LeafJ: Un Plugin ImageJ pour semi-automatique de mesure Forme Feuille

Résumé

Démonstration de méthodes de mesures clés pour la haute feuille de débit. Ces méthodes peuvent être utilisées pour accélérer le phénotypage feuille lors de l'étude des mutants de nombreux végétaux ou installations de criblage autrement par le phénotype feuilles.

Résumé

Phénotypage à haut débit (phénomique) est un outil puissant pour les liens entre les gènes de leurs fonctions (voir avis ¹ et des exemples récents ^2-4). Les feuilles sont l'organe photosynthétique primaire, leur taille et leur forme varient du développement et de l'environnement dans une usine. Pour ces raisons, les études sur la morphologie des feuilles nécessitent une mesure de plusieurs paramètres de nombreuses feuilles, qui est le mieux fait par des outils semi-automatiques Phenomics ^5,6. Ombre Canopy est un indice important de l'environnement qui affecte l'architecture des plantes et de l'histoire de vie, la suite des réponses est collectivement appelé le syndrome d'évitement ombre (SAS) ^7. Parmi les réponses SAS, ombre feuilles induit un allongement du pétiole et les changements de zone de la lame sont particulièrement utiles comme les indices ^8. À ce jour, les programmes de la forme des feuilles (par exemple, forme ^9, LAMINA ^10, LeafAnalyzer ^11, LEAFPROCESSOR ¹²⁾ permet de mesurer les contours de feuilles et de catégoriser les formes de feuilles, Mais ne peut pas émettre la longueur du pétiole. Le manque de systèmes de mesure à grande échelle des pétioles des feuilles a inhibé les approches Phenomics à SAS de recherche. Dans cet article, nous décrivons un plugin ImageJ nouvellement développé, appelé LeafJ, qui peut rapidement mesurer la longueur du pétiole et limbe des paramètres de la plante modèle Arabidopsis thaliana. Pour la feuille de temps en temps que la correction manuelle requise de la frontière lame pétiole / feuille, nous avons utilisé une tablette à écran tactile. De plus, la forme des cellules des feuilles et le nombre de cellules des feuilles sont des déterminants importants de ¹³ la taille des feuilles. Séparer LeafJ nous présentons également un protocole d'utilisation d'une tablette à écran tactile pour mesurer la forme des cellules, la superficie et la taille. Notre système de mesure feuille de trait ne se limite pas à l'ombre d'évitement de recherche et permettra d'accélérer le phénotypage feuille de mutants et de plantes de dépistage par phénotypage feuille.

Protocole

1. Matières végétales

Notez que ce protocole a pour objectif la croissance des plantes pour détecter la réaction d'évitement ombre. Vous pouvez faire pousser des plantes dans votre état préféré.

1. Saupoudrer de graines d'Arabidopsis thaliana sur l'eau trempés papiers filtres dans 9 des plats de Pétri et magasins cm (stratification) les à 4 ° C pendant quatre jours dans l'obscurité.
2. Transférer ces boîtes de Pétri à conditions d'ensoleillement simulées: 80-100 rayonnement pE photosynthétiquement actif (RPA) et rouge lointain supplément pour amener le R: FR rapport à 1,86. Utiliser conditions de jours longs (16 h de lumière / 8 h obscurité) et la température constante de 22 ° C. Incuber dans cet état pendant trois jours pour permettre aux graines de germer.
3. Transfert de graines germées au sol et garder les plantes dans des conditions dim. Pour les grandes expériences, nous vous recommandons de préparer de petites étiquettes pour l'étiquetage chacune des plantes à l'aide de Gestionnaire de fusion de données dans Microsoft Word 2004 (ou version ultérieure) pour créer des étiquettes.
4. Onze jours après transfer sur le sol, placez la moitié des plantes à l'état de l'ombre: même soleil, mais avec droit de reprise rouge lointain lumière pour ramener le ratio R / FR à 0,52.
5. Après une période de douze jours, les plantes sont prêtes pour l'imagerie feuille. A ce stade, les feuilles les plus âgées ont pleine maturité alors que les jeunes feuilles sont toujours en expansion, de sorte que vous capturer un instantané de développement. Vous pouvez choisir un temps de développement différent en fonction de vos besoins.

