В Vivo Imaging Systems (ИВИС) Обнаружение Нейро-инвазивная Вирус энцефалита

Резюме

Используя люциферазы и в естественных систем визуализации (ИВИС) в качестве нового средства выявления заболевания до появления клинических конечных точках события происходят. ИВИС позволили нам визуализировать в реальном времени вторжения вирусов энцефалита в течение нескольких дней, обеспечивая более точное заболевание моделью для будущих исследований. Это также позволило нам выявить потенциальные защитные свойства противовирусных препаратов и вакцин быстрее, чем в настоящее время применяются животных моделях. Возможность использования отдельных животных в течение нескольких моментов времени обеспечивает уменьшить животное требований, затрат и общей заболеваемости на животных использовались обеспечения более гуманного и более научными средствами болезни исследовании.

Аннотация

Современные достижения в области технологий визуализации способствовать дальнейшему развитию и совершенствованию на пути вирусных исследований выполнена. Первоначально предложенный Расселом и Burch в 3Rs Юма (замена, восстановление, уточнение), использование животных моделей в научных исследованиях находится под постоянным давлением для выявления новых методологий для уменьшения использования животных при одновременном повышении научной точностью и скоростью. Одна из основных задач для директора Юма, однако, в том, как обеспечить исследования являются статистически точным при одновременном снижении животных заболеваемости и общего числа. Исследования Эффективность вакцины в настоящее время требуют большого количества животных для того, чтобы считать статистически значимым и часто приводит к высокой заболеваемости и смертности конечные точки для определения иммунной защиты. Мы использовали в естественных систем визуализации (ИВИС) в сочетании с ферментом светлячков биолюминесцентного постепенно отслеживать вторжения в центральной нервной системе (ЦНС) по ENCEphalitic вируса в мышиной модели. Как правило, болезнь протекает относительно медленно, однако репликация вируса происходит быстро, особенно в ЦНС, и может привести к часто летальный исход. После интраназального заражения мышей с TC83-Luc, ослабленный венесуэльского конского энцефалита штамма вируса изменены, чтобы выражает гена люциферазы, мы находимся в состоянии представить себе репликации вируса в мозг по крайней мере за три дня до развития клинических симптомов заболевания. Используя CNS вторжением в качестве ключевой энцефалита конечной точкой развития болезни мы в состоянии быстро определить терапевтическую вакцину и защиты от TC83-Люк инфекции до появления клинических симптомов. С технологией ИВИС мы можем продемонстрировать быстрое и точное тестирование препарата терапии и вакцин при одновременном сокращении численности животных и заболеваемости.

протокол

1. Подготовка животных

1. Животное прибытия: По прибытию на уровень животного биобезопасности 2 (ABSL2) объектов, позволяют животным не менее 2 дней, чтобы привыкнуть к новой среде. После этого периода отдыха, осмотра животных, чтобы оценить их здоровья и общего физического облика.
   1. При использовании флуоресцентных журналистам важно, чтобы разместить всех животных предметов на люцерну бесплатно диету, чтобы ограничить количество GI автофлуоресценции и фонового сигнала.
2. Бритье животных: Для улучшения биолюминесцентного сигнала обнаружено от черепно области во время съемки; брить головы всех животных. Anesthetize животных смесью кислорода и испаряется изофлурана. Как только животные полностью под наркозом, использовать электрические ножницы для бритья головы. После завершения бритья, вернуть животных в их клетки и наблюдать за полное восстановление от последствий наркоза.
3. Bio Медик данныхСистемы (BMDS) транспондера вставки (состоится после бритья мышей, в то время как животные полностью под наркозом): Для менее инвазивные средства для отслеживания температуры имплантата запрограммированных BMDS беспроводной транспондер подкожно в область спины каждой мыши. Эти транспондеры позволяют беспроводной идентификации и регистрации температуры. После имплантации транспондера, применяются ветеринарно-класс ткани клеем к ране.
4. Базовая коллекция: Перед инфекции, записывать температуру и вес базовой для всех животных. Сбор крови для уменьшения налета нейтрализации (PRNT) анализ через ретроорбитального (RO) кровотечение в то время как мыши под анестезией. После сбора крови, применяют ветеринарные мазь с антибиотиком глаза, чтобы уменьшить возможные вторичные бактериальные инфекции. Данная базовая коллекция должна быть завершена с учетом в несколько раз животные находятся под наркозом из-за стресса на мышах. Будущие коллекции RO сhould быть завершена после съемки, в то время как мыши все еще находится под наркозом. Максимальная крови, собранной из RO должно быть около 200 мкл.
5. Инфекция: Место мышей под наркозом, как описано выше. Инокулировать через интраназально с применением дозы 5х10 ⁶ до 5x10 ⁷ БОЕ TC83-люциферазы в общем объеме 40 мкл разбавляют фосфатным буферным раствором (PBS) посредством интраназального заражения. После инфекции, поместите мышь в пределах их жильем клетку и наблюдать восстановление.

