在活体成像系统（IVIS）的神经侵入性脑炎病毒的检测

摘要

利用荧光素酶和体内成像系统（IVIS）作为一种新型的装置，以确定疾病临床发展发生之前的端点。 IVIS使我们能够实时的可视化入侵的脑炎病毒多天，为今后的研究提供了更精确的疾病模型。它也使我们能够找出潜在的抗病毒药物和疫苗的保护功能，速度比目前使用的动物模型。利用动物个体在多个时间点的能力，确保减少动物的要求，成本和总体发病率疾病的研究更人性化，更科学的方法确保使用的动物。

摘要

现代影像技术的进步，鼓励进一步发展和完善的方式来完成病毒的研究。最初提出的罗素和伯奇在休谟的3R原则（替代，减少，细化），利用动物模型，在科学研究上不断的压力，寻找新的方法来减少动物的使用量，同时提高科学性，准确性和速度。然而，休谟的校长面临的一个主要挑战是如何确保统计准确，同时减少动物疾病的发病率和总人数的研究。目前疫苗的药效学研究需要大量的动物才能被认为有统计学显着性，往往导致高发病率和高死亡率的端点识别的免疫保护。我们利用在体内成像系统（IVIS）一并萤火虫生物发光酶逐步跟踪由ENCE的中枢神经系统（CNS）的入侵小鼠模型中phalitic病毒。通常情况下，疾病的进展相对缓慢，但病毒复制是快速的，尤其是在中枢神经系统内，并且可以导致一个经常，致命的结果。 TC83 - 吕克·鼻内感染的小鼠后，委内瑞拉马脑炎病毒株的减毒修改，以表达荧光素酶基因，我们能够可视化的​​大脑内的病毒复制前至少3天的临床疾病症状的发展。脑炎病的一个关键发展端点，我们能够迅速地确定治疗和疫苗的保护，对TC83 - 吕克感染临床症状之前，利用CNS入侵的。通过IVIS技术，我们是能够表现出快速，准确的检测，药物治疗和疫苗，同时减少动物的数量和发病率。

研究方案

1。动物准备

1. 动物到达:到达后的动物生物安全2级（ABSL2）设施，让动物至少2天，新的环境适应。在此之后的休息时间，检查动物，以评估他们的健康和整体的物理外观。
   1. 利用荧光记者时，重要的是把所有的动物主题上苜蓿免费饮食，以限制GI量的自体荧光和背景信号。
2. 剃须动物:为了提高从颅地区发现的生物发光信号，在成像过程中，所有的动物剃了头。麻醉的动物与氧气的混合物，并蒸发异氟醚。 ，一旦动物是完全麻醉，使用电推剪剃光头。一旦完成剃须，回到笼子里的动物，完全恢复的麻醉效果观察。
3. 生物军医数据系统（BMDS）转发器插入（后剃须的小鼠的动物完全麻醉）:对于微创的方法来跟踪温度的预​​编程的BMDS无线转发器，皮下植入每个鼠标的背部区域。这些转发器允许无线识别和温度记录。植入的应答之后，应用兽医级组织粘合剂到伤口上。
4. 基线集合:所有的动物，感染前，记录的基准温度和重量。采集血液的蚀斑减少中和试验（PRNT）分析，通过复古轨道（RO）出血，而老鼠是在麻醉状态下。采血后，申请兽用抗生素眼膏，以减少潜在的继发性细菌感染。考虑应该完成与此基准线集合动物被放置在麻醉下，由于应力对小鼠的数目的次数。未来的RO收藏小号hould完成后成像，而鼠标仍然是麻醉状态下。从RO的最大收集血液，应该是约200微升。
5. 感染:将小鼠麻醉下，如前面所述。接种通过鼻内途径，使用剂量为5×10 ⁶至5×10 ⁷ pfu的TC83-萤光素酶中的总体积为40微升稀释的磷酸缓冲盐水（PBS）中，通过鼻内感染。感染后，将老鼠他们的住房笼子内，观察复苏。

