LeafJ：ImageJ的插件半自动叶形状测量

摘要

示范的高吞吐量叶测量的关键方法。这些方法可以用来加速学习时，许多植物叶表型的突变体或以其他方式筛选植物叶表型。

摘要

高通量分型（组学）是一个功能强大的工具，用于连接的基因，其功能（见综述^1，最近的例子^2-4）。叶片是主要的光合器官，并且它们的大小和形状各不相同发育和工厂内的环境。出于这些原因，叶片形态研究需要从众多的叶片，这最好是通过半自动化组学工具^5,6的多个参数的测量。遮荫环境是一个重要的线索，影响植物的建筑和生活的历史套件的反应统称为避荫综合症^{（SAS）7。}在SAS响应，遮阳诱导叶柄伸长和叶片面积的变化作为指标⁸是特别有用的。至目前为止，叶形方案（ 如形状层^{10，LeafAnalyzer 11，LEAFPROCESSOR 12）}可以测量叶片轮廓和分类 ​​，叶形，但不能输出叶柄长度。叶柄缺乏大型测量系统的抑制SAS组学的方法来研究。在本文中，我们将介绍一种新开发的ImageJ的插件，称为LeafJ，它可以快速测量模式植物拟南芥叶柄长，叶片参数。偶尔叶的叶柄/叶片边界，需要手动校正我们使用的是触摸屏平板。此外，叶片细胞的形状和，叶细胞数量是重要的决定因素，叶片大小^13。从LeafJ分离，我们也提出为测量细胞的形状，面积和尺寸的触摸屏平板电脑使用的协议。我们的叶性状测量系统不限于阴凉处，避免研究，并会加速叶片的许多突变体的表型筛选植物叶表型。

研究方案

1。植物材料

请注意，该的植物生长协议的目的是为避荫反应检测。你最喜欢的条件下可以生长的植物。

1. 洒在9厘米培养皿和存储（分层）在4°C的水浸泡滤纸四天在黑暗中的拟南芥种子。
2. 将这些培养皿中传输模拟太阳光条件：80〜100μE光合有效辐射（PAR）和远红光的补充带来的R：FR比为1.86。漫长的一天（16小时光照/ 8小时黑暗）和恒定的温度为22°C。在此条件下培养三天，让种子发芽。
3. 发芽的种子，土壤和阳光条件下保持植物。对于大规模的实验，我们建议您准备的小标签来标记每个工厂使用数据合并管理器在Microsoft Word 2004（或更高版本）制作的标签。
4. 11天后TRansfer土壤，将有一半的植物遮荫条件：同样的阳光下，但补充远红光带来的R / FR比0.52。
5. 一个额外的12天之后，植物叶成像。在这个阶段，老叶已经完全成熟，而年轻的叶子还在不断扩大，让你捕获快照的发展。您可能需要根据您的需要选择不同的发育时间。

2。叶片图像捕捉解剖

1. 准备与植物的基因型和生长状况与5个矩形框标记的投影胶片。一帧对应于从一种植物的叶子。 Microsoft Excel可以用来打印标签一致的网格。
2. 解剖叶，26天老厂。
3. 扫描分辨率为600 dpi离开床一台扫描仪。需要注意的是从一种植物叶应垂直放置在透明的薄片三明治，一个黑色的窗口内。避免接触的叶子一个黑色的窗口框架和重叠的树叶，这将给下列程序中的错误。

3。叶图像分析LeafJ

1. 下载ImageJ的拖动LeafJ.jar文件到plugins文件夹中ImageJ的。
2. 打开ImageJ的1.45s或更高版本¹⁴中的图像文件。
3. 图像分割成三个颜色通道（红色，绿色和蓝色）的“图像”>“颜色”>“拆分通道”和应用在蓝色通道的图像的阈值。
4. 选择所有的叶子从一个工厂的矩形工具（ 图1A）。
5. 选择的插件菜单的“LeafJ”。
6. 从出现的对话框中选择“注释信息，为这家工厂。您可以出现在这里点击“编辑选项为：”编辑默认值。
7. 运行后LeafJ插件，然后单击“OK”按钮，编辑跟踪线，从该地区的利益（投资回报率）管理器“窗口（如果有必要， 图1B）。在此过程中是很有用的触摸屏平板电脑（如iPad的）。 ipad公司可以连接到一台计算机，外部显示器，使用空气显示软件。
8. 导出测量结果和相关信息（文件名，开花时间，解剖，测量等）到Microsoft Excel或相同的软件。

4。 ImageJ的叶细胞图像分析

1. 修复解剖离开扫描（步骤2）后，如参考文献¹⁵中描述的。至少6个月，FAA固定叶片可以保存在4°C。
2. FAA固定液，通过改变水合氯醛溶液，并培育叶1〜2显微镜观察¹⁵小时前，清除落叶。
3. 山叶英里croscope滑动皮毛朝上。使用复合式显微镜，图像叶肉层的每一片叶子的中心主脉两侧的40倍的放大倍率，避免皮毛或静脉附近的细胞。
4. 微量叶细胞概述ImageJ的投资回报率管理工具，借助触摸屏的平板电脑和手写笔（如在步骤3）。细胞图像分析使用ImageJ的内置功能，但不需要LeafJ。

结果

1。叶片图像显示的叶柄和叶片边界的估计，其测量窗口

的LeafJ最有用的功能之一是自动检测的叶片/叶柄边界的（ 图1）。 LeafJ算法的工作原理如下：内置ImageJ的ParticleAnalyzer功能中被用来寻找并确定内的用户选择的叶子的取向。对于每片叶子的叶的宽度确定沿叶片的整个轴。使用运行的窗口（为7近端到焦点位置的位置的平均宽度的平均宽度为7到焦点位置的远侧位置...

讨论

我们的“LeafJ”的插件，使测量叶柄长半，自动比手动测量吞吐量提高了近6倍。叶柄长是SAS的一个重要指标，也是一个具有里程碑意义的现象，如淹没性与偏下的增长^17。因此，这个插件可能是有用的范围广泛的植物研究。

我们的插件来实现在一个完善的基于Java的免费软件，ImageJ的。这使得可以轻松跨平台的安装。易于修改程序也是一个优势的LeafJ插件的ImageJ的，因?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号
远红光LED	Orbitec	客户定制
透明度	IKON	HSCA / 5
扫描器	爱普生	爱普生Perfection V700 PHOTO
图像J	美国国立卫生研究院		http://rsbweb.nih.gov/ij/
LeafJ	习惯		http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab
空气显示	Avatron软件公司		空白的“http://avatron.com/
iPad2的	苹果公司		http://www.apple.com/