2. Животное изображений

Предупреждение: Держите мышь в рамках своих жилищных единиц, шкаф биологической безопасности (BSC), или XIC окна сдерживания во все времена. Утвержденный БББ для этого протокола являются Тип Класс II B1 или B2.

1. Inject всех животных с 10 мкл на грамм массы тела внутрибрюшинно (IP) люциферин в концентрации 15 мг / мл.
   1. Мышей, получавших Ampligen должны быть injecteIP D в дозе 12,5 мг / кг массы тела при -4 часа после инфицирования или +48 часа после инфицирования на основе их группы.
2. До инъекции люциферин, отделить мышей на группы по три для обеспечения правильной посадки в XIC-3 сдерживания окно.
   1. Для всех изображений, использование глазных мазей / смазкой, чтобы предотвратить высыхание роговицы в течение всей процедуры.
3. Откройте программу LivingImage и нажмите Initialize для подготовки изображений коробке; набор автоматически экономии, время экспозиции, чтобы автоматически (время экспозиции на авто это новая функция программного обеспечения LivingImage 3.2 и новее), просматривать поле C, и фильтр, чтобы открыть; поле зрения основана на количество мышей вы изображений и фильтр может быть оптимизирован, которые необходимы для других проектов визуализации.
4. Убедитесь, что воздушный фильтр уголь еще не истек, кислородный бак полон, и изофлурана резервуар заполнен. Поместите небольшие полоски изоленты в XIC-3 яsolation ящик, который помогает с сокращением движения животных во время съемки.
5. Inject мышей с IP люциферин, как описано в разделе 2.1 и место в Isoflurane камеры индукции (при открытой крышке) в течение 3-5 мин.
6. Через 5 мин, закрыть крышкой индукции камеру и начать поток изофлурана. Анестетика работает на примерно 3-5%, при этом установленный расход кислорода при приблизительно 2,0 л / мин. После полного бессознательного ждать еще 30 сек и передачу мышей XIC-3 изоляции коробки. Убедитесь, что кабинет биобезопасности используются позволяет для безопасной очистки изофлюрана так как эта процедура будет включать в себя потерю изофлуран от индукции камеры (блок ИВИС содержит свой собственный пассивный ярмарка канистры и XIC-3 сдерживания окна напрямую подключается к в / из розетки для обеспечения содержащейся анестетика потока).
   1. Передача мышей основе чипа / номер группы в XIC-3 изоляции коробки с изофлуран разъем прилагаетсяг открыть. Установите мышей, чтобы они изложены в лежачем положении грудины с руководителями осторожно опираясь на полоски ленты.
7. Протрите XIC окна сдерживания этанола, спрей руки и нижнюю часть XIC-3 с cavicide, и передать в камеру ИВИС изображения. Снова наркоз для сдерживания окно однажды внутри блока изображения.
8. Через 10 мин после инъекции люциферин, изображения мышей через живой образ программного обеспечения.
9. После первоначального изображения с открытым фильтром, инициировать DLIT 3-мерной визуализации с использованием анализа последовательностей изображений и мастер установки для люциферазы светлячка биолюминесцентного. Это изображение процесс займет 4-5 мин и должна быть завершена в поле зрения соответствующих по количеству мышей лучшего.
   1. Экс-анализ естественных условиях можно следующим вскрытия и сбор мозга. Поместите мозга на стерильную чашку Петри, капельно 50-100 мкл складе люциферин на вершине, и место в IMAненности ВИЧ варьируется окно.
10. Завершение второго открытого фильтра изображение на 15-17 мин после инфицирования после завершения визуализации DLIT. Обеспечить анализ последовательности выключен, и в поле зрения настройки фильтров и возвращается к предыдущим настройкам.

