Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Resumo

Descrevemos uma única célula ensaio de elevado débito para medir a citotoxicidade de células T, quando incubado com as células-alvo tumorais. Este método emprega uma matriz elastomérica denso, de sub-nanolitro poços (~ 100000 poços matriz /) para confinar espacialmente as células T e as células alvo em proporções definidas e está acoplado a microscopia de fluorescência para monitorizar alvo efetuador conjugação e apoptose subsequente.

Resumo

Imunoterapia do cancro pode aproveitar a especificidade da resposta imunitária para alvejar e eliminar tumores. Terapia celular adoptiva (ACT) com base na transferência adoptiva de células T geneticamente modificadas para expressar um receptor de antigénio quimérico (CAR) se mostrou promissora em ensaios clínicos ^1-4. Existem várias vantagens de usar CAR ⁺ células T para o tratamento de cancros, incluindo a capacidade para alvejar os antigénios do MHC não-limitados e para funcionalizar as células T para a sobrevivência óptima, homing e persistência no interior do hospedeiro, e, finalmente, para induzir a apoptose de CAR ⁺ As células T, em caso de toxicidade central ^5.

Delineando as funções ideais de CAR ⁺ células T associados com o benefício clínico é essencial para projetar a próxima geração de ensaios clínicos. Os recentes avanços na imagem animal vivo como microscopia multifotônica revolucionaram o estudo da função de células imunes in vivo ^6,7. Embora estes estudos tenham avançado a nossa compreensão da função das células T in vivo, de células T ACT baseada em ensaios clínicos exige a necessidade de ligar as características moleculares e funcionais de células T preparações pré-infusão com eficácia clínica pós-perfusão, utilizando-se, em Os ensaios in vitro de células T de monitorização funções como, citotoxicidade e a secreção de citocinas. Padrão de citometria de fluxo-ensaios baseados foram desenvolvidos para determinar o funcionamento geral das populações de células T ao nível de uma única célula, mas estes não são adequados para a monitorização e a formação de conjugado vidas ou a capacidade da mesma célula para matar alvos múltiplos ^8.

Matrizes microfabricated projetados em polímeros biocompatíveis como polidimetilsiloxano (PDMS) é um método particularmente atraente para confinar espacialmente efetores e metas em pequenos volumes ^9. Em combinação com a microscopia de fluorescência automatizado lapso de tempo, thousands de-alvo efetor interações podem ser monitoradas simultaneamente por poços individuais de imagem de uma matriz nanowell. Apresentamos aqui um método de alto rendimento para a monitorização de células T da citotoxicidade mediada ao nível de uma única célula que pode ser amplamente aplicado para estudar a função de células T citolíticas.

Protocolo

1. Preparação de reagentes

1. Prepare RPMI-PLGH misturando 500 ml ml de RPMI-1640 e 5 de cada um de penicilina-estreptomicina, L-glutamina, HEPES e solução.
2. Prepare R10 solução misturando RPMI-PLGH com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS). O FBS inactivado pelo calor é a 56 ° C durante 30 min antes da adição.
3. Pré-aquecido a 37 ° C de 50 ml de RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, e 15 de R10 em tubos cónicos estéreis.
4. Fabricação de matrizes de nanowells em PDMS: O mestre de silício é fabricado usando fotolitografia, essencialmente como descrito anteriormente ^10. Misturar cuidadosamente a base de Sylgard 184 kit elastómero e agente de cura de peso de 10:1 em um copo descartável usando uma faca de plástico. Desgaseificar a mistura, em uma câmara de vácuo durante 1 hr. Despeje a mistura para a matriz nanowell, vedar com uma lâmina de vidro e deixar repousar durante 30 minutos. Transferir o conjunto dentro de um forno ajustado para 80 ° C durante 2 h e deixar arrefecer à temperatura ambiente durante 1 hr. O elastômero vontade atue durante este período e vontade vínculo com a lâmina de vidro. A lâmina de vidro que contém a matriz de PDMS nanowell é cuidadosamente levantada do mestre de silício, cobertos com fita adesiva Scotch e armazenadas até utilização futura.

