T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Özet

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

Özet

Kanser immünoterapi tümörleri hedef ve yok etmek için bağışıklık yanıtının özgüllüğü koşum olabilir. Genetik bir kimerik antijen reseptör (SYR) ifade etmek için değiştirilmiş T hücrelerinin evlatlık transferi dayalı evlatlık hücre tedavisi (ACT) klinik çalışmalarda ^1-4 önemli olacağını göstermiştir. Orada CAR kullanarak ⁺ T hücreleri olmayan MHC kısıtlı antijenleri hedeflemek ve konak içinde homing ve sebat optimum yaşam için T hücreleri, daha işlevsel yeteneği dahil olmak üzere kanser tedavisi için çeşitli avantajları vardır; ve nihayet CAR apoptoza teşvik etmek ⁺ ana toksisite ⁵ durumunda T hücreleridir.

CAR optimum işlevlerini tasvir ⁺ klinik fayda ile ilişkili T hücrelerinin klinik çalışmaların yeni nesil tasarımı için önemlidir. Multiphoton mikroskopi gibi canlı hayvan görüntülemede son gelişmeler, immün hücre fonksiyonunun çalışma devrim var in vivo ^6,7. Bu in vivo çalışmalar, klinik çalışmalarda T-hücresi bazlı ACT T-hücre fonksiyonlarının anlaşılmasını ederken de kullanarak, önceden infüzyon klinik etkinlik sonrası infüzyon ile T-hücresi preparatlar moleküler ve fonksiyonel özelliği bağlamak için ihtiyaç doğurur sitotoksisite ve sitokin salgılanması gibi T hücre fonksiyonlarının izlenmesi vitro tayinlerde. Standart akım sitometri dayalı testler tek hücre düzeyinde T hücre popülasyonları genel işleyişini belirlemek ancak bu konjugat oluşumu ve yaşam süreleri veya birden fazla hedeflere ⁸ öldürmek için aynı hücre yeteneği izlenmesi için uygun olmadığını geliştirilmiştir.

Polidimetilsiloksan (PDMS) gibi biyouyumlu polimerler dizayn Microfabricated diziler mekansal etkileyiciler ve küçük hacimleri ⁹ hedeflere sınırlandırmak için özellikle çekici bir yöntemdir. Otomatik time-lapse mikroskopi, tho ile birlikteefektör-hedef etkileşimlerin usands bir nanowell dizi görüntüleme bireysel kuyular tarafından aynı anda izlenebilir. Burada genel olarak T hücrelerinin sitotoksik özelliğe incelemek için uygulanabilir ve tek hücre seviyesinde T-hücre aracılı sitotoksisite izlenmesi için bir yüksek hacimli yöntem sunulmaktadır.

Protokol

1. Reaktiflerin Hazırlanması

1. 500 ml RPMI-1640 ve 5 ml karıştırma ile RPMI-PLGH hazırlanması Penisilin-Streptomisin, L-glutamin, HEPES ve çözelti her biri.
2. % 10 fetal bovin serumu (FBS) ile RPMI-PLGH karıştırma ile R10 çözeltisi hazırlayın. FBS ile ilave 30 dakika boyunca 56 ° C'de önceden de ısı ile inaktive edilir.
3. 37 ön ısıtma ° C RPMI-PLGH, steril konik tüpler içinde R10 15 ml PBS ve 15 ml ve 50 ml.
4. PDMS içinde nanowells diziler İmalatı: silikon ana fotolitografi, esas olarak daha önce anlatılan ¹⁰ kullanılarak imal edilir. İyice bir plastik bıçak kullanarak Sylgard 184 elastomer kiti temel ve bir tek fincan 10:01 ağırlık oranında sertleştirici karıştırın. 1 saat boyunca bir vakum odasında Degas karışımı. , Nanowell dizi üzerine karışımı dökün bir cam slayt ile mühür ve 30 dakika bekletin. ° C de 2 saat süre ile 80 olarak ayarlanmış, bir fırın içine montaj aktarın ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında soğumaya bırakılır. Elastomer fark olacakBu dönemde ve irade cam slayt bağ sırasında e. PDMS nanowell dizi içeren cam slayt dikkatlice bant ile kaplanmış ve ileride kullanmak kadar saklanır, silikon ana kaldırdı edilir.