3. Вернуться мышах и анализ данных

1. Выключить изофлурана испаритель и передать XIC окна сдерживания обратно в шкаф биологической безопасности.
2. Поместите мышь обратно в свою жилищную единицу, закрыть сверху, опрыскивать внешний вид с соответствующим дезинфицирующим средством и местом обратно на корпус стойки.
   1. Убедитесь, мыши полностью выздоровели от наркоза.
3. Повторите описанную выше процедуру в качестве эксперимента требуется до визуализации завершен.
4. Лечить BSC, выключить оборудование, и передать все данные за пределами расположения лабораторию для дальнейшего анализа.
5. Анализ данных и создания 3-мерных изображений, основанные на результатах ИВИС ИМПлизинг LivingImage программного обеспечения.
   1. Убедитесь, что изображение в правильной ориентации и освещенности / цветовой баланс установлен. В палитре инструментов варианты включают настройки изображения, исправительных учреждений, изображения информации и ROI Tools.
   2. Использование ROI формы для определения конкретных уровней сигналов основан на месте.
   3. Реконструкция рельефа поверхности, чтобы выделить корпуса мыши, инициализировать 3D-реконструкция DLIT, а также использовать линейную подходят для установки органа карты топографические реконструкции.
6. Далее вирусного анализа титрования может быть завершена путем сбора крови и органов. Титрование в этом исследовании была выполнена путем гомогенизации тканей головного мозга в модифицированной орлов среде (MEM). Гомогенат серийно разводили и мы инфицированы 6 хорошо пластину Vero клеток в течение 1 часа. Клетки были покрыты 1,5% agarose/2xMEM наложения и инкубировали в течение 2 дней при температуре 37 градусов. Клетки фиксировали 10% формалином в течение 30 мин и окрашиваликристаллический фиолетовый.

Результаты

С генетически модифицированный вирус, TC83-люциферазы, мы увидели увеличение биолюминесцентного сигнала, как репликация вируса перемещается из области носа в центральной нервной системы (рис. 1). В связи с высокой вирусной скоростью репликации, мы ожидаем, что высокие уровни био...

Обсуждение

Хотя этот протокол охватывает аспекты изображений для прижизненного анализа, важно признать биолюминесцентного вектор как ключевой фактор для будущих исследований. Наши использования TC83, ослабленный штамм вакцины VEEV, в качестве вектора для экспрессии люциферазы гарантирует, чт...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
D-Luciferin
Isoflurane
Xenogen ИВИС System (Spectrum)	Суппорт Life Sciences
XGI-8-газ анестезии системе	Суппорт Life Sciences
XIC-3 Сдерживание Box	Суппорт Life Sciences
LivingImage 4,0 программного обеспечения	Суппорт Life Sciences
Телеметрия / идентификации чипов	Bio Медик Data Systems	IPTT-300	ID животных и Temperры
BD Шприц 1мл Integra TB с 26 GX 3/8 "иглы	Fisher Scientific	305279
Vet Бонд ткани клеем	Fisher Scientific	NC9259532
Vetropolycin глазная мазь	Webster ветеринарной продукции	78444656
Фосфаты Дульбекко буферный раствор 1X	Invitrogen	14190-144
BMDS Chip чтения	Bio Медик Data Systems	DAS-7007S
DAS-HOST программного обеспечения	Bio Медик Data Systems		Используется для загрузки зонд информации