Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Zusammenfassung

Krebs-Immuntherapie bändigen können die Spezifität der Immunantwort zu zielen und zu beseitigen Tumoren. Adoptiven Zelltherapie (ACT), basierend auf den adoptiven Transfer von T-Zellen gentechnisch verändert, um ein chimäres Antigen-Rezeptor (CAR) ausdrücken hat beträchtliches Potential in klinischen Versuchen ^1-4 dargestellt. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung CAR ⁺ T-Zellen für die Behandlung von Krebsarten, einschließlich der Fähigkeit, nicht-MHC-beschränkte Antigene gezielt eingesetzt werden und die T-Zellen zur optimalen Überleben, Homing und Persistenz im Wirt zu funktionalisieren, und schließlich, um Apoptose zu induzieren von CAR ⁺ T-Zellen bei Wirtstoxizität ^5.

Abgrenzung der optimalen Funktionen des CAR ⁺ T-Zellen mit klinischen Nutzen zugeordnet ist von wesentlicher Bedeutung für die nächste Generation von klinischen Studien. Jüngste Fortschritte in der lebenden Tier Bildgebung wie Mehrphotonenmikroskopie revolutioniert haben die Studie von Immunzellen Funktion in ^6,7 vivo. Während diese Studien unser Verständnis der T-Zell-Funktionen in vivo T-Zell-basierte ACT in klinische Studien haben vorgeschoben erfordert die Notwendigkeit, die molekularen und funktionellen Eigenschaften der T-Zell-Zubereitungen Vorinfusionsleitung mit klinischen Wirksamkeit Nachinfusionsleitung verknüpfen, durch Verwendung in vitro-Assays überwacht T-Zell-Funktionen wie, Zytotoxizität und Zytokinsekretion. Standard Durchflusszytometrie basierende Assays entwickelt worden, bestimmen die allgemeine Funktionsweise von Populationen von T-Zellen in der Ebene einzelner Zellen, aber diese sind nicht geeignet für die Überwachung Konjugat Bildung und Leben oder die Fähigkeit der gleichen Zelle zu töten mehrere Ziele ^8.

Mikrohergestellte Arrays in biokompatible Polymere wie Polydimethylsiloxan (PDMS) ausgebildet sind ein besonders attraktives Verfahren zur räumlich beschränken Effektoren und Targets in kleinen Mengen ^9. In Kombination mit automatisierten Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie, thousands von Effektor-Target-Wechselwirkungen können gleichzeitig durch bildgebende einzelnen Vertiefungen einer nanowell Arrays überwacht werden. Wir stellen hier eine Hochdurchsatz-Methodik zur Überwachung T-Zell-vermittelte Zytotoxizität bei der Einzelzell-Ebene, die weitgehend für die Untersuchung der Funktionalität von cytolytischen T-Zellen angewendet werden kann.

Protokoll

Ein. Reagenzien Vorbereitung

1. Planen RPMI-PLGH durch Mischen von 500 ml RPMI-1640 und jeweils 5 ml Penicillin-Streptomycin, L-Glutamin, und HEPES-Lösung.
2. Planen R10 Lösung durch Mischen RPMI-PLGH mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Die FBS ist hitzeinaktiviertem bei 56 ° C für 30 min vor der Zugabe.
3. Vorwärmen bei 37 ° C 50 ml RPMI-PLGH, 15 ml PBS und 15 ml R10 in sterilen konischen Rohren.
4. Herstellung von Arrays von nanowells in PDMS: Das Silizium-Master hergestellt ist unter Verwendung von Photolithographie Wesentlichen wie zuvor beschrieben ^10. Gründlich mischen die Sylgard 184 Elastomer-Kit Basis und Härter bei 10:1 Gewichtsverhältnis in einem Einwegbecher mit einem Kunststoff-Messer. Entgasen das Gemisch in einer Vakuumkammer für 1 Stunde. Gießen Mischung auf die nanowell Array versiegeln mit einem Objektträger aus Glas und lassen Sie es für 30 Minuten sitzen. Übertragen Sie die Baugruppe in einem Ofen auf 80 ° C für 2 Stunden und ließ bei Raumtemperatur abkühlen 1 Stunde. Das Elastomer wird Aktuelle während dieser Zeit und verbindet sich mit dem Glasträger. Der Objektträger mit dem PDMS nanowell Array wird vorsichtig von der Silizium-Master aufgehoben, bedeckt mit Klebeband und gelagert, bis die zukünftige Verwendung.