2. Hedef Hücre (T) Etiketleme

1. 5 dakika boyunca 340 x g'de santrifüj ile bir steril 15 ml konik bir tüp içinde bir hemasitometre ile pelet hücreleri kullanılarak hücre kültürü ile 5 milyon hedef hücreleri sayın. Hücre kültürü 5 ml toplam hacmi (yoğunluk = 1 milyon / ml) içinde bir önceki güne bölmek ve T-25 şişesi (VWR) içinde yetiştirilir. Hemasitometre kullanarak hücre sayımı için Protokoller önce ¹¹ ayrıntılı olarak tarif edilmiştir
2. Ortam yaklaşık 50 ul geride bırakarak aşırı medya aspire.
3. (Son konsantrasyonu 2.5 mcM) 150 ul RPMI-PLGH 0.5 ul TO stok (1 mM) karıştırılarak Hücre Tracker Kırmızı (TO) bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Hedef hücrelere çalışma solüsyonu 150 ul ekleyin ve bir P200 pipet kullanarak iyice karıştırın.Alternatif olarak, PKH 26 (2 uM nihai konsantrasyon) imalatçının talimatlarına göre etiketli hedef hücreler olarak da kullanılabilir.
4. 20 dk için 37 ° C _/% 5 CO2 inkübe edin.

3. Efektör (E) Hücre Etiketleme

1. 5 dakika boyunca 340 x g'de santrifüj ile bir steril 15 ml konik bir tüp içinde bir hemasitometre ile pelet hücreleri kullanılarak hücre kültürü ile 5 milyon efektör hücreleri sayın.
2. Aşırı medya aspire
3. R10 medya 1 ml (5 uM nihai konsantrasyon) ile 5 mM stok Vybrant Violet 1 ul ilave edilerek Vybrant DyeCycleViolet Leke çözeltisi bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Hücrelere çalışma çözeltisi ekleyin ve P200 pipet kullanarak tekrar süspansiyon haline getirin. Alternatif olarak, PKH 67 (2 uM nihai konsantrasyon) imalatçının talimatlarına göre etiketli hedef hücreler olarak da kullanılabilir. PKH 67 kullanılırsa, bunlar aynı flüoresan kanalı olması nedeniyle, daha sonra SYTOX Green kullanılmamalıdır. Apoptotik hedeflerin numaralandırma sadece A kullanılarak yapılırBu durumda nnexinV boyama.
   Not: time-lapse değil nokta ölçümler yapıyorsanız, Vybrant Violet gibi UV boyalar kaçınılmalıdır.
4. 20 dk için 37 ° C _/% 5 CO2 inkübe edin.

