LeafJ: Ein ImageJ Plugin für Semi-automatisierte Blattform Measurement

Zusammenfassung

Demonstration der wichtigsten Methoden für hohen Durchsatz Blatt Messungen. Diese Methoden können verwendet werden, um Blatt Phänotypisierung zu beschleunigen, wenn das Studium vieler Pflanzen-Mutanten oder anderweitig Siebanlagen für Blatt Phänotyp werden.

Zusammenfassung

Hoher Durchsatz Phänotypisierung (phenomics) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Verknüpfung von Genen, ihre Funktionen (siehe Beitrag ¹ und jüngsten Beispiele ^2-4). Blätter sind die primären photosynthetischen Organ, und ihre Größe und Form variieren entwicklungspolitisch und ökologisch innerhalb einer Anlage. Aus diesen Gründen Studien über Blattmorphologie erfordern Messung mehrerer Parameter aus zahlreichen Blättern, die am besten durch halbautomatische phenomics Werkzeuge ^5,6 durchgeführt wird. Canopy Schatten ist ein wichtiger Umweltfaktor Cue das Pflanzenwachstum Architektur und das Leben der Geschichte betrifft, die Suite der Antworten wird zusammenfassend als Vermeidung von Schatten zählen Syndrom (SAS) ^7. Unter SAS Reaktionen sind Schatten induzierten Blatt Blattstiel Dehnung und Veränderungen im Blade-Bereich besonders nützlich als Indizes ^8. Bis heute kann Blattform Programme (zB SHAPE ^9, LAMINA ^10, LeafAnalyzer ^11, LEAFPROCESSOR ¹²⁾ zu messen Blatt Konturen und kategorisieren Blattformen, Kann jedoch nicht auszugeben Blattstiel Länge. Mangel an großen Messsysteme Blattstielen gehemmt hat phenomics Ansätze zur SAS Forschung. In diesem Papier beschreiben wir eine neu entwickelte ImageJ Plugin namens LeafJ, die schnell messen können Blattstiel Länge und Blattspreite Parameter der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Für das gelegentliche Blatt, das erforderliche manuelle Korrektur der Blattstiel / Blattspreite Grenze wir eine Touchscreen-Tablet verwendet. Ferner sind Blattzelle Form und Blatt Zellzahlen wichtige Determinanten der Blattgröße ^13. Getrennt von LeafJ präsentieren wir auch ein Protokoll für die Verwendung eines Touchscreen-Tablet für Messzelle Form, Fläche und Größe. Unser Blatt trait Messsystem ist nicht auf Schatten-Vermeidungs-Forschung beschränkt und wird leaf Phänotypisierung von vielen Mutanten und Siebanlagen für Blatt Phänotypisierung beschleunigen.

Protokoll

Ein. Pflanzenmaterialien

Beachten Sie, dass diese Pflanze das Wachstum Protokoll zum Nachweis Vermeidung von Schatten zählen Antwort gerichtet ist. Sie können Pflanzen unter Ihrem Lieblings Zustand wachsen.

1. Sprinkle Arabidopsis thaliana Samen auf Wasser eingeweicht Filterpapiere in 9 cm Petrischalen und möglich (Stratifizierung) sie bei 4 ° C für vier Tage in der Dunkelheit.
2. Übertragen Sie diese Petrischalen auf simulierte Sonnenbedingungen: FR-Verhältnis auf 1,86: 80-100 uE photosynthetisch aktive Strahlung (PAR) und weit-rote Ergänzung zu den R bringen. Verwenden Langtagsbedingungen (16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit) und konstanter Temperatur von 22 ° C. Inkubieren in diesem Zustand für drei Tage, damit die Samen zu keimen.
3. Übertragen gekeimten Samen in den Boden und die Pflanzen unter der Sonne Zustand. Für Großversuche, empfehlen wir Herstellung kleiner Tags zur Kennzeichnung jedes Pflanzen mit Seriendruck-Manager in Microsoft Word 2004 (oder höher) für die Herstellung von Etiketten.
4. Elf Tage nach transfer den Boden, bewegen die Hälfte der Pflanzen, die Schatten Zustand: wie Sonne, aber mit zusätzlichem weit rotes Licht, um den R / FR-Verhältnis auf 0,52 zu bringen.
5. Nach weiteren 12 Tage, sind die Pflanzen bereit für Blatt Bildgebung. In diesem Stadium die älteren Blätter sind voll ausgereift während jüngere Blätter noch erweitern, so dass Sie eine Momentaufnahme der Entwicklung zu erfassen. Vielleicht möchten Sie eine andere Entwicklungszeit je nach Ihren Bedürfnissen zu wählen.

