LeafJ: תוסף ImageJ למדידת צורת עלה חצי אוטומטית

Summary

הדגמה של שיטות עיקריות למדידה עלתה תפוקה גבוהה. שיטות אלה יכולים לשמש כדי להאיץ phenotyping עלה כאשר לומדים הרבה מוטנטים צמחיים או אחר על ידי צמחי הקרנה פנוטיפ עלה.

Abstract

phenotyping תפוקה הגבוהה (Phenomics) הוא כלי רב עצמה לקישור גנים לתפקידם (ראה ¹ ביקורת והדוגמות אחרונות ^2-4). עלים הם איבר הפוטוסינתזה הראשוני, והגודל וצורתם משתנים התפתחותית והסביבה בתוך מפעל. מסיבות אלה מחקרים על מורפולוגיה עלה דורשים מדידה של מספר פרמטרים מעלים רבים, שנעשה על ידי מיטב כלים אוטומטיים למחצה Phenomics ^5,6. צל חופה הוא רמז סביבתי חשוב שמשפיע על אדריכלות מפעל ותולדות חיים; החבילה של תגובות נקראת באופן קולקטיבי תסמונת הימנעות הצל (SAS) ^7. בין תגובות SAS, התארכות צל מושרה עלה פטוטרת ושינויים באזור הלהב הם שימושיים במיוחד כמדדי ^8. נכון להיום, תוכניות צורת עלים (למשל SHAPE ^9, Lamina ^{10, 11} LeafAnalyzer, LEAFPROCESSOR ¹²⁾ יכולות למדוד את קווי מתאר עלים ולמיין צורות עלים, אבל לא יכול פלט אורך פטוטרת. חוסר מערכות מדידה בקנה מידה הגדולה של פטוטרות עלה יש עכבות גישות Phenomics לSAS מחקר. במאמר זה, אנו מתארים תוסף חדש שפותח ImageJ, נקרא LeafJ, שמהירות יכול למדוד אורך פטוטרת ופרמטרי להב עלה של צמח המודל ארבידופסיס thaliana. לעלה מזדמן שתיקון ידני הנדרש של גבול להב הפטוטרת / עלה הייתי לוח עם מסך מגע. יתר על כן, צורת תא עלה ומספרים סלולריים עלים הם גורמים חשובים בגודל העלה ^13. נפרד מLeafJ אנחנו גם מציגים פרוטוקול לשימוש במחשב לוח עם מסך מגע למדידת צורת תא, שטח וגודל. מערכת מדידת תכונת עלנו אינה מוגבלת למחקר צל, הימנעות ותאיץ phenotyping עלה של מוטציות רבות וצמחים על ידי הקרנת phenotyping עלה.

Protocol

1. חומרים צמחיים

שים לב שפרוטוקול גידול צמחים שזה מכוון לאיתור תגובת הימנעות צל. ניתן לגדל צמחים בתנאים המועדפים עליך.

1. מפזרי זרעי thaliana ארבידופסיס על מים ספוגים ניירות סינון ב 9 מנות סנטימטר הפטר וחנויות (רבד) ב 4 ° C במשך ארבעה ימים בחושך.
2. להעביר צלחות פטרי אלה לתנאי יום ראשון מדומים: μE קרינת 80-100 photosynthetically פעילה (PAR) ותוספת מרחיקה אדומה להביא R: יחס FR ל1.86. השתמש בתנאי יום ארוכים (16 שעות אור / שעה אפלה 8) וטמפרטורה קבועה של 22 ° C. דגירה במצב זה במשך שלושה ימים על מנת לאפשר לזרעים לנבוט.
3. העברת הזרעים מונבטים לאדמה ולשמור על צמחים בתנאי יום ראשון לניסויים בקנה מידה גדול, אנו ממליצים להכין תגים קטנים לתיוג כל צמחים באמצעות מיזוג נתוני מנהל ב-Microsoft Word 2004 (או מאוחר יותר) להדפסת תוויות.
4. עשרה ימים לאחר transfer לאדמה, להעביר מחצית מהצמחים לתנאי צל: כמו שמש אבל עם אור משלים מרחיקה אדומה כדי להביא את יחס R / FR ל0.52.
5. לאחר 12 ימים נוספים, הצמחים מוכנים להדמית עלה. בשלב זה את העלים המבוגרים הבשילו באופן מלא ואילו עלים צעירים עדיין מתרחבים, כך שאתה ללכוד תמונת מצב של פיתוח. ייתכן שתרצה לבחור זמן התפתחותי שונה בהתאם לצרכימים שלך.

