Bir Nöro-İnvazif encephalitic Virüs Vivo Görüntüleme Sistemleri (IVIS) Algılama

Özet

Bir roman olarak lusiferaz ve in vivo görüntüleme sistemleri (IVIS) olarak kullanılması klinik gelişmeler ortaya çıkmadan hastalığın bitiş noktaları tespit etmek anlamına gelir. IVIS bizim gelecekteki çalışma için daha doğru bir hastalık modeli sağlayan, gerçek zamanlı olarak birden fazla gün içinde encephalitic virüs istilasına görselleştirmek için izin verdi. Bu da bize daha hızlı şu anda kullanılan hayvan modellerinde daha antiviral ve aşıların potansiyel koruyucu özellikleri tanımlamak için izin verdi. Çoklu zaman puan üzerinden bireysel hayvanların kullanmak için yeteneği azalmış hayvan gereklilikleri, masraflar ve hastalık çalışmanın daha insancıl ve bilimsel yöntemlerle sağlanması yararlanılan hayvanlar genel morbidite sağlar.

Özet

Görüntüleme teknolojisi Modern gelişmeler viral araştırmalar gerçekleştirilir şekilde daha da geliştirilmesi ve arıtma teşvik. Başlangıçta Hume'un 3R'si yılında Russel ve Burch tarafından önerilen (değiştirilmesi, azaltılması, arıtma), bilimsel araştırma hayvan modellerinin kullanımı bilimsel doğruluk ve hız artırırken hayvan kullanımını azaltmak için yeni yöntemler belirlemek için sürekli baskı altındadır. Hume'un sorumlularına büyük bir meydan okuma Ancak, hayvan hastalıklarının morbidite ve genel numaraları azaltırken çalışmalar istatistiksel olarak doğru olduğundan emin olmak için nasıl. Aşı etkinlik çalışmaları şu anda istatistiksel olarak anlamlı kabul edilebilmesi için çok büyük bir hayvan sayısı gereklidir ve sıklıkla immün koruma tanımlanması için yüksek morbidite ve mortalite uç ile sonuçlanabilir. Biz giderek bir ence ile merkezi sinir sistemi (MSS) işgali izlemek için bir ateş böceği bioluminescent enzim ile birlikte in vivo görüntüleme sistemleri (IVIS) kullanılmıştırbir fare modelinde phalitic virüs. Tipik olarak, hastalık yavaş ilerler, bununla birlikte virüs replikasyonu, özellikle merkezi sinir sistemi içinde, hızlı ve sık sık, ölümcül sonuçlara yol açabilir. TC83-Luc ile farelerin intranazal enfeksiyonu takiben, zayıflatılmış bir Venezüella ensefaliti virüsü suşu bir lusiferaz gen ifade değiştirilmiş, biz en az üç gün klinik hastalık belirtilerinin gelişiminden önce beynin içindeki virüs replikasyonu görselleştirmek edebiliyoruz. Biz klinik semptomlar ortaya çıkmadan önce hızlı TC83-Luc enfeksiyona karşı tedavi ve aşı koruması tespit edebiliyoruz bir anahtar encephalitic hastalık gelişimi nokta olarak MSS işgali kullanılması. IVIS teknolojisi ile hayvan sayıları ve morbiditeyi azaltırken uyuşturucu tedavi ve aşıların hızlı ve doğru test göstermek edebiliyoruz.

Protokol

1. Hayvan Hazırlama

1. Hayvan Varış: Hayvan biyogüvenlik seviye 2 (ABSL2) tesislerine girişte, hayvanlar da yeni ortama gelmesini 2 gün en az izin. Bu dinlenme döneminin ardından, onların sağlık ve genel fiziksel görünümünü değerlendirmek için hayvanlar inceleyin.
   1. Floresan gazetecilere kullanarak zaman GI otofloresans ve arka sinyal miktarını sınırlamak için bir yonca ücretsiz diyet tüm hayvansal konularda yerleştirmek önemlidir.
2. Hayvanlar Tıraş: görüntüleme sırasında kranial bölgeden tespit bioluminescent sinyal artırmak için; tüm hayvanların kafaları traş ediyorum. Oksijen gaz karışımı ile anestetize hayvanlar izofluran ve buharlaştırılır. Hayvanlar tamamen uyuşturulduktan olunca, başlarını traş elektrikli makasları kullanın. Bir kez tıraş ile bitmiş, kendi kafesleri hayvanların dönmek ve anestezi etkisinden tam iyileşme için gözlemlemek.
3. Bio Medic VeriSistemleri (KMY) transponder ekleme (hayvanlar tamamen uyuşturulduktan ise farelerin tıraş ardından gerçekleşmek üzere): daha az invazif yöntemlerin için önceden programlanmış BMDS kablosuz transponder her fare dorsal bölgede subkütan sıcaklığı implant izlemek için. Bunlar, transponder kablosuz kimlik ve sıcaklık kayıt için izin verir. Transponder, implantasyonu takiben yara bir veteriner dereceli doku yapıştırıcısı uygulayın.
4. Temel toplama: Enfeksiyon önce, tüm hayvanlar için bir temel sıcaklık ve ağırlık kaydedin. Fareler anestezi altında iken retro-orbital (RO) sızdırma yoluyla plak redüksiyon nötralizasyon testi (PRNT) analizi için kan toplayın. Kan toplama takiben, potansiyel sekonder bakteriyel enfeksiyon azaltmak için veteriner antibiyotikli göz merhemi uygulanır. Bu, temel toplama hayvanlar fareler üzerinde meydana gelen gerilme ile anestezi altına yerleştirilir sayısını dikkate alınarak, tamamlanması gerekmektedir. Gelecek RO koleksiyonları sfare anestezi altında iken hould, görüntüleme sonra tamamlanacak. Bir RO elde edilen maksimum kan 200 ul civarında olmalıdır.
5. Enfeksiyon: Daha önce tarif edildiği gibi anestezi altında yer fareler. Fosfat ile sulandırılmış 40 ul toplam hacim içinde-Lusiferaz TC83 5x10 ^{6 ila} 5x10 pfu ⁷ arasında bir doz kullanılarak burun içi yolu üzerinden inoküle intranazal enfeksiyon ile (PBS) Tamponlu Tuzlu. HIV bulaştıktan sonra, kendi konut kafes içinde fareler yerleştirin ve kurtarma gözlemlemek.

