LeafJ: Un Plugin para ImageJ Semi-automático Medición Hoja Forma

Resumen

Demostración de métodos clave para la alta mediciones de rendimiento de hoja. Estos métodos se pueden utilizar para acelerar fenotipificación hoja al estudiar muchos mutantes de plantas o de otra manera las plantas de selección por fenotipo hoja.

Resumen

Fenotipado de alto rendimiento (phenomics) es una herramienta poderosa para la vinculación de genes a sus funciones (véase la revisión ¹ y ejemplos recientes ^2-4). Las hojas son el órgano fotosintética primaria, y su tamaño y forma pueden variar de desarrollo y el medio ambiente dentro de una planta. Por estas razones, los estudios sobre morfología de las hojas requieren la medición de varios parámetros de numerosas hojas, que no hay nada mejor semi-herramientas automatizadas phenomics ^5,6. Sombra Canopy es una señal importante del medio ambiente que afecta a la arquitectura de planta y la historia de vida, el conjunto de las respuestas se conocen colectivamente como el síndrome de evitación sombra (SAS) ^7. Entre las respuestas de SAS, sombra hoja inducida alargamiento pecíolo y los cambios en la zona de la cuchilla son particularmente útiles como índices ^8. Hasta la fecha, los programas de hoja de forma (por ejemplo, forma ^9, lámina ^10, LeafAnalyzer ^11, LEAFPROCESSOR ¹²⁾ se pueden medir los contornos de hojas y categorizar formas de hojas, Pero no puede dar salida a la longitud del pecíolo. La falta de sistemas de medición a gran escala de los pecíolos de las hojas ha inhibido enfoques phenomics a SAS investigación. En este trabajo se describe un nuevo desarrollo de plug-ImageJ, llamado LeafJ, que rápidamente se puede medir la longitud del pecíolo y los parámetros de láminas foliares de la planta modelo Arabidopsis thaliana. Para la hoja ocasional que la corrección manual requerido de la frontera hoja peciolo / hoja se utilizó una tableta de pantalla táctil. Además, la forma de la hoja móvil y el número de hojas móviles son determinantes importantes del tamaño de la hoja ^13. A parte de LeafJ también presentamos un protocolo para el uso de una tableta con pantalla táctil para la medición de la forma celular, el área y tamaño. Nuestro rasgo hoja sistema de medición no se limita a la investigación de evitar la sombra y acelerará fenotipificación hoja de muchos mutantes y plantas de detección por fenotipificación hoja.

Protocolo

1. Materiales vegetales

Tenga en cuenta que este protocolo tiene como objetivo el crecimiento de plantas para la detección de tono de respuesta de evitación. Usted puede crecer las plantas en su condición de favorito.

1. Espolvorear semillas de Arabidopsis thaliana en el agua empapados papeles de filtro en placas de Petri de 9 cm y almacén (estratificar) los a 4 ° C durante cuatro días en la oscuridad.
2. Transfiera estas placas de Petri para condiciones de sol simulados: 80-100 μE radiación fotosintéticamente activa (PAR) y suplemento rojo lejano para llevar el R: FR proporción a 1,86. Utilice las condiciones de día largo (16 h de luz / 8 h oscuridad) y temperatura constante de 22 º C. Incubar en este estado durante tres días para permitir que las semillas germinen.
3. Traslado de semillas germinadas en el suelo y mantener las plantas en condiciones dom. Para los experimentos a gran escala, se recomienda la preparación de pequeñas etiquetas para etiquetar cada una las plantas mediante el uso de datos Administrador de combinación de Microsoft Word 2004 (o posterior) para la fabricación de etiquetas.
4. Once días después de transfer al suelo, mover la mitad de las plantas a condiciones de sombra: lo mismo que sol, pero con suplemento luz roja lejana para que la relación R / FR a 0,52.
5. Después de un período adicional de doce días, las plantas están listas para la formación de imágenes hoja. En esta etapa, las hojas más viejas han madurado completamente, mientras que las hojas más jóvenes están todavía en expansión, por lo que permite capturar una instantánea del desarrollo. Es posible que desee elegir un momento diferente de desarrollo en función de sus necesidades.