4. Bir Yoğunluk Gradient Kullanarak Canlı ve Ölü Hücrelerin Ayrılması

1. Sırasıyla, hedef ve efektör hücrelere 6.8 ml ve RPMI-PLGH 6.0 ml ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
2. Ficoll-Paque Artı hedef ve efektör hücreler içeren her konik tüp alt tabakası 3,5 ml. Katman Ficoll yavaş yavaş Ficoll ve medya arasındaki tabaka iyi oluşumunu sağlamak için.
3. 30 dakika boyunca 340 xg'de her iki tüp santrifüjleyin. Hiçbir fren ve hızlanma ile.
4. Santrifüj sırasında, bir 4-iyi levhaya önceden ısıtılmış PBS 7 ml aktarın. Nanowell array (PDMS fabrikasyon) hazırlayın: etanol ile cam slayt temiz alt ve 1 dakika boyunca plazma oksitleyici kullanarak yüksek RF ayarda PDMS okside eder. Bu adım adım olacak steAyrıca hidrofilik PDMS sunarken nanowell dizi rilize. Hemen PBS içeren plaka içine nanowell dizi taşıyın.
5. Bir biyogüvenlik kabine plaka aktarın ve aşırı PBS aspirat. 30-45 saniye sonra, 10 ml distile su ve mikrodalga buna 100 mg agar tozu ilave edilerek 10 ml% 1 agar asil edin. Dizi hareketsiz ve katılaşmaya agar için 10 dakika beklemek zorunda nanowell dizisi içeren cam slayt üst ve alt kenarda 1% asil agar sıcak uygulayın. 3 ml PBS ve aspirat aşırı agar ekleyin.
6. Nanowell dizinin üst üzerine R10, 3 ml ekleyin ve yaklaşık 10 dakika için denge sağlar.
7. Santrifüj Ficoll takiben, her tüp üst tabakasından 5 ml medya aspire. Hücreleri içeren katmanı aspire için dikkatli olun.
8. P1, 000 pipet ve yeni steril konik tüpler için hamle ile Ficoll ve medya arasındaki tabakası 1-2 ml kurtarma tarafından hücreleri (beyaz tabaka) Harvest. Size maxim emin yaparken hücrelerin iki seti için bu işlemi tekrarlayıniyileşme hücreleri tanımlamak için analiz edildi.
9. Tam hızlanma ve fren üzerinde 5 dakika boyunca 340 x g'de santrifüj ile pelet ve pipetleme ile her bir tüp, karışım için önceden ısıtılmış RPMI-PLGH 3 ml ilave edilir.
10. Fazla ortamı aspire, her bir tüp için önceden ısıtılmış RPMI-PLGH, 5 ml ilave edin ve 5 dakika boyunca 340 x g'de santrifüj tekrarlayın.
11. Fazla ortamı aspire ve R10, 500 ul hücre pelet tekrar süspansiyon.
12. Bir hemasitometre üzerine Tripan mavi dışlama yöntemi kullanılarak canlı hücreleri saymak.

5. Nanowell Dizi üzerine Hücre Yükleniyor

1. Nanowell diziden aşırı medya aspire ve dizi boyunca taze R10 2 ml ekleyin. Nanowell dizinin üst bu hücrelerin dağılımını etkileyecek gibi çok ıslak / kuru değil emin yaparken tekrar aspire.
2. Nanowell dizi yüzey üzerine R10 200 ul içinde depolama 1 x 10 ⁵ efektör hücreler (yoğunluk = 5 x 10 ⁵ hücre / ml).
3. Hücreleri 5 dakika boyunca yerleşmek ve en standart bir doku kültürü mikroskobu çek kullanarak Lethücrelerinin dağılımını arzu edilir olduğuna dikkat edin. Gerekirse daha fazla hücre ekleyin.
4. Depo 1 x 10 nanowell dizi yüzeyde 200 ul R10 ⁵ hedef hücreler (yoğunluk = 5 x 10 ⁵ hücre / ml).
5. Hücreler 5 dakika ve hücrelerin dağılımı tercih edilir olduğundan emin olmak için, standart bir doku kültürü mikroskop kullanılarak kontrol dinlendiriniz. Gerekirse daha fazla hücre ekleyin.
6. 2 ml R10 ve aspirat fazla medya ile dikkatlice nanowell dizi durulayın.
7. 15 ml steril konik tüp içinde 3 ml önceden ısıtılmış R10 hazırlayın. Leke 0.5mM SYTOX Green nükleik asit 3 ul (0.5 uM son konsantrasyon) ve çalışma çözeltisi hazırlamak için Annexin V-Alexa Fluor 647 60 ul ekle. Hücreleri kuyulardan yerinden değil emin yaparken dikkatli 4-plaka üzerine çalışma çözüm ekleyin.
8. 15 dk için 37 ° C _/% 5 CO2 inkübe edin.

