In Vivo Imaging Systems Detecção (IVIS) de um vírus de Neuro-invasiva encefalítico

Resumo

Utilizando luciferase e sistemas de imagem in vivo (IVIS) como um novo meio de identificar objectivos de doença antes de desenvolvimentos clínicos ocorrer. IVIS nos permitiu visualizar em tempo real a invasão de vírus encefalíticas durante vários dias, fornecendo um modelo de doença mais precisa para o estudo futuro. Também permitiu-nos identificar as características potenciais de proteção de antivirais e de vacinas mais rápido do que os modelos animais atualmente utilizados. A capacidade de utilizar animais individuais sobre múltiplos pontos temporais garante condições de polícia reduzidos, custos e morbidade global para os animais utilizados garantir um meio mais humanas e mais científica do estudo da doença.

Resumo

Os avanços modernos em tecnologia de imagem estimular o desenvolvimento eo aperfeiçoamento da forma de pesquisa viral é realizado. Inicialmente proposto por Russel e Burch em 3Rs Hume (substituição, redução, refinamento), a utilização de modelos animais na pesquisa científica está sob constante pressão para identificar novas metodologias para reduzir o uso de animais, melhorando a precisão científica ea velocidade. Um grande desafio para diretores de Hume no entanto, é a forma de garantir os estudos são estatisticamente preciso, reduzindo a morbidade das doenças animais e números totais. Estudos de eficácia de vacinas actualmente requerem um grande número de animais, a fim de ser considerado estatisticamente significativo e muitas vezes resultam em morbidade e mortalidade terminais para a identificação de protecção imunitária. Utilizamos sistemas de imagem in vivo (IVIS) em conjunto com uma enzima bioluminescente pirilampo para controlar progressivamente a invasão do sistema nervoso central (SNC) através de uma ciaphalitic vírus em um modelo murino. Tipicamente, a doença progride de forma relativamente lenta, no entanto a replicação do vírus é rápida, especialmente dentro do sistema nervoso central, e pode levar a um resultado, muitas vezes, fatal. Após a infecção intranasal de murganhos com TC83-Luc, uma estirpe de vírus atenuado da encefalite equina venezuelana modificado para expressão de um gene da luciferase, somos capazes de visualizar a replicação do vírus no cérebro, pelo menos, três dias antes do desenvolvimento de sintomas clínicos de doença. Utilizando invasão do SNC como objectivo o desenvolvimento de doença encefálica chave que são capazes de identificar rapidamente terapêutico e proteção da vacina contra TC83-Luc infecção antes de desenvolver os sintomas clínicos. Com a tecnologia IVIS somos capazes de demonstrar o teste rápido e preciso de drogas e vacinas terapêuticas, reduzindo o número de animais e da morbilidade.

Protocolo

1. Preparação animal

1. Chegada Animal: Na chegada ao nível de biossegurança animal 2 (ABSL2) instalações, permitir que os animais de um mínimo de dois dias para se aclimatar ao seu novo ambiente. Após este período de repouso, o controlo dos animais para avaliar sua saúde e aparência física geral.
   1. Quando se utiliza repórteres fluorescentes, é importante colocar todos os sujeitos animais com uma dieta livre de alfafa para limitar a quantidade de GI autofluorescência e sinal de fundo.
2. Shave animais: Para melhorar o sinal bioluminescente detectado da região craniana durante o exame; raspar as cabeças de todos os animais. Anestesiar os animais com uma mistura de gás de oxigénio e vaporizado isoflurano. Uma vez que os animais são totalmente anestesiado, use cortadores elétricos para raspar a cabeça. Terminado o barbear, os animais regressar às suas gaiolas e observar a recuperação completa dos efeitos da anestesia.
3. Bio Medic DadosSistemas de inserção de transponder (BMDs) (a realizar na sequência de corte dos ratinhos enquanto que os animais são completamente anestesiados): Para um meio menos invasivos para controlar a temperatura de um implante pré-programado BMDs transponder sem fios via subcutânea na região dorsal de cada rato. Estes transponders permitir a identificação sem fio e gravação de temperatura. A seguir à implantação do transponder, aplicar um adesivo de tecido de grau veterinária para a ferida.
4. Coleta basal: Antes de infecção, gravar uma temperatura basal e peso para todos os animais. Coleta de sangue para análise de teste de placa de neutralização de redução (PRNT) através de retro-orbitais (RO) sangrar enquanto os ratos estão sob anestesia. Após a coleta de sangue, aplique pomada veterinária antibiótico para reduzir infecção secundária potencial bacteriana. Esta colecção de base deverá ser completado com consideração para o número de vezes que os animais são colocados sob anestesia devido ao stress em ratos. Futuras coleções ro should ser concluída após imagem, enquanto o mouse ainda está sob anestesia. O sangue coletado de um máximo de RO deve ser em torno de 200 ul.
5. Infecção: ratinhos lugar sob anestesia, como descrito anteriormente. Inocular por via intranasal com uma dose de 5x10 ⁶ a 5x10 ⁷ pfu TC83-Luciferase em um volume total de 40 ul de diluição de fosfato salino tamponado (PBS) por meio de infecção intranasal. Após a infecção, coloque os ratos dentro de sua gaiola habitação e observar a recuperação.

