LeafJ：半自動化された葉の形状計測のためのImageJのプラグイン

要約

高スループットの葉測定のための主要なメソッドのデモンストレーション。葉の表現型によって多くの植物変異体または他の方法でスクリーニング植物を勉強したときにこれらの方法は、葉表現型解析を加速するために使用することができます。

要約

ハイスループット表現型（フェノミクス）は（レビュー¹と最近の例^2-4を参照）、それらの機能に遺伝子を連結するための強力なツールです。葉は一次光合成器官であり、その大きさや形状は、工場内の発達や環境によって異なります。これらの理由から、葉の形態に関する研究は最高の半自動化ツールフェノミクス^5,6によって行われ、多数の葉から、複数のパラメータの測定を必要とする。キャノピーシェードは、植物のアーキテクチャと生活史に影響を与える重要な環境合図です;応答一式を総称して日陰の忌避症候群（SAS）の⁷と呼ばれています。 SASの応答の中で、誘導された日陰の葉葉柄伸長およびブレード面積の変化は、インデックス⁸として特に有用である。現在までに、葉の形のプログラム（ 例えば 、SHAPE ^9、ラミナ¹⁰ LeafAnalyzer ¹¹ LEAFPROCESSOR ^12）葉の輪郭を測定し、葉の形を分類することができますしかし、葉柄の長さを出力することはできません。葉の葉柄の大規模な計測システムの欠如は、SAS研究へフェノミクスアプローチを阻害してきた。本稿では、急速にモデル植物シロイヌナズナの葉柄長、葉身のパラメータを測定することができLeafJと呼ばれる新開発のImageJプラグインについて解説する。葉柄/リーフブレード境界の必要な手動補正は、我々はタッチスクリーンのタブレットを使用したことを時​​折葉のために。さらに、葉の細胞の形状及び葉の細胞数は葉の大きさ¹³の重要な決定要因である。 LeafJは別に我々はまた、セルの形状、面積、サイズを測定するためのタッチスクリーンのタブレットを使用するためのプロトコルを提示。私たちの葉の形質の測定システムは日陰回避の研究に限定されず、葉表現型解析により多くの変異体およびスクリーニング植物の葉の表現型解析を加速していきます。

プロトコル

1。植物材料

この植物の成長プロトコルは日陰回避反応を検出するための目的としていることに注意してください。あなたの好きな条件の下で植物を育てることができます。

1. 彼らは暗闇の中で4日間4℃（階層化）9センチメートルペトリ皿とストアに濾紙を浸した水でシロイヌナズナの種子は振りかける。
2. シミュレートされた日の状態にこれらのペトリ皿を移す：1.86にFR比：80から100μE光合成有効放​​射（PAR）と遠赤サプリメントは、Rを持参する。長日条件（16時間明/ 8時間暗）、22℃の一定温度を使用する種子が発芽できるようにするために3日間この条件でインキュベートする。
3. 土壌に発芽種子を移し、日条件下で植物を保つ。大規模な実験のために、私たちはラベルを作るためのMicrosoft Word 2004（またはそれ以降）でのデータマージマネージャを使用して各植物を標識するための小さなタグを準備することをお勧めします。
4. 11日後のTR土壌へansferは、日陰の条件に対する植物の半分を移動：日としてではなく、0.52にR / FR比をもたらすために補足遠赤色光と同じ。
5. 追加の12日後、植物は葉のイメージングのための準備が整いました。あなたは開発のスナップショットをキャプチャされるよう若い葉がまだ拡大しているのに対し、この段階では、古い葉が完全に成熟してきた。あなたのニーズに応じてさまざまな発達の時間を選択することもできます。

