesini seçin. "Z-yığın geçerli odak konumda" seçeneğini seçin. Z-yığınının tam boyutu hücre yükseklik bağlıdır: ~ 10 mikron z-yığını ve Z. Not yoluyla Nyquist örnekleme sağlamak için adım sayısı için "optimum" seçmek için aralığı ayarlayın. Buna göre ayarlayın.
23. 23. "Başlat" ve ayarları soruşturma ne uygun olmasını sağlamak için çıkan z-yığın görüntüyü analiz tıklayın (örn. Bu çalışmada, bu görüntü tüm çekirdeğine önemliydi).
24. "T" (zaman) sekmesini seçin. Kamptotesin ile denemeniz için, 5 dakika ve bir kontrol (arıtılmamış hücreleri) video için 1 saat için oturumun toplam süresi görüntüleme zaman noktalarında arasındaki süreyi ayarlamak Not:. Hücrelerinin fotoğraf beyazlatma en aza indirmek için, deney yapılandırılmış olması gerekir gibi görüntüleme zamanı noktaları arasındaki AOTF boşlukları lazer olduğunu.
25. Fveya çanak çeşitli hücrelerin çoklu nokta görüntüleme, MDA penceresinde, pozisyon sekmesini seçin. Kontrol edilir "başına konum 'zaman noktasında önce / sonra ayar' Uygula". Olun "Mark_Find" seçeneğini seçin. "Canlı" görünümünü kullanarak, etrafında hareket ettirin ve görünümü uygun alanları seçin.
26. Deneme başlayacak ve (işlenmemiş hücrelerin) bir kontrol video kaydetmek için çok boyutlu edinme menüden "Başlat" a tıklayın.
27. Kontrolü video sonra, uygun işlem (Bu durumda, 10 uM kamptotesin içinde) ilave edin. Biz 2-4 saat için 5-10 dk aralıklarla deneysel (ilaçla tedavi hücreleri) video kaydı Not:. Dikkate almak önemli bir konu, belirli bir etkisi tedavi sonrası meydana geldiği ile hızıdır. Video da görüldüğü gibi, 53BP1 odakları CPT eklenmesinden sonra ~ 5 dk başlar. Nispeten kolay bir süreç, elle çanak ilaç ekleyerek ve mikroskop yeniden kalibre zaman alıyor olsa. Deneyler tasarlarken göz önünde bulundurulması Bu verilmelidir.
28. M izlenmesi içinitosis, biz 7.5 dk aralığını ayarlayabilir ve 4-5 saat (belirli ayarları kullanılan hücre dizisi ve onun hücre döngüsünün süresine bağlıdır) kaydedildi. Ayarlamalar uzun kayıt sırasında foto-ağartma önlemek için yapılması gerekebilir.

C. Görüntü İşleme ve Analizi

Bu protokol Volocity yazılımı (Perkin Elmer) kullanılarak geliştirildi. Bu veriler (AxioVision) elde etmek için kullanılan yazılım aynı zamanda görüntü işleme ve analiz yeteneğine sahiptir. Kullanıcılar kendilerine sunulan yazılımları kullanabilir ve bunların uygulanmasına ilişkin ilgili literatür danışmak için teşvik edilir.