2。动物影像

免责声明:在他们的住房单元，生物安全柜（BSC），或者的XIC遏制框在任何时候都养老鼠。此协议经批准的BSC是一类II型B1或B2。

1. 注入所有动物用10微升的15毫克/毫升的浓度在每克体重腹腔内（IP）的萤光素。
   1. 小鼠接受Ampligen是injecteD IP剂量为12.5毫克/千克体重-4小时后感染或感染后48小时，根据他们的小组。
2. 在注射之前，与荧光素，分离成三个一组的小鼠XIC-3遏制方块内，以确保一个适当的配合。
   1. 对于所有的成像，利用眼软膏/润滑剂，以防止整个手术过程中的干燥的角膜。
3. 打开LivingImage软件，然后按初始化准备的成像盒，设置自动保存为自动，曝光时间（汽车的LivingImage软件3.2和更高版本的新功能，曝光时间），视场为C，打开过滤器;领域根据小鼠的数目，你是成像视图和过滤器可以被优化，如所需的其他成像项目。
4. 确认没有过期的空气活性炭过滤器，氧气罐是满的，充满异氟醚水库。在XIC-3我将一小条一小条的电工胶带溶胶箱，有助于减少动物的运动，在成像过程中。
5. 注入小鼠荧光素的IP在2.1节和地方3-5分钟内异氟醚诱导室（盖打开）。
6. 5分钟后，关上盖子的感应室和异氟醚的流动。麻醉操作与氧流量设定在约3-5％，在约2.0升/分钟。一旦完全无意识再等待30秒，将小鼠的XIC-3的隔离箱。确保所使用的生物安全柜可清除异氟醚的安全，此过程将涉及损失的异氟醚的感应室（IVIS包含它自己的无源公平罐和XIC-3围堵箱/插座直接连接以确保载流）麻醉。
   1. 根据芯片/组号码的小鼠转移到XIC-3的异氟醚连接器连接的隔离箱D打开。位置的小鼠，使他们在胸骨斜卧头轻轻地搭在带。
7. 用乙醇，喷雾的手和底部的XIC-3与cavicide擦拭XIC遏制框中，并转移到IVIS成像室。重新连接的麻醉遏制盒里面的成像单元。
8. 10分钟后的萤光素的注射后，图像小鼠通过生物体的图像处理软件。
9. 在最初的影像以开放的过滤器，启动DLIT的3维成像，生物发光的萤火虫荧光素酶的序列分析和图像向导设置。这种成像过程将需要4-5分钟，并应完成的观点相关的所需的小鼠数目的字段。
   1. 离体分析以下剖检和收集的大脑。将大脑在无菌培养皿中，滴50-100μl的股票萤光素之上，而在IMA晋框。
10. 最后完成第二次公开滤波器图像DLIT成像完成后，在15-17分钟后感染。确保序列分析和领域的视图和过滤器设置恢复到以前的设置。

3。返回老鼠和数据分析

1. 关闭异氟醚蒸发器和传输XIC遏制框生物安全柜。
2. 他们的住房单元内，将小鼠背部，合上，喷洒适当的消毒剂并放回外壳上的机架外部。
   1. 确保小鼠从麻醉中完全康复。
3. 重复上述步骤，直到完成成像的实验需要。
4. 消毒BSC，关闭设备，将所有数据传输到外部实验室的位置，作进一步的分析。
5. 的数据进行分析，并生成IVIS结果利用率根据3维图像lizing LivingImage软件。
   1. 确保图像的正确导向，照明/色彩平衡设置。在工具选项板的选项包括影像调整，修正，图像信息，和投资回报率的工具。
   2. 利用ROI的形状，以确定具体的基于位置的信号强度。
   3. 突出的鼠身的表面形貌重建，初始化3D DLIT重建，并使用线性适合器官地图，地形重建。
6. 通过收集的血液和器官，就可以完成进一步的病毒滴定分析。在这项研究中的滴定完成通过同质化改性的鹰培养基（MEM）中的脑组织。将匀浆液连续稀释，我们感染6孔板Vero细胞1小时。将细胞用1.5％的agarose/2xMEM重叠覆盖，在37℃孵育2天。 30分钟，用10％福尔马林固定细胞，染色结晶紫。

结果

的基因修饰的病毒，TC83荧光素酶，我们看到在生物发光信号强度的增加，作为病毒的复制移动到中央的中枢神经系统（ 图1），从鼻区域。由于高的病毒的复制率，我们期望看到的生物发光信号（ 图2A）的高浓度的取决于载体和动物的免疫反应的载体。我们预计这个信号的增加继续到了顶峰，感染后5-7天之间，在中枢神经系统内的病毒复制高峰（ 图2B）的组?...

讨论

虽然该协议涵盖了成像方面， 在体内分析，为今后的研究中的一个关键因素，重要的是要认识到生物发光的矢量。我们利用TC83，作为表达的荧光素酶的载体的减毒疫苗株VEEV确保正在生产大量的酶，由于如先前描述的^1-4在中枢神经系统中的病毒的高复制率。虽然除了一个第二次基因组启动子和荧光素酶基因的重组病毒进一步衰减结果相比，野生型TC83，这种衰减不出现感染⁵?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
D-荧光素
异氟醚
精诺真IVIS系统（频谱）	卡尺生命科学
XGI-8气体​​麻醉系统	卡尺生命科学
XIC-3围堵箱	卡尺生命科学
LivingImage 4.0软件	卡尺生命科学
遥测/认筹	生物军医数据系统	IPTT-300	动物ID和回火ATURE
BD的INTEGRA1毫升TB 26 GX 3/8"针注射器	Fisher Scientific则	305279
兽医债券组织粘合剂	Fisher Scientific则	NC9259532
Vetropolycin眼药膏	韦伯斯特兽医产品	78444656
Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水1X	Invitrogen公司	14190-144
BMDS芯片阅读器	生物军医数据系统	DAS-7007S
DAS-HOST软件	生物军医数据系统		用于下载的探测信息