2. Hayvan Görüntüleme

Yasal Uyarı: Onların konut ünitesi, biyogüvenlik kabini (BSC), veya her zaman XIC çevreleme kutu içinde fare tutun. Bu protokol için onaylanmış BSC'ler Sınıf II Tip B1 veya B2 vardır.

1. 15 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda, intraperitoneal (ip), luciferase ve vücut ağırlığının gramı başına 10 ul ile tüm hayvanlar enjekte edilir.
   1. Fareler injecte Ampligen kabul edilmelidirkendi grup dayalı -4 saat sonrası enfeksiyon veya +48 saat sonrası enfeksiyona 12.5 mg / kg vücut ağırlığı dozunda d IP.
2. Önceki luciferase ile enjeksiyon, XIC-3 çevreleme kutusu içinde uygun bir uyum sağlamak için üç gruba fareler ayırın.
   1. Tüm görüntüleme için prosedür boyunca korneanın kurumasını önlemek için göz merhemi / yağlayıcı kullanmaktadır.
3. LivingImage yazılım ve basın görüntüleme kutusu hazırlamak için Initialize açın; seti otomatik kaydetme, otomatik maruz kalma süresinin (otomatik LivingImage yazılım 3.2 ve daha yeni yeni bir özellik üzerinde pozlama süresi), C alanını görüntülemek ve açmak için filtre; alanı bakış Eğer görüntüleme vardır farelerin sayısı üzerine dayanır ve diğer görüntüleme projeleri için gerekli olduğu gibi filtre optimize edilebilir.
4. Hava, kömür filtrelerde dolmamış olması onaylayın, oksijen deposu dolu ve izofluran rezervuar doldurulur. XIC-3 i elektrik bandı küçük şeritler yerleştirinHangi solation kutusunu görüntüleme sırasında hayvan hareketlerini azaltarak yardımcı olmaktadır.
5. 3-5 dakika İzofluran indüksiyon odasında (kapak açık değilken) içindeki bölüm 2.1 ve yerde açıklandığı gibi luciferase IP ile fareler enjekte.
6. 5 dakika sonra, indüksiyon odasının kapağını kapatın ve İzofluran akışı başlar. Anestezik yaklaşık 2.0 L / dk oksijen akış hızı set ile yaklaşık% 3-5 işletilmektedir. Bir kez tam olarak bilinçsiz bir ek 30 saniye bekleyin ve XIC-3 izolasyon kutusuna fare aktarın. Bu prosedür indüksiyon odasında (IVIS birim kendi Pasif Fuarı kutu ve XIC-3 çevreleme kutusuna doğrudan içinde / soketleri üzerinden bağlanır içeren gelen izofluran kaybı içerecektir olarak kullanılmaktadır biyogüvenlik kabini izofluran atma güvenli olanak sağlayın ) içerdiği anestezik akışını sağlamak için.
   1. Bir bağlı izofluran konektör ile XIC-3 izolasyon kutusu içine çip / grup sayısı dayalı fareler aktarınd açın. Onlar yavaşça bant şeritlerini üzerine oturtulmuş başkanları ile sternum yatabilme ortaya koyulur böylece fareler yerleştirin.
7. Cavicide ile etanol, sprey eller ve XIC-3 alt ile XIC muhafaza kutusundan silin ve IVIS görüntüleme odasına aktarın. Bir kez görüntüleme ünitesi içindeki çevreleme kutusuna anestezi bağlayın.
8. Sonra luciferase ve enjeksiyonu takiben 10 dk, canlı görüntü yazılımı ile görüntü fareler.
9. Açık bir filtre ile ilk görüntüleme takiben, Dizi analizi ve bioluminescent ateşböceği lusiferaz için Resim Sihirbazı kurulumu kullanarak bir DLIT 3-Boyutlu görüntüleme başlatmak. Bu görüntüleme işlemi 4-5 dk sürer ve istenen farelerin sayısı için ilgili bir görüş alanı az tamamlanması gerekmektedir.
   1. Ex-vivo analiz beyin nekropsi sonra mümkündür ve koleksiyonudur. Steril bir Petri kabı beyin yerleştirin, ima içinde 50-100 üstüne stok luciferase ul ve yerine damlakutusu ging.
10. DLIT görüntüleme tamamlandıktan sonra 15-17 dk sonrası enfeksiyon ikinci bir açık filtre görüntüyü Finalize. Dizi analizi kapalı olduğundan emin olun ve görünümü ve filtre ayarları alanında önceki ayarlarına geri döner.