2. Célula alvo Labeling (T)

1. Conte 5.000.000 células alvo a partir de cultura de células utilizando um hemocitómetro e sedimentar as células em um tubo estéril de 15 mL cónico por centrifugação a 340 xg durante 5 min. A cultura de células é dividida no dia anterior em 5 ml de volume total (densidade = 1 milhão / ml) e cultivadas em frasco T-25 (VWR). Protocolos para contagem de células utilizando um hemocitómetro foram descritos em detalhe anteriormente ¹¹
2. Aspirar a mídia em excesso, deixando para trás cerca de 50 ul de mídia.
3. Preparar uma solução de trabalho de Célula tracker Red (CTR) através da mistura de 0,5 ul de estoque CTR (1 mM) a 150 ul de meio RPMI-PLGH (concentração final 2,5 uM). Adicionar 150 ul da solução de trabalho para as células alvo e misturar cuidadosamente com uma pipeta de P200.Alternativamente, PKH 26 (concentração final de 2 mM) pode ser usada como células alvo de etiquetas de acordo com as instruções do fabricante.
4. Incubar a 37 ° C / _5% de CO2 durante 20 min.

3. Rotulagem de células efetoras (E)

1. Conte 5.000.000 células efectoras provenientes da cultura de células utilizando um hemocitómetro e sedimentar as células em um tubo estéril de 15 mL cónico por centrifugação a 340 xg durante 5 min.
2. Aspirar excesso de mídia
3. Preparar uma solução de trabalho de solução DyeCycleViolet Vybrant Stain pela adição de 1 uL de 5 mM estoque Violet Vybrant a 1 ml de meio R10 (concentração final de 5 uM). Adicionar a solução de trabalho para as células e ressuspender P200 usando uma pipeta. Alternativamente, PKH 67 (concentração final de 2 mM) pode ser usada como células alvo de etiquetas de acordo com as instruções do fabricante. Se PKH 67 é utilizado, em seguida, SYTOX Green não deve ser utilizada uma vez que eles estão no mesmo canal de fluorescência. A enumeração de metas apoptóticas é feito exclusivamente através de umnnexinV coloração no presente caso.
   Nota: Se executar lapso de tempo e medições não terminais, corantes UV como Violeta Vybrant deve ser evitado.
4. Incubar a 37 ° C / _5% de CO2 durante 20 min.

4. Separação de células vivas e mortas Usando um gradiente de densidade

1. Adicionar 6,8 ml e 6,0 ml de meio RPMI-PLGH ao alvo e células efectoras, respectivamente, e misture pipetando para cima e para baixo suavemente.
2. Camada ml 3,5 de Ficoll-Paque Plus a parte inferior de cada tubo cónico contendo alvo e células efectoras. FICOLL camada lentamente para garantir boa formação de camadas entre FICOLL e mídia.
3. Centrifugar os tubos a 340 xg durante 30 min. sem freio e aceleração.
4. Durante a centrifugação, transferir 7 mL de PBS pré-aquecido a uma placa de quatro poços. Prepare nanowell array (fabricado em PDMS): inferior de lâmina de vidro limpa com etanol e oxidar o PDMS no ajuste alto RF usando plasma oxidante durante 1 min. Esta etapa irá sterilize matriz nanowell enquanto também tornar o PDMS hidrofílico. Imediatamente mover a matriz nanowell na placa contendo PBS.
5. Transfira a placa para uma cabine de segurança biológica e aspirar excesso de PBS. Fazer 10 ml de ágar a 1% por adição de 100 nobre pó de ágar a 10 mg de água DI ml e, em seguida, ela microondas por 30-45 segundos. Aplicar aquecer a 1% de ágar nobre na borda superior e inferior da lâmina de vidro que contém a matriz nanowell para imobilizar a matriz e esperar 10 minutos para agar solidificar. Adicionar 3 ml de PBS e agar excesso aspirado.
6. Adicionar 3 ml de R10 para o topo da matriz e deixar nanowell equilibrar durante ~ 10 min.
7. Subsequente à centrifugação de Ficoll, aspirar 5 ml de meio a partir da camada superior de cada tubo. Tenha cuidado para não aspirar a camada que contém as células.
8. Colher as células (camada branca), recuperando ml 1-2 da camada entre FICOLL e mídia com P1, 000 pipeta e mudança para novos tubos cônicos estéreis. Repita este procedimento para os dois conjuntos de células ao se certificar de que você máximaize das células de recuperação.
9. Adicionar 3 ml de RPMI pré-aquecido PLGH-se a cada tubo da mistura, por pipetagem e sedimento por centrifugação a 340 xg durante 5 min em plena aceleração e de travagem.
10. Aspirar a mídia em excesso, adicionam-se 5 ml de meio RPMI pré-aquecido PLGH-se a cada tubo e repetir a centrifugação a 340 xg durante 5 min.
11. Aspirar o excesso de media e ressuspender o sedimento de células em 500 uL de R10.
12. Contar as células vivas utilizando o método de exclusão de azul de tripano em um hemacitómetro.