2. Zielzelle (T) Labeling

1. Zählen 5.000.000 Zielzellen aus Zellkultur unter Verwendung eines Hämozytometers und Pellet die Zellen in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugieren bei 340 × g für 5 min. Die Zellkultur wird geteilt am Vortag in 5 ml Gesamtvolumen (Dichte = 1 Millionen / ml) kultiviert und in T-25-Kolben (VWR). Protokolle für Zellzählung unter Verwendung Hämozytometer wurden im Detail zuvor beschrieben ¹¹
2. Saugen Sie überschüssige Medien hinterließ etwa 50 ml Medien.
3. Vorbereiten einer Arbeitslösung von Cell Tracker Red (CTR) durch Mischen von 0,5 ul CTR Lager (1 mM) in 150 ul RPMI-PLGH (Endkonzentration 2,5 pM). Fügen Sie 150 ul der Arbeitslösung zu den Zielzellen und gründlich mit einem P200 Pipette.Alternativ können PKH 26 (Endkonzentration von 2 uM) Label Zielzellen gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
4. Bei 37 ° C / 5% CO ₂ für 20 min.

3. Effektor (E) Cell Labeling

1. Zählen 5.000.000 Effektorzellen aus Zellkultur unter Verwendung eines Hämozytometers und Pellet die Zellen in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugieren bei 340 × g für 5 min.
2. Saugen Sie überschüssige Medien
3. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung Vybrant DyeCycleViolet Stain Lösung durch Zugabe von 1 ul 5 mM Vybrant Violet Lager zu 1 ml R10 Medien (Endkonzentration von 5 uM). Fügen Sie die funktionierende Lösung zu den Zellen und resuspendieren mit P200 Pipette. Alternativ können PKH 67 (Endkonzentration von 2 uM) Label Zielzellen gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden. Wenn PKH 67 verwendet wird, dann SYTOX Green sollten nicht verwendet, da sie in der gleichen Fluoreszenzkanal sind. Die Aufzählung der apoptotischen Ziele erfolgt ausschließlich mit AnnexinV Färbung in diesem Fall.
   Hinweis: Wenn die Durchführung Zeitraffer-und nicht Endpunkt Messungen, UV Farbstoffe wie Vybrant Violet sollte vermieden werden.
4. Bei 37 ° C / 5% CO ₂ für 20 min.

4. Trennung von lebenden und toten Zellen durch einen Dichtegradienten

1. Fügen Sie 6,8 ml und 6,0 ​​ml RPMI-PLGH zum Ziel und Effektorzellen bzw. und mischen durch Auf-und Abpipettieren vorsichtig.
2. Layer 3,5 ml Ficoll-Paque Plus Unterseite jedes konische Röhrchen mit Ziel-und Effektorzellen. Schicht die FICOLL langsam auf eine gute Bildung von Schichten zwischen FICOLL und Medien.
3. Zentrifuge beide Rohre bei 340 × g für 30 min. ohne Bremse und Beschleunigung.
4. Bei der Zentrifugation zu übertragen 7 ml vorgewärmtes PBS auf eine 4-Well-Platte. Planen nanowell Array (hergestellt in PDMS): saubere Boden Glasobjektträger mit Ethanol und oxidieren das PDMS bei hohen RF-Einstellung unter Verwendung von Plasma Oxidierer für 1 min. Dieser Schritt wird sterilize die nanowell Array gleichzeitig Rendern des PDMS hydrophil. Unmittelbar bewegen nanowell Array in der Platte mit PBS.
5. Übertragen Sie die Platte mit einem Biosicherheitswerkbank und saugen überschüssiges PBS. Make 10 ml 1% Noble-Agar durch Zugabe von 100 mg Agarpulver bis 10 ml DI-Wasser und dann Mikrowelle es für 30-45 sek. Anwenden erwärmen 1% Noble-Agar am oberen und unteren Rand der Folie, die das Glas nanowell Array, um das Array zu immobilisieren und warten 10 min für Agar verfestigt enthält. 3 ml PBS und saugen überschüssiges Agar.
6. 3 ml R10 auf der Oberseite des nanowell Array und lassen Sie es für ~ 10 min äquilibrieren.
7. Nach Zentrifugation Ficoll aspirieren 5 ml Medien von der oberen Schicht von jedem Rohr. Achten Sie darauf, um die Schicht, welche die Zellen absaugen.
8. Ernten Sie die Zellen (weiße Schicht) durch die Rückgewinnung von 1-2 ml aus der Schicht zwischen FICOLL und Medien mit P1, 000 Pipette und Umzug in neue sterile konische Röhrchen. Wiederholen Sie dies für beide Arten von Zellen, während Sie sicher, dass Sie Maximeize die Recovery-Zellen.
9. 3 ml vorgewärmten RPMI-PLGH in jedes Röhrchen, durch Pipettieren gründlich mischen und Pellet durch Zentrifugation bei 340 xg für 5 min bei voller Beschleunigung und Bremse.
10. Saugen Sie die überschüssige Medien, 5 ml vorgewärmten RPMI-PLGH in jedes Röhrchen und wiederholen Zentrifugation bei 340 xg für 5 min.
11. Saugen Sie die überschüssige Medien und das Zellpellet in 500 ul R10.
12. Zählen lebender Zellen unter Verwendung des Trypan-Blau-Ausschluss-Methode auf einem Hämozytometer.

