定量高通量单细胞的细胞毒性T细胞的测定

摘要

我们描述了一种单细胞的高通量的检测，以测量与肿瘤靶细胞的培养时的细胞毒性T细胞。此方法采用致密的，弹性体子纳升井（〜100,000井/数组）的数组，在空间上局限在T细胞和靶细胞，在规定的比例，和被耦合到的荧光显微镜来监测效靶共轭和随后的细胞凋亡。

摘要

肿瘤免疫治疗可以利用的目标和消灭肿瘤的特异性免疫反应。继细胞治疗（ACT）T细胞过继的转基因表达的嵌合抗原受体（CAR）的基础上，已表现出相当大的希望在临床试验中^1-4。有几个好处使用CAR ⁺ T细胞治疗癌症的能力为目标，非MHC限制性抗原和功能化的T细胞以达到最佳的生存，归巢内的主机和持久性，并最终诱导细胞凋亡的CAR ⁺ T细胞在宿主毒性⁵的事件。

划定的最佳功能的CAR ⁺与临床受益相关的T细胞是必不可少的设计的临床试验的下一代。多光子显微镜等活的动物成像的最新进展，彻底改变了我的免疫细胞功能的研究体内^6,7。虽然这些研究已经推进了我们理解，T细胞在体内的功能，基于T-细胞的ACT在临床试验中需要需要链接分子和功能特性的T-细胞的准备预浸液与临床疗效输注后，通过利用在体外实验监测T细胞的功能，如，细胞毒性和细胞因子分泌。已经开发了确定在单细胞水平的T细胞数量的整体运作，但这些是不适合用于监测共轭形成和寿命或相同的小区的能力，杀多个目标⁸标准基于流式细胞仪检测。

微型阵列设计生物相容性的聚合物，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）是一个特别有吸引力的方法，在空间上限制小体积效应和目标^9。结合时间的推移自动荧光显微镜，寿usands效靶相互作用可同时监控纳为阵列的成像个别井。在这里，我们提出一种高通量的方法，用于监测在单细胞水平，可以广泛地应用于研究T细胞的细胞溶解功能的T细胞介导的​​细胞毒性。

研究方案

1。试剂准备

1. 准备通过混合500毫升的RPMI-1640和5毫升的RPMI-PLGH每个青霉素 - 链霉素，L-谷氨酰胺，和HEPES溶液。
2. 在混合用10％胎牛血清（FBS）的RPMI-PLGH准备R10溶液。 FBS是于56℃下30分钟，加入之前热灭活。
3. 预保温在37℃下50毫升的RPMI-PLGH的，15毫升PBS中，和15ml无菌锥形管中的R10。
4. 在PDMS：硅主阵列的nanowells采用光刻基本上如前所述^，10的制造。调匀Sylgard的184弹性体套件碱剂和固化剂按10:1的重量比在一个一次性杯使用塑料刀。脱气的混合物1小时，在真空室中。到纳为阵列，倒入密封载玻片上，让它坐在30分钟。的组件转移到设置为80℃下进行2小时的烘箱中，并在室温下搅拌1小时，放凉。弹性体电流E在此期间，将债券载玻片上。含有PDMS纳为阵列的载玻片仔细升空硅主站，覆盖着透明胶带和保存，直到将来使用。

2。靶细胞（T）标签

1. 使用血细胞计数器和颗粒细胞计数5000000从细胞培养的靶细胞在无菌的15毫升锥形管，通过离心分离，在340×g离心5分钟。被分裂的细胞培养的前一天，在5毫升的总体积（密度= 1万个/ ml），并培养在T-25烧瓶（VWR）。已经描述了用于细胞计数使用血细胞计数仪的协议在前面已经详细¹¹
2. 吸出多余的介质，留下了约50微升的媒体。
3. 准备一个有效的解决方案的细胞追踪红（CTR）的混合0.5微升CTR股票（1毫米），150μLRPMI-PLGH（终浓度为2.5μM）。到靶细胞的工作溶液，并加入150μl调匀使用P200的吸移管。PKH 26（最终浓度为2μM）或者，可以使用的标签的靶细胞，按照制造商的说明。
4. 在37℃/ 5％CO _2中孵育20分钟。

3。效应（E）细胞标记

1. 计数5000000效应细胞在无菌的15毫升锥形管使用血细胞计数器和颗粒细胞在340×g离心5分钟，通过离心从细胞培养。
2. 吸出多余的介质
3. 准备Vybrant DyeCycleViolet染色溶液的工作溶液的1微升的5mM Vybrant紫罗兰库存通过添加1毫升的R10培养基中（终浓度为5μM）。添加到细胞中的工作溶液，并重新悬浮使用P200的吸移管。 PKH 67（最终浓度为2μM）或者，可以使用的标签的靶细胞，按照制造商的说明。如果使用PKH 67，然后SYTOX格林不应使用，因为它们是在相同的荧光信道。凋亡的目标是只使用一个枚举在这种情况下，nnexinV染色。
   注：如果执行的时间推移，而不是端点测量，应避免UV染料类似Vybrant紫罗兰。
4. 在37℃/ 5％CO _2中孵育20分钟。

