En Vivo Imaging Systems (IVIS) La detección de un virus invasor Neuro-encefálico

Resumen

Utilizando luciferasa y los sistemas de formación de imágenes in vivo (IVIS) como un nuevo medio para identificar las variables de enfermedad antes de los desarrollos clínicos ocurrir. IVIS nos ha permitido visualizar en tiempo real la invasión de los virus de encefalitis durante varios días, ofreciendo un modelo de enfermedad más preciso para el estudio futuro. También ha permitido identificar las características potenciales de protección de antivirales y vacunas más rápido que los modelos animales utilizados actualmente. La capacidad de utilizar animales individuales a través de múltiples puntos de tiempo asegura la reducción de las condiciones de policía, los costos y la morbilidad global a los animales utilizados garantizar un medio más humano y más científico de estudio de la enfermedad.

Resumen

Los avances modernos en tecnología de imagen fomenten el desarrollo y refinamiento en la forma en que se realiza la investigación viral. Inicialmente propuesto por Russel y Burch en 3Rs Hume (reemplazo, reducción, refinamiento), la utilización de modelos animales en la investigación científica está bajo presión constante para identificar nuevas metodologías para reducir el uso de animales al tiempo que mejora la precisión científica y la velocidad. Un reto importante para los directores de Hume sin embargo, es cómo asegurar que los estudios son estadísticamente precisos y reducir la morbilidad de las enfermedades animales y los números totales. Estudios de eficacia de las vacunas actualmente se requiere un gran número de animales con el fin de ser considerado estadísticamente significativo y a menudo resultan en una alta morbilidad y mortalidad de los puntos finales para la identificación de la protección inmune. Hemos utilizado los sistemas de formación de imágenes in vivo (IVIS) en conjunción con una enzima de luciérnaga bioluminiscente para rastrear progresivamente la invasión del sistema nervioso central (SNC) por un renciavirus phalitic en un modelo murino. Típicamente, la enfermedad avanza de forma relativamente lenta, pero, la replicación del virus es rápida, especialmente en el SNC, y puede conducir a una frecuencia, resultado letal. Después de la infección intranasal de los ratones con TC83-Luc, una cepa atenuada venezolana virus de la encefalitis equina modificado para expresa un gen de la luciferasa, somos capaces de visualizar la replicación del virus dentro del cerebro por lo menos tres días antes de la aparición de síntomas clínicos de la enfermedad. Utilizando invasión del SNC como una clave de punto final encefalítica desarrollo de la enfermedad que son capaces de identificar rápidamente terapéutico y protección de la vacuna contra TC83-Luc infección antes de desarrollar los síntomas clínicos. Con la tecnología IVIS somos capaces de demostrar la prueba rápida y precisa de la terapéutica de fármacos y vacunas al tiempo que reduce el número de animales y la morbilidad.

Protocolo

1. Preparación Animal

1. Llegada Animal: Al llegar al nivel de Bioseguridad Animal 2 (ABSL2) instalaciones, permiten a los animales un mínimo de 2 días para aclimatarse a su nuevo entorno. Tras este período de descanso, inspeccionar a los animales para evaluar su salud y apariencia física en general.
   1. Cuando se utilizan los reporteros fluorescentes es importante para situar todos los sujetos animales con una dieta libre de alfalfa para limitar la cantidad de autofluorescencia GI y la señal de fondo.
2. Afeitado animales: Para mejorar la señal bioluminiscente detectado desde la región craneal durante la exploración; afeitarse las cabezas de todos los animales. Anestesiar a los animales con una mezcla de oxígeno y gas vaporizado isoflurano. Una vez que los animales son completamente anestesiado, usar maquinillas eléctricas de afeitar sus cabezas. Una vez finalizado el afeitado, devolver los animales a sus jaulas y observar para la recuperación completa de los efectos de la anestesia.
3. Bio Medic DataSystems (CMBD) de transpondedor de inserción (que tendrá lugar tras el afeitado de los ratones, mientras que los animales están completamente anestesiados): Para un medio menos invasivos para el seguimiento de un implante temperatura preprogramada BMDS transponder inalámbrica vía subcutánea en la región dorsal de cada ratón. Estos transpondedores permiten la identificación inalámbrica y registro de la temperatura. Tras la implantación del transpondedor, aplicar un adhesivo de tejido veterinario de grado a la herida.
4. Colección de referencia: Antes de la infección, registre una temperatura de referencia y el peso de todos los animales. Recoger la sangre por neutralización por reducción de placas de prueba (PRNT) el análisis a través de retro-orbitales (RO) de purga mientras que los ratones están bajo anestesia. Tras la extracción de sangre, aplique ungüento antibiótico veterinario ojo para reducir el potencial de infección bacteriana secundaria. Esta colección de línea de base debe ser completada con consideración a la cantidad de veces que los animales se colocaron bajo anestesia debido a la tensión en los ratones. Las futuras colecciones ro should ser completada después de formación de imágenes, mientras que el ratón está todavía bajo anestesia. La sangre obtenida de un máximo RO debe estar alrededor de 200 l.
5. Infección: ratones a cabo bajo anestesia como se describe anteriormente. Inocular a través de la vía intranasal con una dosis de 5x10 a 5x10 ^{6 7} ufp TC83-luciferasa en un volumen total de 40 l diluido por Tampón fosfato salino (PBS) a través de la infección intranasal. Después de la infección, los ratones colocar dentro de su jaula de alojamiento y observar la recuperación.