1. Volocity yazılımını açın. Oluşturun ve yeni bir kütüphane adlandırın ve video dosyalarını içe.
2. Dosyalarını görüntülemek için, biz genellikle "Genişletilmiş Odak" ayarını kullanmak için en yararlı buluyorum. Bu z-yığını dilimleri üst üste bindirir ve bu protokol için, bize çekirdeğin farklı alanlarda 53BP1 odaklar görüntülemenizi sağlar.
3. Gerektiğinde videoları ayarlayın. Volocity alınan görüntülerin kalitesini artırmak için bir araç yelpazesi ile donatılmıştır. Mikroskop ayarlarının uygun olduğunu sağlayarak, çok zaman sonra düzenleme kaydedilebilir. Çoğu zaman, bu görüntüleri deconvolve ve parlaklık / kontrast ayarlamak için yardımcı olur. Sizin özel düzenleme ihtiyaçları deneye dayanan değişecektir.
4. Göreli bir zaman damgası ve ölçek çubuğu ekleyin.
5. 3-D hücreleri görüntülemek için, "3-D Saydamlık" ayarına getirin. Bu nedenle hücre içinde ilgi yapıların farklı bakış açıları sağlayarak, uzayda 3 boyutlu render hücrelerin rotasyonu verir Not:. It belirlemek için farklı düzlemlerde hücreleri görselleştirmek için yardımcı olduğu faiz seyahat yapıları. Örneğin, "Genişletilmiş Focus" bir ortamda bu 53BP1, aslında, mitoz sırasında DNA dan ayrıştırmak olmadığını anlamak için zordur. Ancak, bu 3-D kolayca görülmektedir.
6. Filmler ve hareketsiz görüntüler kullanıcı tercihlerine göre dosya türleri çeşitli içine ihraç edilebilir. i>

D. Temsilcisi Sonuçlar

CPT yanıt olarak 53BP1 odak oluşumu bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Hücreler 5-10 dk içinde CPT formu odaklar maruz, ve kayıt süresi boyunca bu odaklar korumak. Gibi yoğuşmalı kromozomların etrafında ince bir sis oluşturarak, Şekil 2, mitoz başlangıcında kromatin adlı 53BP1 dissosiye gösterilmiştir. Telofaz oluşur ve mitoz sona gelince, farklı odaklar haline 53BP1 tekrar agregalar. HEK293 hücreleri CPT maruz kalmamış olsa da, yine de endojen DNA hasarı tarafından üretilen bol, spontan 53BP1 onarım odakları oluşur. Bu gözlem bizi 53BP1 iyonizan radyasyon ve radyomimetik ilaçlar ⁵ hücrelerin maruz kaldıktan sonra benzer bir etki gösteren bir önceki raporu doğrultusunda, erken mitoz sırasında odak teşkil etmemektedir sonucuna izin.

ure 1 "src =" / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg "/>
Şekil 1. Kamptotesin (10 uM) DSBs ve orta için ilaç ekleme 30 dakika içerisinde fibroblastlar döngüsünde 53BP1 odaklar oluşumuna neden olur.

Şekil 2. 53BP1 HEK293 hücrelerinde telophase/G1 kadar mitoz sırasında odaklar oluşturmaz.

Tartışmalar

Genomik bütünlüğünün korunması hücrenin yaşaması için önemlidir. Erken yaşlanma, karsinogenez veya ölüm ⁸ genom sonuçları korumak için başarısızlık. Sezmek yoğun ilgi var nasıl temel ve klinik hem de araştırma için önemini kaynaklanan DDR fonksiyonları. Birçok teknikleri hücreleri algılamak ve DNA hasarı onarmak nasıl çalışmaya yardımcı olmak için yıllar içinde geliştirilmiştir. Teknolojideki son gelişmeler giderek daha sofistike yöntemler gelişmeye izin olsa blo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ürün	Şirket
CellStar kültür tabaklarında	Greiner Bio-one
FluroDish cam alt yemekler	Dünya Precision Instruments, Inc
MEM ortam	GIBCO
Non-esansiyel amino asitler	GIBCO
Amino asitler	GIBCO
Vitaminler	GIBCO
Sodyum piruvat	Invitrogen
Penisilin / Streptomisin	HyClone
Fetal Bovine Serum	GIBCO
N-myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836	Addgene
pCLNR-H2BG; plasmid 17735	Addgene
SuperFect	Qiagen
Zeiss Cep Gözlemci SD Görüntüleme sistemi	Zeiss
AxioVision (sürüm 4.8.2)	Zeiss
Zeiss İmmersol W Yağı	Zeiss
Volocity yazılımı (sürüm 6.0)	Perkin Elmer