3. Dönüş Fareler ve Veri Analizi

1. Izofluran buharlaştırıcı kapatın ve biyogüvenlik kabini geri XIC çevreleme kutusu aktarın.
2. Kendi konut ünitesi içinde geri fareler yerleştirin, geri gövde rafına uygun dezenfekte edici ve yer ile dış sprey, üst kısmını kapatın.
   1. Olun fareler tamamen anestezi kurtarıldı.
3. Görüntüleme tamamlanıncaya kadar deneme gerektirir yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
4. , BSC dezenfekte ekipmanı kapatın ve daha fazla analiz için bir dış laboratuar konuma tüm veri aktarmak.
5. Veri Analizi ve IVIS sonuçları uti dayalı 3 boyutlu görüntüler oluşturmakLivingImage yazılımı lizing.
   1. Görüntü düzgün odaklı ve ışıklandırma / renk dengesi ayarlanmış olduğundan emin olun. Aracı Palet içinde seçenekleri Görüntü, ayarlayın Düzeltmeler, Görüntü Bilgi ve YG Araçları içerir.
   2. Konuma dayalı spesifik sinyal gücünü belirlemek için ROI şekiller yararlanın.
   3. , Fare vücut vurgulamak için yüzey topografyası Yeniden İnşa 3D DLIT yeniden başlatmak ve topografik rekonstrüksiyonuna organı haritayı ayarlamak için lineer uygun kullanın.
6. Ayrıca viral titrasyon ölçümü, kan ve organlarının toplanması yoluyla tamamlanabilir. Bu çalışmada Titrasyon modifiye kartal orta (MEM) beyin dokusunun homojenizasyon ile tamamlanmıştır. Homojenat, seri olarak seyreltildi ve 1 saat boyunca Vero hücreleri 6 plaka enfekte edildi. Hücreler,% 1.5 agarose/2xMEM kaplaması ile kaplanmış ve 37 derece az 2 gün için inkübe edilmiştir. Hücreler 30 dakika için% 10 formalin ile sabitlenmiş ve lekelikristal viyole.

Sonuçlar

Virüs çoğaltma merkezi sinir sistemi (Şekil 1) içine nazal bölgesinden hareket ederken bir genetiği değiştirilmiş virüs ile, TC83-Lusiferaz, biz bioluminescent sinyal gücü bir artış gördüm. Yüksek viral replikasyon hızı nedeniyle, vektör ve vektör hayvan bağışıklık yanıtı bağlı bioluminescent sinyal düzeyi yüksek (Şekil 2A) görmek için bekliyoruz. Biz CNS içindeki viral replikasyon pik (Şekil 2B) ile birlikte, günde 5-7 sonrası en...

Tartışmalar

Bu protokol vivo analizi için görüntüleme yönlerini kapsar iken, gelecekteki çalışmalar için önemli bir faktör olarak bioluminescent vektör tanımak önemlidir. Lusiferaz ifadesi için bir vektör olarak TC83 oluşan kullanımı, VEEV zayıflatılmış bir aşı suşu, enzim büyük miktarlarda ^1-4 daha önce tarif edildiği gibi merkezi sinir sistemi içinde, virüsün yüksek çoğaltma oranına bağlı üretilmektedir sağlar. Rekombinant virüsün daha fazla zayıflatılması, ikinci ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
D-lusiferin
İzofluran
Xenogen IVIS Sistemi (Spektrum)	Kaliper Yaşam Bilimleri
XGI-8-gaz Anestezi Sistemi	Kaliper Yaşam Bilimleri
XIC-3 Sınırlama Kutusu	Kaliper Yaşam Bilimleri
LivingImage 4.0 Yazılım	Kaliper Yaşam Bilimleri
Telemetri / tanımlama çipleri	Bio Medic Data Systems	IPTT-300	Hayvan kimlik ve Temperdüs ük
26 gx 3/8 "iğne ile BD Integra 1ml TB şırınga	Fisher Scientific	305279
Vet Bond doku yapıştırıcısı	Fisher Scientific	NC9259532
Vetropolycin Oftalmik merhem	Webster Veteriner Ürünleri	78444656
Dulbecco Fosfat Salin 1X Buffered	Invitrogen	14190-144
BMDS Chip Okuyucu	Bio Medic Data Systems	DAS-7007S
DAS-HOST Yazılım	Bio Medic Data Systems		Prob bilgileri indirmek için kullanılır