2. Animal de imágenes

Descargo de responsabilidad: mantener a los ratones dentro de su unidad de vivienda, el gabinete de seguridad biológica (BSC) o el cuadro de contención XIC en todo momento. El BSC aprobados para este protocolo son una clase B1 o B2 Tipo II.

1. Inyectar todos los animales con 10 l por gramo de peso corporal de intraperitoneal (IP) luciferina en una concentración de 15 mg / ml.
   1. Los ratones que recibieron Ampligen son para ser injected IP a una dosis de 12,5 mg de peso corporal / kg a -4 h después de la infección o 48 h después de la infección en base a su grupo.
2. Antes de la inyección con luciferina, separar los ratones en grupos de tres a asegurar un ajuste apropiado dentro de la caja de contención XIC-3.
   1. Para todos obtención de imágenes, utilizar pomada ocular / lubricante para evitar el secado de la córnea durante todo el procedimiento.
3. Abra el software LivingImage y pulse Iniciar para preparar el cuadro de imagen, ahorro de ajuste automático, el tiempo de exposición en automático (tiempo de exposición de automóviles es una nueva característica del software LivingImage 3.2 y posteriores), ver el campo a C, y el filtro para abrir; campo de vista se basa en el número de ratones que son imágenes; filtro y se puede optimizar según sea necesario para los proyectos de diagnóstico por imágenes.
4. Asegúrese de que los filtros de carbón del aire no han expirado, el tanque de oxígeno está llena, y el depósito lleno se isoflurano. Coloque pequeñas tiras de cinta aislante en la XIC-3 icaja solation que ayuda a reducir el movimiento de animales durante la exploración.
5. Inyectar a los ratones con IP luciferina como se describe en la sección 2.1 y el lugar dentro de la cámara de inducción isoflurano (con la tapa abierta) durante 3-5 min.
6. Después de 5 min, cerrar la tapa de la cámara de inducción e iniciar el flujo de isoflurano. El anestésico se hace funcionar a aproximadamente 3-5% de oxígeno con el conjunto de velocidad de flujo de aproximadamente 2,0 L / min. Una vez completamente inconsciente esperar otros 30 segundos y la transferencia de los ratones a la caja de aislamiento XIC-3. Asegúrese de que el gabinete de bioseguridad que se utilizan para el seguro permite la compactación de isoflurano ya que este procedimiento implicará la pérdida de isoflurano de la cámara de inducción (la unidad IVIS contiene sus propios recipientes pasivos Justo y la caja de contención XIC-3 se conecta directamente a la entrada / salida de sockets para asegurar contenida flujo anestésico).
   1. Transfiera los ratones en base a número de chip / grupo en el cuadro de aislamiento XIC-3 con el conector conectado un isofluranod abrir. Coloque los ratones para que ellos se ponen en decúbito esternal con la cabeza suavemente descansando sobre las tiras de cinta.
7. Limpie la caja de contención XIC con las manos etanol spray, y el fondo del XIC-3 con Cavicide, y transferir a la cámara de imágenes IVIS. Vuelva a conectar la anestesia a la caja de contención una vez dentro de la unidad de imagen.
8. Después de 10 min después de la inyección de luciferina, la imagen de los ratones a través del software de imagen viva.
9. Siguiendo imagen inicial con un filtro abierto, iniciar un dlit 3-Dimensional imágenes usando el análisis de la secuencia y la configuración de imagen Asistente para bioluminiscente luciferasa de luciérnaga. Este proceso de formación de imágenes se llevará a 4-5 min y se debe completar en un campo de vista relevantes para el número de ratones deseados.
   1. Ex-vivo análisis es posible siguiente necropsia y recolección del cerebro. Coloque el cerebro en una placa de Petri estéril, goteo 50-100 l de acciones luciferina en la parte superior, y el lugar dentro de la imaging caja.
10. Finalizar un segundo filtro de imagen abierto en 15-17 min después de la infección sobre la terminación de la imagen dlit. Asegúrese de análisis de la secuencia está apagado y el campo de visión y la configuración de los filtros se devuelven a la configuración anterior.