2. La captura de imágenes disecados Leaf

1. Prepare hojas de transparencias marcados con genotipo de la planta y las condiciones de crecimiento con cinco marcos rectangulares. Un cuadro corresponde a las hojas de una planta. Microsoft Excel puede ser utilizado para imprimir una rejilla coherente con las etiquetas.
2. Diseccionar hojas de las plantas veintiséis días de edad.
3. Scan sale a 600 ppp en un escáner de cama plana. Tenga en cuenta que las hojas de una planta se debe colocar verticalmente dentro de una ventana de color negro en un sándwich de láminas transparentes. Evite tocar las hojasa un marco de ventana de color negro y las hojas se solapan, lo que dará errores en los procedimientos siguientes.

3. Hoja de Análisis de Imágenes por LeafJ

1. Descargar ImageJ Arrastre el archivo LeafJ.jar en la carpeta plugins de ImageJ.
2. Abra un archivo de imagen en ImageJ 1.45s ó ¹⁴ después.
3. Dividir la imagen en tres canales de color (rojo, verde, y azul) por "Color>> Canales de split" y aplicar umbral a la imagen en el canal azul.
4. Seleccionar todas las hojas de una planta con una herramienta rectángulo (Figura 1A).
5. Seleccione "LeafJ" del menú plugin.
6. Seleccione información de anotación para esta planta desde el cuadro de diálogo que aparece. Usted puedeeditar los valores predeterminados que aparecen aquí haciendo clic en "editar estas opciones".
7. Después de ejecutar plugins LeafJ y antes de hacer clic en "OK", editar líneas trazadas desde la región de la ventana del administrador de interés (ROI) (si es necesario; fig. 1B). Una tableta con pantalla táctil (como el iPad) es útil para este procedimiento. iPads se puede conectar a un ordenador y un monitor externo usando software Air Display.
8. Exportación de resultados de las mediciones y la información asociada (nombres de archivo, tiempo de floración, disectadas por, medidos por, etc) para Microsoft Excel o software equivalente.

4. Célula de la hoja de análisis de imágenes ImageJ en

1. Fijar diseccionado hojas como se describe en la referencia ¹⁵ después de la digitalización (paso 2). FAA hojas fijas se pueden mantener en 4 ° C durante al menos 6 meses.
2. Limpiar las hojas cambiando fijador FAA para solución hidrato de cloral y las hojas se incuban durante 1 ~ 2 horas antes de la observación microscópica ^15.
3. Mount deja en micopio desliza con tricomas hacia arriba. Uso de un aumento de 40x en un microscopio compuesto, la imagen de la capa de mesófilo el centro de cada hoja en cada lado de la vena principal, evitando las células cerca de tricomas o venas.
4. Célula de seguimiento hoja describe por la herramienta de ImageJ gerente ROI con la ayuda de la tableta de la pantalla táctil y un lápiz óptico (como se describe en el paso 3). Análisis de imagen celular utiliza las funciones incorporadas de ImageJ, pero no requiere LeafJ.

Resultados

1. Imágenes de hoja que muestra estimaciones del pecíolo y lámina de la hoja de Fronteras, y su ventana de medición

Una de las características más útiles de LeafJ es la detección automática de la hoja de cuchilla / pecíolo límite (Figura 1). El algoritmo LeafJ funciona como sigue: la incorporada en el ImageJ funcionalidad ParticleAnalyzer se utiliza para buscar y determinar la orientación de las hojas en el interior de la selección del usuario. Para cada hoja de la...

Discusión

Nuestro "LeafJ" plugin permite la medición de la longitud del pecíolo semi-automáticamente, aumentando el rendimiento casi 6 veces la medición manual. Longitud del peciolo es un índice importante de SAS y es también un punto de referencia de otros fenómenos, como la resistencia a la inmersión y el crecimiento hyponastic ^17. Por lo tanto este plugin puede ser útil para una amplia gama de investigadores de la planta.

Nuestro plugin se ejecuta en un sistema bien es...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
la luz roja lejana LED	Orbitec	encargo
transparencia	IKON	HSCA / 5
escáner	Epson	Epson Perfection V700 Photo
Image J	NIH		http://rsbweb.nih.gov/ij/
LeafJ	costumbre		http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab
Air Display	Avatron Software Inc.		blank "> http://avatron.com/
iPad 2	Apple Inc.		http://www.apple.com/