5. Zelle Verladung auf Nanowell Array

1. Saugen Sie überschüssige Medien aus nanowell Array und 2 ml frisches R10 über das Array. Saugen wieder, während Sie sicher, dass die Spitze der nanowell Array ist nicht zu nass / trocken, wie es wird die Verteilung von Zellen beeinflussen.
2. Kaution 1 x 10 ⁵ Effektorzellen in 200 ul R10 auf nanowell Arrayoberfläche (Dichte = 5 x 10 ⁵ Zellen / ml).
3. Lassen Zellen für 5 min absetzen und mit einem Standard-Gewebekulturmikroskopeinrichtung Scheck ensicherzustellen, dass die Verteilung der Zellen erwünscht ist. Fügen Sie mehrere Zellen, wenn nötig.
4. Kaution 1 x 10 ⁵ Zielzellen in 200 ul R10 auf nanowell Arrayoberfläche (Dichte = 5 x 10 ⁵ Zellen / ml).
5. Lassen Zellen für 5 min und unter Verwendung eines Standard Gewebekulturmikroskopeinrichtung Überprüfung, um sicherzustellen, dass die Verteilung der Zellen erwünscht ist niederzulassen. Fügen Sie mehrere Zellen, wenn nötig.
6. Spülen nanowell Array vorsichtig mit 2 ml R10 und saugen überschüssige Medien.
7. Bereiten Sie 3 ml vorgewärmten R10 in einem 15 ml sterile konische Röhre. Hinzufügen 3 ul 0,5 mM SYTOX Green Nucleic Acid Stain (Endkonzentration 0,5 uM) und 60 ul Annexin V-Alexa Fluor 647 zu arbeiten herzustellen. Hinzufügen der Gebrauchslösung auf das 4-Well-Platte sorgfältig gleichzeitig dafür, dass Zellen nicht aus den Vertiefungen verdrängt.
8. Bei 37 ° C / 5% CO ₂ für 15 min.

6. Imaging 1

1. Erwerben Sie Bilder des nanowell Array mit einem Fluoreszenz-MikrOSCOPE: In diesem Beispiel verwenden wir ein ZEISS Observer Z-1 Mikroskop mit einem motorisierten Tisch und Lambda-DG4 ausgestattet.
2. Initialisieren Sie die Software und das Mikroskop und überprüfen Sie die Signalstärke auf dem übertragenen Licht und den anderen fluoreszierenden Kanäle. Insgesamt werden fünf Kanäle entsprechend lauten: Durchlicht, Annexin V-647 (Cy5-Filter), CTR (DsRed-Filter), SYTOX Green (FITC-Filter), und Vybrant Violet (DAPI-Filter). Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop, um eine maximale Signal-Rausch-unter Vermeidung Sättigung einzustellen.
3. Set X-und Y-Position für den nanowell Array. Beginnen Prozess, indem die Null-Position und Initialisieren Fokus auf der Mitte der 7 x 7 nanowell Array Block auf der linken oberen Ecke des nanowell array Stempel. Einstellen der x, y-Position mit dem Zentrum jedes Blocks und der z-Wert übereinstimmen, um genau der Schwerpunkt jedes Blockes.
4. Sobald die Position und Fokus ganz eingestellt sind, stellen Sie sicher, Bildaufnahme im linearen Modus gesetzt und Bilder aufzunehmen. Hinweis: Bei Bedarf wiederum auf dem Inkubator und CO ₂ auf dem Mikroskop mindestens 30 min vor dem Experiment.

7. Post-Bildgebung

Übertragen der 4-Well-Platte, welche die nanowell Array in einen Inkubator (37 ° C / 5% CO ₂₎ über 6 Stunden.

8. Imaging 2

Erwerben die Bilder an der zweiten Zeitpunkt, wie in Schritt 6 beschriebenen.