3. Ratones retorno y Análisis de Datos

1. Apague el vaporizador de isoflurano y transferir la caja de contención XIC de nuevo a la cabina de bioseguridad.
2. Coloque los ratones de vuelta dentro de su vivienda, cierre la tapa, rocíe el exterior con un desinfectante apropiado y vuelva a colocarlo en el estante de la vivienda.
   1. Asegurar que los ratones se haya recuperado de la anestesia.
3. Repita el procedimiento anterior según el experimento requiere hasta que imagen se ha completado.
4. Desinfectar el BSC, apagar el equipo, y transferir todos los datos a una ubicación fuera de laboratorio para un análisis adicional.
5. Analizar los datos y generar imágenes en 3 dimensiones sobre la base de los resultados de IVIS utiLizing el software LivingImage.
   1. Asegúrese de que la imagen está correctamente orientada y la iluminación / balance de color se establece. Dentro de la paleta de herramientas las opciones incluyen ajuste de imagen, correcciones, datos de imagen y herramientas de ROI.
   2. Utilizar las formas de ROI para identificar los puntos fuertes específicos de señales basados ​​en ubicación.
   3. Reconstruir la topografía de la superficie para resaltar el cuerpo del ratón, inicializar reconstrucción 3D dlit, y utilizar en forma lineal para ajustar el mapa órgano para la reconstrucción topográfica.
6. Un análisis más detallado de titulación viral se puede completar mediante la recogida de sangre y órganos. Titulación en este estudio se completó mediante la homogeneización de tejido cerebral en medio de Eagle modificado (MEM). El homogeneizado se diluyó en serie y se infectaron una placa de 6 pocillos de células Vero durante 1 hr. Las células se cubrieron con una capa de agarose/2xMEM 1,5% y se incubaron durante 2 días a 37 grados. Las células fueron fijadas con 10% de formalina durante 30 min y se tiñeron concristal violeta.

Resultados

Con un virus genéticamente modificado, TC83-luciferasa, hemos visto un aumento en la intensidad de la señal bioluminiscente como la replicación del virus se mueve desde la región nasal en el SNC centrales (Figura 1). Debido a la tasa de replicación viral alta, esperamos que los niveles altos de señal bioluminiscente (Figura 2A) que dependen del vector y la respuesta del animal inmune contra el vector. Esperamos que este aumento de la señal de seguir un pico, entre la infección d...

Discusión

Si bien este protocolo cubre los aspectos de formación de imágenes para el análisis in vivo, es importante reconocer el vector bioluminiscente como un factor clave para futuros estudios. Nuestra utilización de TC83, una cepa de vacuna atenuada de VEEV, como un vector para la expresión de la luciferasa asegura que grandes cantidades de la enzima se producen debido a la alta tasa de replicación del virus en el SNC como se describió previamente ^1-4. Mientras que la adición de un promoto...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
D-luciferina
El isoflurano
Xenogen IVIS System (Spectrum)	Caliper Life Sciences
XGI-8-gas Anestesia Sistema	Caliper Life Sciences
XIC-3 Caja de Contención	Caliper Life Sciences
LivingImage 4.0 Software	Caliper Life Sciences
Telemetría / identificación fichas	Bio Medic Data Systems	IPTT-300	Identificación Animal y TemperATURALEZA
BD Integra jeringa de 1 ml con 26 TB gx 3/8 "aguja	Fisher Scientific	305279
Bond Vet tejido adhesivo	Fisher Scientific	NC9259532
Vetropolycin Ungüento Oftálmico	Webster veterinarios	78444656
Fosfato de Dulbecco 1X solución salina tamponada	Invitrogen	14190-144
BMDS chip lector	Bio Medic Data Systems	DAS-7007S
DAS-HOST Software	Bio Medic Data Systems		Se utiliza para descargar información de la sonda