4。使用密度梯度活的和死细胞的分离

1. 加入6.8毫升和6.0毫升RPMI-PLGH的目标和效应细胞，分别由上下吹打轻轻混合。
2. 层的FICOLL帕克加上每个锥形管的底部包含目标和效应细胞的3.5毫升。层FICOLL慢慢地确保形成层之间FICOLL和媒体。
3. 在340×g离心30分钟，离心两管。没有制动和加速。
4. 在离心过程中，转移到4 - 孔板7毫升预先温热的PBS。准备纳为阵列（PDMS中制作）：清洁底部的载玻片上，用乙醇和氧化PDMS在高RF设置使用1分钟的等离子体氧化。这一步将STErilize纳为阵列中，同时也使PDMS的亲水性。立即将纳为阵列到板PBS。
5. 板，生物安全柜，吸去多余的PBS。 10毫升1％高尚的琼脂100毫克琼脂粉加入10毫升去离子水，然后微波30-45秒。应用温暖1％贵金属琼脂上的顶部和底部边缘的载玻片，包含纳为阵列固定阵列，等待10分钟的琼脂固化。加入3毫升PBS和吸出多余的琼脂。
6. 加入3毫升R10纳为阵列的顶部上，并让它〜10分钟的平衡。
7. FICOLL离心分离之后，从每个管顶端层吸5毫升媒体。要小心，不要吸出含有细胞层。
8. 收获细胞（白层）通过回收从与P1，000吸移管和移动到新的无菌锥形管FICOLL和介质层之间的1-2毫升。重复此为套细胞，同时确保你的格言IZE恢复细胞。
9. 加入3毫升预热的RPMI-PLGH每个管中，通过移液混合和颗粒通过离心分离在340×g离心5分钟，充分的加速度和制动。
10. 吸出多余的介质，加入5毫升预热的RPMI-PLGH，每个试管和，重复离心340×g离心5分钟。
11. 吸出多余的介质和悬浮细胞沉淀在500μl的R10。
12. 使用台盼蓝排除方法血球计数器的计数活细胞。

5。手机装上纳为阵列

1. 吸纳为阵列的多余的介质，并加入2毫升的新鲜R10在阵列中。吸再次而确保纳为阵列的顶部是不是太湿/干的，因为它会影响细胞分布。
2. 存款1×10 ⁵效应细胞纳为阵列表面在200微升R10到（密度= ^5×10 5细胞/ ml）。
3. 让细胞沉降5分钟，并使用标准的组织培养显微镜检查为en确定细胞的分布优选。如果需要添加更多的细胞。
4. 存款1×10 ⁵靶细胞在200μlR10纳为阵列表面上（密度= 5×10 ⁵细胞/ ml）。
5. 让细胞5分钟，并使用标准的组织培养显微镜检查，以确保细胞的分布优选定居。如果需要添加更多的细胞。
6. 仔细冲洗纳为阵列，用2毫升R10和吸出多余的介质。
7. 准备在15毫升无菌锥形管3毫升预先温热的R10。加入3μl的0.5mM的SYTOX格林核酸着色漆（最终浓度为0.5μM）和60μl的膜联蛋白V-的Alexa Fluor 647准备工作溶液。仔细，同时确保细胞不从井到4孔板中添加有效的解决方案。
8. 在37℃/ 5％CO _2中孵育15分钟。

6。成像1

1. 采集图像的纳为阵列使用荧光MICR的Oscope：在这个例子中，我们使用ZEISS观察，Z-1显微镜配备了一个机动阶段和Lambda DG4。
2. 初始化的软件和显微镜检查的信号强度上的透射光，和其他荧光通道。总体而言，将有五道相对应的透射光，膜联蛋白V-647（Cy5的过滤器），CTR（红色荧光蛋白过滤器），SYTOX绿色（FITC过滤器），并Vybrant的紫（DAPI过滤器）。确保显微镜的设置，以确保最大的信号噪音，同时避免饱和。
3. 设置为纳为阵列的X和Y位置。零位置设置和初始化焦点上的中心的7×7纳为阵列块上的纳为阵列邮票左上角开始过程。设置的x，y的位置，以配合每个块的中心的z值，以准确地反映在每个块上的焦点。
4. 一旦位置和焦点都设置，确保线性模式设置图像采集和采集图像。 注意：如果需要打开孵化器和CO ₂在显微镜实验前至少30分钟。