6. Görüntüleme 1

1. Bir floresan MICR kullanarak nanowell dizinin görüntüleri Edinmeoscope: Bu örnekte, bir motorlu sahne ve Lambda-DG4 sahip Z-1 mikroskop ZEISS Gözlemci kullanın.
2. Yazılım ve mikroskop başlatılamıyor ve iletilen ışık ve diğer floresan kanallarda sinyal yoğunluğu kontrol edin. Genel olarak, karşılık gelen beş kanal olacak: iletilen ışık, Annexin V-647 (Cy5 filtresi), TO (DsRed filtresi), SYTOX Yeşil (FITC filtresi) ve Vybrant Violet (DAPI filtre). Doyuma kaçınarak gürültü maksimum sinyal sağlamak için kurulum mikroskop emin olun.
3. X ve nanowell dizisi için Y konumu ayarlayın. Sıfır konumu ayarlama ve nanowell dizi damga sol üst köşesinde üzerine 7 x 7 nanowell dizinin blok merkezine odaklanmak başlatarak süreci başlar. Doğru her blok odağı yansıtmak için her bloğun merkezi ve z-değeri ile çakışacak şekilde x, y konumlarını ayarlayın.
4. Pozisyonu ve odak tüm set olduktan sonra, lineer modda görüntü toplama ayarlamak ve görüntüler elde etmek için emin olun. Not Trong: mikroskop inkübatör ve CO ₂ gerekli dönüş en az 30 dakika deney öncesinde ise.

7. Post-görüntüleme

6 saat süreyle bir inkübatör (37 ° C /% 5 _CO2) içine nanowell dizi içeren 4-plaka aktarın.

8. Görüntüleme 2

6. Adım de tarif edildiği gibi zaman noktası saniyede görüntü elde edin.

9. Görüntü Analizi

1. Nanowells içindeki hücrelerin fazla uygun görüntü bölütleme programları kullanımı (örneğin ImageJ ile tespit edilir http://rsbweb.nih.gov/ij/ ), esas olarak daha önce tarif ^9,12.
2. Mikroskop (t = 0 saat, t ₀₎ ilk set analizi tam olarak bir hedef hücreye canlı (tanımlanır içeren bireysel nanowells bir veri tabanı oluşturmak için kullanılanRed CellTracker, kırmızı) ve ölü hücreleri (Annexin V boyası ile tanımlanır, yeşil) [T1T ₀ nanowells].
3. Mikroskop (t = 6 saatte, t ₆₎ ikinci küme analizi. Bağımsız olarak 1, hedef hücre (kırmızı) [T1T ₆ nanowells] nanowells ihtiva eden ikinci bir veri tabanı belirlemek için kullanılır Bir bütünlük denetimi (veritabanı sorgu) t ₀ bütün canlı hedefler eşleşen hedefleri bir final seti (T1T ₀ T1match olarak belirlenmiş = T1T _6, var nanowells olarak uygulanan) üretmek için t ₆ hedeflere uyumlu olmasını sağlamak için uygulanan
4. Nanowells efektör hücrelerin sayısı t, ₀ [E1 nanowells] az Vybrant mor leke kullanılarak belirlenir
5. Bir veritabanı sorgu (E1T1 olarak belirlenmiş E1 ve T1 _maç var nanowells olarak tanımlanan), tek hedefleri ile birlikte kuluçkaya tek etkileyiciler içeren nanowells belirlemek için uygulanmaktadır
6. Efektör apoptosis i tarafından atılırsa t ₀ ve pozitif Annexin V t ₄ de (t ₆ Annexin V hedef boyama ile E1T1) negatif Annexin V hedefleri dentifying.