2. Capture d'images feuilles disséquées

1. Préparer les feuilles de transparence étiquetés avec génotype de la plante et des conditions de croissance avec cinq cadres rectangulaires. Un cadre correspond à feuilles d'une plante. Microsoft Excel peut être utilisée pour imprimer une grille conforme aux étiquettes.
2. Disséquer feuilles de 26 jours vieilles usines.
3. Balayage part à 600 dpi sur un scanner à plat. Notez que laisse d'une plante doit être placée verticalement dans une fenêtre noire dans un sandwich de feuilles transparentes. Évitez de toucher les feuillespour un cadre de fenêtre noire et feuilles qui se chevauchent, ce qui donnera une erreur, les procédures suivantes.

3. Feuille d'analyse d'images par LeafJ

1. Télécharger ImageJ Faites glisser le fichier LeafJ.jar dans le dossier plugins d'ImageJ.
2. Ouvrir un fichier image en 1.45s ImageJ ou tard, ^14.
3. Diviser l'image en trois couleurs canaux (rouge, vert et bleu) par "Image> Couleur Canaux> Split" et appliquer seuil à l'image dans le canal bleu.
4. Sélectionner toutes les feuilles d'une plante par un outil rectangle (figure 1A).
5. Sélectionnez "LeafJ" dans le menu plugin.
6. Sélectionnez informations d'annotation pour cette plante à partir de la boîte de dialogue qui apparaît. Vous pouvezmodifier les valeurs par défaut qui apparaissent ici en cliquant sur "modifier ces options".
7. Après l'exécution de plug-in LeafJ et avant de cliquer sur "OK", modifier les lignes tracées de la région de fenêtre du gestionnaire d'intérêt (ROI) (si nécessaire; figure 1B). Une tablette à écran tactile (comme un iPad) est utile pour cette procédure. iPads peut être connecté à un ordinateur comme un moniteur externe en utilisant un logiciel d'affichage de l'air.
8. Exporter les résultats de mesure et les informations associées (nom de fichier, le temps de la floraison, disséqués par mesurées par, etc) vers Microsoft Excel ou un logiciel équivalent.

4. Feuille d'analyse d'images de cellules dans ImageJ

1. Fixer disséqué laisse comme décrit dans la référence ¹⁵ après la numérisation (étape 2). Feuilles FAA fixes peuvent être conservés dans 4 ° C pendant au moins 6 mois.
2. Effacer les feuilles en changeant fixateur FAA à la solution de l'hydrate de chloral et les feuilles incuber pendant 1 à 2 heures avant l'observation microscopique ^15.
3. Mont quitte le microscope glisse avec trichomes vers le haut. En utilisant un grossissement 40x sur un microscope optique, l'image de la couche de mésophylle le centre de chaque feuille de chaque côté de la nervure principale, en évitant les cellules proches de trichomes ou des veines.
4. Cellule de feuille de trace décrit par l'outil ImageJ gestionnaire retour sur investissement avec l'aide de la tablette à écran tactile et un stylet (comme décrit dans l'étape 3). Cellule d'analyse d'image utilise les fonctionnalités intégrées de ImageJ mais n'exige pas LeafJ.

Résultats

1. Images Feuille Affichage estimations du pétiole et limbe frontière, et leur fenêtre de mesure

L'une des caractéristiques les plus utiles de LeafJ est la détection automatique des limbe / Pétiole limite (figure 1). L'algorithme LeafJ fonctionne comme suit: le haut-ImageJ ParticleAnalyzer fonctionnalité est utilisée pour trouver et déterminer l'orientation des feuilles à l'intérieur de la sélection de l'utilisateur. Pour chaque feuille de la lar...

Discussion

Notre "LeafJ" plugin permet de mesurer la longueur du pétiole semi-automatique, en augmentant le débit de près de 6 fois plus de mesure manuelle. Longueur du pétiole est un indice important de la SAS et est également un emblème d'autres phénomènes, comme la résistance de submersion et la croissance hyponastic ^17. Par conséquent, ce plugin peut être utile à un large éventail de chercheurs de plantes.

Notre plugin est mis en œuvre dans un réseau bien ét...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
rouge lointain lumière LED	Orbitec	sur mesure
transparence	IKON	HSCA / 5
scanner	Epson	Epson Perfection V700 PHOTO
Image J	NIH		http://rsbweb.nih.gov/ij/
LeafJ	coutume		http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab
Air Display	Avatron Software Inc		blank "> http://avatron.com/
iPad2	Apple Inc		http://www.apple.com/