9. Image Analysis

1. Die Belegung von Zellen innerhalb des nanowells wird durch die Verwendung von geeigneten Bildaufteilung Programme (zB ImageJ, bestimmt http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) im Wesentlichen wie zuvor beschrieben ^9,12.
2. Analyse der anfänglichen Menge von Mikroskopaufnahmen (t = 0 h, t ₀₎ wird verwendet, um eine Datenbank der einzelnen nanowells die genau eine Live Zielzelle (identifiziert erzeugenvon CellTracker Red, rot) und keine toten Zellen (gekennzeichnet durch Annexin V-Färbung, grün) [T1T ₀ nanowells].
3. Analyse des zweiten Satzes von Mikroskopaufnahmen (t = 6 h; t ₆₎ wird verwendet, um autonom zu bestimmen eine zweite Datenbank von nanowells enthaltend 1 Zielzelle (rot) _[6 T1T nanowells]. Eine Integritätsprüfung (Datenbankabfrage) implementiert ist, um sicherzustellen, dass alle stromführenden Targets bei t ₀ bis zum Zeitpunkt t ₆ Targets abgestimmt sind, um einen endgültigen Satz übereinstimmender Targets (implementiert als nanowells die T1T ₀ = T1T _6, wie T1match bezeichnet haben) zu erzeugen
4. Die Zahl der Effektorzellen in nanowells wird anhand Vybrant-Färbung bei t ₀ [E1 nanowells]
5. Eine Datenbankabfrage wird implementiert, um nanowells mit einzelnen Effektoren identifizieren einzelne Ziele (definiert als nanowells, die E1-und _T1-Spiel haben, wie E1T1 bezeichnet) coinkubiert
6. Effektor-induzierte Apoptose wird durch i erzielte dentifying Ziele, die Annexin V sind bei t ₀ und Annexin V positiv t ₄ (E1T1 mit Annexin V Ziel Färbung bei t ₆₎ negativ.

10. Optional Zeitraffer-Imaging des Tötens mit Nikons BioStation IM

1. Nehmen Sie eine Petrischale mit Deckglas unten und schneiden Sie ein kleines Stück des nanowell Array-Chip (hergestellt bei Schritt 5), die genau auf dem Deckglas passen. Stellen Sie sicher, dass der Chip feucht bleibt während des Schneidens.
2. Mix 1 x 10 ⁶ Ziele und 1 x 10 ⁶ T-Zellen in 100 ul Medien und pipettieren es auf dem Deckglas.
3. Lassen Sie etwa 15-30 min zu lassen die Zellen zu begleichen.
4. Schnell kehren die kleinen nanowell Array-Chip und legen Sie es auf dem Deckglas.
5. Um sicherzustellen, dass der Chip nicht in der Lage, während der Bildgebung Ort zu bewegen ein oder zwei 20mm x 20mm Deckgläser auf die Oberseite des Chips. Druck ausüben leise zu den Chip an der Unterseite der Schale drücken.

Zelt "> Hinweis: Die nanowell Array-Chip Hintern ist zu dick für hochauflösende Bildgebung und hat daher auf den Kopf gestellt werden Während dieser, viele der Zellen ausgewaschen werden Da dies nicht leicht kontrollierten Zellzahlen werden in Schritt 9.2.. und Inkubationszeit in Schritt 9,3 müssen optimiert werden.

Ergebnisse

Ein Beispiel für die Anwendung des High-Throughput-Assays cytolytischen ist in Abbildung 2 gezeigt. Kurz gesagt, markierten CD19-spezifische CAR ⁺ T-Zellen wurden mit markierten Maus EL4-Zielzellen in den einzelnen Wells einer nanowell Array (Sektionen 1-5) coinkubiert. Ein erstes Bild wurde auf dem automatischen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen, um die Belegung (Effektoren und / oder Targets) jedes einzelnen nanowell auf dem Array (Abschnitt 6) identifizieren. Bildverarbeitung wurde verwend...

Diskussion

Wir haben das Protokoll für ein Hochdurchsatz-Single-Cell-Assay cytolytischen durch Co-Inkubation von Effektoren und Targets in Arrays von nanowells (Abbildung 1) aktiviert skizziert. Neben Durchsatz ein großer Vorteil des Verfahrens ist die Möglichkeit, Effektorzellen-vermittelten Zytotoxizität gegen gewünschten Zielzellen ohne Zielzelle Engineering Dies wiederum erlaubt die Verwendung von autologen oder Matched / primären Tumorzellen als Zielzellen zu überwachen. Die räumliche Begrenzung ermö...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz / Material	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
RPMI-1640 w / o L-Glutamin	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10.000 IU Penicillin 10.000 pg / ml Streptomycin
L-Glutamin	Cellgro	25-005-CI	200 mM Lösung
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fötales Rinderserum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot geprüft
Handy Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 ug
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX grünen Nukleinsäurefärbemittel	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 ul
Dulbecco PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble-Agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypanblau	Sigma Aldrich	T8154	0,4% flüssigem, sterilfiltriert
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Helle Linie
4-Well-Platte	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Reiniger	Harrick Plasma	PDC-32G	Grundlegende Plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluoreszenzmikroskop (funktioniert mit den drei Teilen unten)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter-Controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-Breitband-Wavelength-Umschalter
Hamamatsu EM-CCD-Kamera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Mikroskop-Kamera
15 ml konischen Röhrchen	BD Falcon	352097
50 ml konischen Röhrchen	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glasboden Kulturschale	MatTek Konzern	P35G-0	35 mm Petrischale, 10 mm Mikrotiter