2。解剖葉の画像を取り込む

1. 5長方形のフレームを持つ植物の遺伝子型と成長条件で標識された透明シートを準備します。一つのフレームは1から植物の葉に対応しています。 Microsoft Excelは、ラベルと一致してグリッドを印刷するために使用することができます。
2. 二〇から六日目の植物の葉を解剖。
3. スキャンは、フラットベッドスキャナで600dpiで残します。 1工場から出るノートは透明シートのサンドイッチに黒いウィンドウ内に垂直に配置する必要があります。葉に触れないようにしてください以下の手順でエラーを与える黒い窓枠と重複葉、へ。

3。 LeafJによる葉の画像解析

1. ImageJのダウンロードImageJのプラグインフォルダにLeafJ.jarファイルをドラッグします。
2. ImageJは1.45s以降¹⁴で画像ファイルを開きます。
3. "イメージ>カラー>スプリットチャネル"による三色チャンネル（赤、緑、青）に画像を分割し、青チャンネルの画像にしきい値を適用します。
4. 長方形ツール（ 図1A）で1植物から葉をすべて選択します。
5. プラグインメニューから "LeafJ"を選択します。
6. 表示されるダイアログボックスから、この植物のアノテーション情報を選択します。あなたができる"これらのオプションを編集"をクリックしてここに表示されるデフォルト値を編集します。
7. LeafJプラグインを実行した後、 "OK"ボタンをクリックする前に、関心領域（ROI）のマネージャのウィンドウ（; 図1B必要な場合）の領域からトレース行を編集します。タッチスクリーンのタブレットは（iPadなど）は、この手順のために有用である。 iPadではエアディスプレイ·ソフトウェアを使用して外部モニタとしてコンピュータに接続することができます。
8. 測定結果およびMicrosoft Excelまたは同等のソフトウェアに関連する情報（ファイル名、開花時期によって、解剖により測定など）をエクスポートします。

4。 ImageJの中で葉の細胞画像解析

1. 切開修正する（ステップ2）スキャンした後にリファレンス¹⁵に記載のように残します。 FAA固定葉は少なくとも6ヶ月間、4℃に保つことができる。
2. 顕微鏡観察^15日までに1〜2時間抱水クロラール水溶液とインキュベート葉にFAAの固定を変更することにより、葉をクリアします。
3. マウントはマイルの葉croscopeは毛を上に向けてスライドします。毛や静脈の近くに細胞を避け、主静脈のいずれかの側のそれぞれの葉の中心の肉層画像、複式顕微鏡で40倍の倍率を使用しています。
4. タッチスクリーンタブレットとスタイラス（手順3で説明）の助けを借りて、ImageJのROI Managerツールで葉細胞の輪郭をトレースします。細胞画像解析はImageJの組み込み機能を使用しますが、LeafJを必要としません。

結果

1。葉柄と葉身の境界の推定値を示し、葉画像、およびその計測ウィンドウ

LeafJの最も便利な機能の一つは、葉身/葉柄境界（ 図1）の自動検出である。 LeafJアルゴリズムは次のように動作します。ビルトインImageJのParticleAnalyzer機能は、ユーザーの選択の内側の葉の向きを見つけて、決定するために使用されます。それぞれの葉のために葉の幅は葉の全体の軸に?...

ディスカッション

私たちの "LeafJ"プラグインは手動測定のスループット約6倍に増加し、半自動的に葉柄の長さの測定を可能にします。葉柄の長さは、SASの重要な指標であり、またそのような冠水抵抗とhyponastic成長¹⁷のような他の現象のランドマークとなっています。したがって、このプラグインは、植物の研究者の広い範囲に役に立つかもしれません。

我々のプラグイン?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号
LEDは遠赤色光	Orbitec	カスタムメード
透明性	IKON社	HSCA / 5
スキャナー	エプソン	エプソンパーフェクV700 PHOTO
画像J	NIHの		http://rsbweb.nih.gov/ij/
LeafJ	カスタム		http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab
エアディスプレイ	Avatronソフトウェア株式会社		ブランク "> http://avatron.com/
iPad2の	たApple Inc。		http://www.apple.com/