2. לכידת תמונות עלים גזורים

1. הכן גיליונות שקפים שכותרתו עם גנוטיפ צמח ומצב צמיחה עם חמש מסגרות מלבניות. מסגרת אחת מתאימה לעלים מצמח אחד. Microsoft Excel יכול לשמש להדפסת רשת בקנה אחד עם תוויות.
2. לנתח עלים של צמחים ישנים 26 יום.
3. הסריקה יוצאת ב600 dpi בסורק שטוח מיטה. שים לב שיוצא ממפעל אחד צריך להיות ממוקם אנכי בתוך חלון שחור בכריך של יריעות שקופות. הימנע מעלים נוגעיםלמסגרת שחורה חלון ועלים חופפים, אשר תיתנה לי טעויות בהליכים הבאים.

3. ניתוח תמונת עלה ידי LeafJ

1. ההורדה ImageJ גרור את קובץ LeafJ.jar לתוך תיקיית plugins של ImageJ.
2. פתח קובץ תמונה בImageJ 1.45s או במאוחר ^14.
3. לפצל את התמונה לאפיקים השלושה צבעים (אדום, ירוק וכחול) על ידי "תמונת צבע>> ערוצי Split" ולהחיל סף לתמונה בערוץ הכחול.
4. בחר את כל העלים מצמח אחד על ידי כלי מלבן (איור 1 א).
5. בחר "LeafJ" מתפריט התוסף.
6. בחר מידע ליאור הצמח הזה מתיבת הדו השיח שמופיעה. אתה יכוללערוך את ערכי ברירת המחדל שמופיעים כאן על ידי לחיצה על "ערוך אפשרויות אלה".
7. לאחר הפעלת תוסף LeafJ ולפני הלחיצה על כפתור "אישור", לערוך לייחס קווים מאזור חלון עניין (ROI) מנהל (במידת צורך; 1B איור). לוח עם מסך מגע (כמו האייפד) שימושי להליך זה. אייפדים יכולים להיות מחוברים למחשב כצג חיצוני באמצעות תוכנת תצוגת אוויר.
8. יצוא תוצאות מדידה ומידע משויך (שמות קבצים, זמן פריחה, משופע ב, שנמדד על ידי, וכו ') ל-Microsoft Excel או תוכנה מקבילה.

4. ניתוח תמונת תא עלה בImageJ

1. התקן גזור משאיר כמתואר ^ב15 התייחסות לאחר הסריקה (שלב 2). עלים קבועים FAA יכולים להיות כל זמן ב4 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים לפחות.
2. נקה את העלים על ידי שינוי מקבע-FAA לפתרון כלורל ועלי אינקובטורים ל1 ~ 2 שעות לפני התצפית מיקרוסקופית ^15.
3. ההר משאיר במיילcroscope מחליק עם trichomes פונה כלפי מעלה. באמצעות הגדלת 40X במתחם מיקרוסקופ, תמונת שכבת mesophyll של מרכז כל עלה משני צדדיו של הווריד הראשי, הימנעות מתאים הסמוכים trichomes או ורידים.
4. תא עלה עקבות מתאר ידי כלי מנהל ROI ImageJ עם סיוע של לוח עם מסך מגע וסטיילוס (כמתואר בשלב 3). ניתוח תמונת תא משתמש בתכונות המוכללות של ImageJ אך אינו מחייב LeafJ.

תוצאות

1. תמונות עלים מציגים אומדני הפטוטרת וגבול להב עלה, ועל חלון המדידה שלהם

אחת התכונות השימושיות ביותר של LeafJ הוא זיהוי אוטומטי של גבול להב / פטוטרת עלה (איור 1). אלגוריתם LeafJ עובד כדלקמן: הפונקציונליות המובנית ParticleAnalyzer ImageJ משמ?...

Discussion

התוסף שלנו "LeafJ" מאפשר מדידת אורך פטוטרת חצי אוטומטית, הגדלת תפוקה כמעט 6 פעמים במדידה ידנית. אורך פטוטרת הוא מדד חשוב של SAS וגם לציון דרך של תופעות אחרות, כגון התנגדות שקיעה וצמיחת hyponastic ^17. לכן תוסף זה יכול להיות שימושי למגוון רחב של חוקרי צמחים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים
אור מרחיק נורית אדומה	Orbitec	המנהג עשה
שקיפות	אייקון	HSCA / 5
סורק	Epson	Epson Perfection V700 PHOTO
התמונה J	NIH		http://rsbweb.nih.gov/ij/
LeafJ	מנהג		http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab
אוויר תצוגה	Avatron תוכנה בע"מ		ריק "> http://avatron.com/
iPad2	אפל		http://www.apple.com/