10. Nikon'un BioStation IM kullanma Öldürme Opsiyonel Time-lapse Görüntüleme

1. Lamel dipli bir Petri kabı alın ve tam olarak lamel uyacaktır nanowell dizi çipi küçük bir parça (Adım 5 hazırlanır) kesip. Kesim sırasında talaş ıslak kalır emin olun.
2. Karışım 1 x 10 ⁶ hedefler ve 100 ul ortam içinde 1 x 10 ⁶ T hücreleri ve lamel üzerine bu pipetle.
3. Yaklaşık 15-30 dk hücreleri yerleşmek izin ver.
4. Hızla küçük nanowell dizi çip ters ve lamel üzerine yerleştirin.
5. Çip çip üstüne görüntüleme, yer içinde bir ya da iki adet 20mm x 20mm lamelleri taşımak mümkün olmayacaktır emin olmak için. Çanak altına çip itmek usulca baskı uygulayın.

çadır "> Not: nanowell dizi yongasının altına yüksek çözünürlüklü görüntüleme için çok kalın ve bu yüzden altüst edilmesi gerekir Bu işlem sırasında hücrelerin birçok yıkanır Bu Adım 9.2 'de kolayca kontrollü, hücre sayıları olamayacaktır.. ve Basamak 9.3 'de inkübasyon süresi optimize edilmesi gerekmektedir.

Sonuçlar

Yüksek verimli sitolitik testinin uygulamasının bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Kısaca, CD19 spesifik olarak etiketlenmiş ARAÇ ⁺ T hücreleri bir nanowell dizi bireysel haznesi (Bölüm 1-5) olarak etiketli fare hedef EL4 hücreleri ile birlikte inkübe edildi. Bir ilk görüntü dizisi (Bölüm 6) ilgili her nanowell arasında doluluk (etkileyiciler ve / veya hedefler) tanımlamak için otomatik floresan mikroskop kaydedildi. Görüntü işleme tam olarak tek bir hedef ...

Tartışmalar

Biz nanowells diziler (Şekil 1) etkileyiciler ve hedefleri ko-kuluçka yoluyla etkin bir high-throughput tek hücreli sitolitik tahlil için protokol ana hatlarıyla. Verim ek olarak, tekniğin büyük bir avantaj da hedef hücreleri otolog ya da primer / eşlemeli tümör hücrelerinin kullanımına izin verir hedef hücre mühendisliği için gerek kalmadan istenen hedef hücrelerine karşı sitotoksisite efektör-aracılı izlemek için yeteneğidir. Uzaysal kapatılma tahlil ⁹ sonunda ge...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Malzeme Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
RPMI-1640 w / o L-glutamin	Cellgro	15-040-CV
Penisilin-streptomisin	Cellgro	30-002-CI	10.000 IU Penisilin 10.000 mg / ml streptomisin
L-glutamin	Cellgro	25-005-CI	200 mM çözelti
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovin serumu (FBS)	Atlanta Biyolojik	S11150	Lot test
Hücre Tracker Kırmızı Leke	Invitrogen	C34552	50 mikrogram
Vybrant DyeCycle Violet Leke	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX yeşil Nükleik Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 ul
Dulbecco PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble Agar	Difco	2M220	100 g
Tripan Mavi	Sigma Aldrich	T8154	% 0.4 sıvı steril filtre
Hemasitometre	Hausser Scientifics	1492	Parlak hattı
4-plaka	Thermo Fisher	167603
Harrick Plazma Temizleyici	Harrick Plazma	PDC-32G	Temel plazma temizleyici
Observer.Z1	ZEISS		Floresan mikroskobu (aşağıdaki üç bölümden ile çalışır)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filtre denetleyici
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra Yüksek Hız Dalgaboyu anahtarlayıcı
Hamamatsu EM-CCD Kamera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Mikroskop kamera
15 ml konik tüp	BD Falcon	352097
50 ml konik bir tüp	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc	Biostation IM
Cam alt kültür çanak	Mattek Corporation,	P35G-0	35 mm petri, 10 mm kuyucuk