2. Imagens de animais

Disclaimer: Mantenha ratos dentro de sua unidade habitacional, o gabinete de segurança biológica (CSB), ou a caixa de contenção XIC em todos os momentos. Os BSCs aprovados para este protocolo são uma classe B1 ou B2 Tipo II.

1. Injectar todos os animais com 10 ul por grama de peso do corpo do intraperitoneal (IP), a luciferina, a uma concentração de 15 mg / ml.
   1. Os ratinhos que receberam Ampligen são para ser injected IP a uma dose de 12,5 mg de peso corporal / kg a infecção -4 hr pós ou 48 hr após a infecção com base no seu grupo.
2. Antes da injecção com a luciferina, separar os ratos em grupos de três para garantir um bom ajuste dentro da caixa de contenção XIC-3.
   1. Para todas as imagens, a utilizar uma pomada ocular / lubrificante para evitar a secagem da córnea durante todo o procedimento.
3. Abra o software LivingImage e pressione Inicializar para preparar a caixa de imagem; economia auto set, tempo de exposição ao automóvel (tempo de exposição em auto é um novo recurso do software LivingImage 3.2 e mais recente), ver campo para C, e filtro para abrir; campo de vista é baseada no número de murganhos que você está imagiologia e de filtro pode ser optimizada, conforme necessário para outros projectos de imagiologia.
4. Confirmar que os filtros de carvão de ar não expiraram, o tanque de oxigênio está cheio, o reservatório e isoflurano é preenchido. Coloque pequenas tiras de fita isolante no XIC-3 icaixa solation que ajuda com a redução da circulação de animais durante o exame.
5. Injectar os ratos com IP luciferina, como descrito na seção 2.1 e lugar dentro da câmara de indução isoflurano (com a tampa aberta) por 3-5 min.
6. Após 5 min, fechar a tampa da câmara de indução e iniciar o fluxo de isoflurano. O anestésico é operado a cerca de 3-5% com o conjunto de taxa de fluxo de oxigénio em cerca de 2,0 L / min. Depois de completamente inconsciente esperar um adicional de 30 seg e transferir os animais para a caixa de isolamento XIC-3. Verifique se o gabinete de biossegurança a ser utilizada permite a segura eliminação de isoflurano como esse procedimento irá envolver perda de isoflurano da câmara de indução (a unidade IVIS contém suas próprias passivos latas Fair e da caixa de contenção XIC-3 conecta diretamente à entrada / saída soquetes para garantir o fluxo contido anestésico).
   1. Transfira os ratos com base em chip / número de grupo na caixa de isolamento XIC-3 com o conector de isoflurano em anexo umd abrir. Posicione os ratos para que eles são dispostos em decúbito esternal com a cabeça suavemente descansando sobre as tiras de fita.
7. Limpe a caixa de contenção XIC com as mãos de etanol, spray e fundo da XIC-3 com cavicide, e transferir para a câmara de imagem IVIS. Reconectar a anestesia para a caixa de contenção, uma vez dentro da unidade de imagem.
8. Depois de 10 min após a injecção de luciferina, a imagem dos ratinhos através do software de imagem viva.
9. Seguindo imagem inicial com um filtro aberto, iniciar uma imagem 3-Dimensional DLIT utilizando a análise de seqüência e configuração Assistente de imagem para bioluminescente da luciferase firefly. Este processo de imagem terá 4-5 minutos e deve ser completada em um campo de visão relevante para o número de ratinhos desejados.
   1. Ex vivo-análise é possível após necropsia e coleta do cérebro. Coloque o cérebro em uma placa de Petri estéril, escorrer 50-100 ul de estoque luciferina em cima, e lugar dentro da imaging caixa.
10. Finalize uma imagem aberta de segunda filtro em 15-17 de infecção pós min após a conclusão da imagem DLIT. Assegurar a análise de sequência é desligado eo campo de visão e configurações de filtro são retornados às configurações anteriores.