2. Capturing Dissected Blatt Images

1. Bereiten Sie Transparentfolien mit pflanzlichen Genotyp und Wachstumsbedingungen mit fünf rechteckigen Rahmen gekennzeichnet. Ein Frame entspricht Blätter von einer Pflanze. Microsoft Excel kann verwendet werden, um eine konsistente Gitter mit Etiketten gedruckt werden.
2. Dissect Blätter 26 Tage alten Pflanzen.
3. Scan lässt bei 600 dpi auf einem Flachbett-Scanner. Beachten Sie, dass von einem Werk verlässt sollten vertikal in einem schwarzen Fenster platziert werden in einem Sandwich von transparenten Folien. Berühren Blätterzu einem schwarzen Fensterrahmen und überlappenden Blättern, die Fehler in folgenden Verfahren geben wird.

3. Blatt Image Analysis by LeafJ

1. Herunterladen ImageJ Ziehen Sie den LeafJ.jar Datei in den Plugin-Ordner von ImageJ.
2. Öffnen Sie eine Bilddatei in ImageJ 1.45s oder später ^14.
3. Split das Bild in drei Farbkanäle (rot, grün und blau) von "Bild> Farbe> Split Channels" und gelten Schwelle zum Bild im blauen Kanal.
4. Wählen Sie alle Blätter von einer Pflanze durch ein Rechteck-Werkzeug (Abb. 1A).
5. Wählen Sie "LeafJ" aus dem Plugin-Menü.
6. Wählen Anmerkungsinformationen für diese Anlage aus dem Dialogfeld, das erscheint. Sie könnenbearbeiten Sie die Standardwerte, die hier erscheinen, indem Sie auf "Bearbeiten Sie diese Optionen".
7. Nach dem Ausführen LeafJ Plugin und bevor Sie auf "OK"-Taste, bearbeiten zurückverfolgt Zeilen aus der Region of Interest (ROI)-Fenster (falls erforderlich; Abbildung 1B). Ein Touchscreen-Tablet (z. B. ein iPad) ist nützlich für dieses Verfahren. iPads können an einen Computer wie einen externen Monitor mit Air Display Software angeschlossen werden.
8. Exportieren von Messergebnissen und damit verbundenen Informationen (Dateinamen, Blütezeit, zerschnitten von, gemessen, etc) in Microsoft Excel oder gleichwertige Software.

4. Blattzelle Image Analysis in ImageJ

1. Fix seziert lässt, wie in Bezug ¹⁵ nach dem Scannen (Schritt 2) beschrieben. FAA festen Blätter können in 4 ° C für mindestens 6 Monate aufbewahrt werden.
2. Deaktivieren Sie die Blätter, indem FAA Fixativ Chloralhydratlösung und inkubieren Blätter für 1 bis 2 Stunden vor der mikroskopischen Beobachtung ^15.
3. Berg verlässt auf mimikroskop gleitet mit Trichomen nach oben. Mit 40-facher Vergrößerung auf einem zusammengesetzten Mikroskop, Bild Mesophyll Schicht der Mitte jedes Blatt auf beiden Seiten der Hauptader, die Vermeidung Zellen in der Nähe Trichomen oder Venen.
4. Trace Blattzelle umreißt von ImageJ ROI-Manager-Tool mit Hilfe des Touchscreen-Tablet und einem Stift (wie in Schritt 3 beschrieben). Zelle Bildanalyse nutzt die integrierten Funktionen der ImageJ aber nicht erforderlich LeafJ.

Ergebnisse

Ein. Blatt Images Zeige Schätzungen der Blattstiel und Blattspreite Boundary, und ihre Messfenster

Eines der nützlichsten Funktionen von LeafJ ist automatische Erkennung von Blattspreite / Blattstiel Grenze (Abbildung 1). Die LeafJ Algorithmus arbeitet wie folgt: die integrierte ImageJ ParticleAnalyzer Funktionalität wird verwendet, um herauszufinden und bestimmen die Orientierung der Blätter Innenseite der Benutzerauswahl. Für jedes Blatt die Breite des Blattes ist entlan...

Diskussion

Unser "LeafJ" plugin ermöglicht die Messung von Blattstiel Länge halbautomatisch, Erhöhung des Durchsatzes fast 6 Mal über manuelle Messung. Blattstiel Länge ist ein wichtiger Index für SAS und ist auch ein Wahrzeichen von anderen Phänomenen wie Überflutung Widerstand und hyponastic Wachstum ^17. Deshalb dieses Plugin kann nützlich sein, um eine breite Palette von pflanzlichen Forscher.

Unser Plugin ist in einem gut etablierten java-basierte freie Software ImageJ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
weit Rotlicht LED	Orbitec	Maßarbeit
Transparenz	IKON	HSCA / 5
Scanner	Epson	Epson Perfection V700 PHOTO
Image J	NIH		http://rsbweb.nih.gov/ij/
LeafJ	Brauch		http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab
Air Display	Avatron Software Inc.		blank "> http://avatron.com/
iPad2	Apple Inc.		http://www.apple.com/