7。成像后

转移到6小时的孵化器（37℃/ 5％CO _2）的4 -孔板含有纳为阵列。

8。成像2

采集图像在所述第二时间点，在步骤6中所概述。

9。图像分析

1. 细胞内的nanowells占用确定通过使用适当的图像分割程序（ 例如 ImageJ的， http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）基本上如前面所述的^9,12。
2. 的显微镜图像（t = 0时小时; 吨_0）的初始集合的分析是用来生成一个数据库含有一个活的靶细胞（确定个别nanowells[的CellTracker红色，红色），无死细胞（Annexin V染色鉴定，绿色）[T1T ₀ nanowells。
3. 显微镜图像的第二组（ 吨 = 6小时;吨_6）分析，用于独立地确定一个第二数据库的nanowells含有1靶细胞（红色）[T1T ₆ nanowells]。实现的完整性校验（数据库查询），以确保在t = ₀的所有活靶在t ₆的目标相匹配，以产生最终的集的匹配目标（作为具有T1T ₀ = ₆ T1T指定为T1match的nanowells实现）
4. 在nanowells效应细胞的数目被确定使用Vybrant紫染色在 t ₀ [E1 nanowells]
5. 实现数据库查询确定含有单效应的nanowells共同培养的单一目标（E1和T1的_比赛作为nanowells，指定为E1T1的定义）
6. 由我打进效应诱导细胞凋亡 dentifying的目标是在t = ₀和Annexin V阳性T _4（E1T1与Annexin V的目标染色在t _6），膜联蛋白V负。

10。可选的延时成像的杀戮使用尼康BioStation IM

1. 盖玻片底培养皿中切出一小片的纳为阵列芯片（步骤5）编制的盖玻片上，将完全适合。请确保该芯片切割时，保持湿润。
2. 混合料1×10 ^6个目标和1×10 ⁶的T细胞在100μl培养基，移液到盖玻片。
3. 允许约15-30分钟，让细胞定居。
4. 快速反转的小纳为阵列芯片，并把它放在盖玻片。
5. 为了确保芯片将无法移动的摄像过程中，放置芯片的顶部上的一个或两个20毫米x 20mm的盖玻片。轻轻地施加压力，推动芯片的底部的菜。

10吨“> 注：的纳为阵列芯片的底部是过于厚的高清晰度成像，因此具有向被打开倒挂，在此期间，许多细胞被洗出。由于本可以不被容易控制，细胞数步9.2在步骤9.3中，孵育时间必须进行优化设计。

结果

在图2中的应用程序的一个示例的高通量的细胞溶解测定表明。简要地说，标记的CD19-特异性CAR ^{+ T}细胞的共同培养与标记的小鼠EL4靶细胞中的纳为阵列的各个井（第1-5）。最初的图像被记录在自动荧光显微镜来识别占用阵列（第6章）（效应和/或目标）的每一个纳为。用于图像处理，找出所有包含一个单一的目标和单效应和nanowells以排除nanowells含有死的目标（第9条）。被转移?...

讨论

我们概述了协议，用于高吞吐量的单细胞的细胞溶解测定启动阵列nanowells（ 图1）中的效应和目标通过共同孵育。除了吞吐量的技术的一个主要优点是能够监视对所希望的靶细胞效应的介导的细胞毒性，而不需要为这又允许使用自体或匹配/主肿瘤细胞作为靶细胞的靶细胞工程。的空间限制允许检索并随后在结束测定⁹功能性T细胞克隆。检测的一个限制是需要专门的自动化阶段?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂/材料名称	公司	目录编号	评论
RPMI-1640 W / O型L-谷氨酰胺	Cellgro	15-040-CV
青霉素，链霉素	Cellgro	30-002-CI	10,000 IU青霉素10,000μg/ ml的链霉素
L-谷氨酰胺	Cellgro	25-005-CI	200毫米的解决方案
HEPES	Sigma Aldrich公司	H3537	1M
牛胎儿血清（FBS）的	亚特兰大生物	S11150	地段测试
手机追踪器红染色	Invitrogen公司	C34552	50微克
Vybrant DyeCycle紫染色	Invitrogen公司	V35003	5毫米
SYTOX绿色核酸染料	Invitrogen公司	S7020	5毫米
膜联蛋白V-的Alexa Fluor 647	Invitrogen公司	A23204	500μL
的Dulbecco PBS	Cellgro	21-031-CV	500毫升
高贵的琼脂	DIFCO	2M220	100克
台盼蓝	Sigma Aldrich公司	T8154	0.4％液，无菌过滤
血球计数仪	豪塞尔科学	1492	亮线
4 - 孔板	赛默飞世尔	167603
Harrick旅游等离子清洗机	Harrick旅游等离子	PDC-32G	基本的等离子清洗机
Observer.Z1	ZEISS		荧光显微镜（与下面的三个部分）
拉姆达10-3	萨特仪器		过滤器控制器
拉姆达DG-4	萨特仪器		超高速波长转换器
滨松EM-CCD相机	滨松	C9100-13	CCD显微镜摄像头
15毫升锥形管	BD猎鹰	352097
50毫升锥形管	VWR	3282-345-300
尼康Biostation	尼康仪器公司	Biostation IM
玻璃底培养皿	MatTek公司	P35G-0	35毫米培养皿中，10毫米微孔