3. Ratos de retorno e análise de dados

1. Desligue o vaporizador isoflurano e transferir a caixa de contenção XIC de volta para o armário de biossegurança.
2. Coloque os ratos de volta dentro de sua unidade habitacional, perto do topo, borrife o exterior com desinfetante apropriada e lugar de volta na prateleira habitação.
   1. Garantir ratos se recuperaram totalmente da anestesia.
3. Repetir o procedimento acima, como a experiência requer até imagiologia foi concluída.
4. Desinfectar o BSC, desligue o equipamento, e transferir todos os dados para um local fora do laboratório para análise posterior.
5. Analisar os dados e gerar três imagens tridimensionais baseadas em resultados IVIS UTIlisador o software LivingImage.
   1. Garantir que a imagem é devidamente orientada e iluminação / cor equilíbrio está definido. Dentro da paleta de ferramentas as opções incluem Ajuste de imagem, Correções, Informação, Imagem e Ferramentas de ROI.
   2. Utilize formas de ROI para identificar os pontos fortes de sinal específicos baseados em localização.
   3. Reconstruir a topografia da superfície para realçar o corpo do mouse, inicializar reconstrução DLIT 3D, e usar ajuste linear para definir o mapa de órgãos, para a recomposição topográfica.
6. Análise de titulação mais viral pode ser concluído através de coleta de sangue e de órgãos. Titulação neste estudo foi concluído através de homogeneização do tecido cerebral em modificado águias médio (MEM). O homogenato foi diluído em série e que infectou uma placa de 6 poços de células Vero para 1 hr. As células foram cobertas com uma camada agarose/2xMEM 1,5% e incubadas durante 2 dias a 37 graus. As células foram fixadas com formalina a 10% durante 30 minutos e coradas comvioleta de cristal.

Resultados

Com um vírus geneticamente modificado, TC83-Luciferase, vimos um aumento na intensidade do sinal bioluminescente como a replicação do vírus se move da região nasal para o SNC central (Figura 1). Devido à elevada taxa de replicação viral, esperamos ver altos níveis de sinal de bioluminescência (Figura 2A) que dependem do vector e a resposta dos animais imunes ao vector. Esperamos que este aumento de sinal para prosseguir até atingir um pico, entre 5-7 dias após a infecção, ...

Discussão

Embora este protocolo abrange os aspectos de imagem para análise in vivo, é importante reconhecer o vector bioluminescente como factor-chave para estudos futuros. Nossa utilização de TC83, uma estirpe de vacina atenuada de VEEV, como um vector para a expressão de luciferase assegura que grandes quantidades da enzima estão a ser produzidos, devido à elevada taxa de replicação do vírus no SNC como previamente descritos ^1-4. Enquanto a adição de um segundo promotor subgenómico e os...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
D-luciferina
Isoflurano
Xenogen IVIS Sistema (Spectrum)	Caliper Life Sciences
XGI-8-gás Sistema de Anestesia	Caliper Life Sciences
XIC-3 caixa de contenção	Caliper Life Sciences
LivingImage 4,0 Software	Caliper Life Sciences
Telemetria / identificação fichas	Bio Medic Data Systems	IPTT-300	Identificação animal e TemperATUREZA
BD seringa TB Integra 1ml com 26 gx 3/8 agulha "	Fisher Scientific	305279
Vet adesivo de tecido de Bond	Fisher Scientific	NC9259532
Vetropolycin Pomada oftálmica	Produtos Veterinários Webster	78444656
Fosfato de Dulbecco Buffered Saline 1X	Invitrogen	14190-144
BMDs Chip Leitor	Bio Medic Data Systems	DAS-7007S
DAS-HOST Software	Bio Medic Data Systems		Usado para fazer download de informações da sonda