5. Carregando célula para matriz Nanowell

1. Aspirar o excesso de mídia matriz nanowell e adicionar 2 ml de R10 fresco através da matriz. Aspirar novamente enquanto certificando-se o topo da matriz nanowell não é muito úmido / seco como ele vai afetar a distribuição de células.
2. Depósito de 1 x 10 ⁵ células efectoras em 200 ul de R10 para nanowell superfície da matriz (densidade = 5 x 10 ⁵ células / ml).
3. Deixe as células assentar durante 5 min e usando um padrão de tecido de verificação microscópio cultura de ense que a distribuição das células é desejável. Adicionar mais células, se necessário.
4. Depósito 1 x 10 ⁵ células-alvo em 200 ul de R10 nanowell superfície da matriz (densidade = 5 x 10 ⁵ células / ml).
5. Deixe as células assentar durante 5 min e usando um padrão de tecido de verificação microscópio cultura para assegurar que a distribuição das células é desejável. Adicionar mais células, se necessário.
6. Lavar cuidadosamente com matriz nanowell 2 ml R10 e aspirado excesso de mídia.
7. Preparar 3 ml R10 pré-aquecido num tubo de 15 ml estéril cónico. Adiciona-se 3 uL de 0,5 mM de ácido nucleico SYTOX Verde Stain (concentração final 0,5 uM) e 60 jil de anexina V-Alexa Fluor 647 para preparar a solução de trabalho. Adicionar a solução de trabalho para a placa de quatro poços cuidadosamente assegurando ao mesmo tempo que as células não são deslocadas a partir das cavidades.
8. Incubar a 37 ° C / _5% de CO2 durante 15 min.

6. Imagem 1

1. Adquirir imagens da matriz nanowell usando um micr fluorescênciaoscope: Neste exemplo, usamos um Observer ZEISS Z-1 microscópio equipado com um palco motorizado e Lambda-DG4.
2. Inicializar o software e o microscópio e verificar a intensidade do sinal na luz transmitida e os outros canais fluorescentes. De modo geral, haverá cinco canais correspondentes a: luz transmitida, anexina V-647 (Cy5 filtro), CTR (DsRed filtro), SYTOX Green (FITC filtro), e Vybrant Violet (DAPI filtro). Certifique-se que o microscópio que configurar para garantir sinal máximo de ruído, evitando a saturação.
3. Definir X e Y posição para a matriz nanowell. Iniciar o processo, definindo a posição zero ea inicialização de foco no centro de 7 x 7 bloco matriz nanowell no canto superior esquerdo do selo matriz nanowell. Definir as posições x, y, para coincidir com o centro de cada bloco e o valor de z para reflectir com precisão a focagem em cada bloco.
4. Uma vez que a posição eo foco está tudo pronto, certifique-se de definir a aquisição de imagens em modo linear e adquirir imagens. Nota: Se for necessário, na incubadora de CO ₂ e sobre o microscópio, pelo menos, 30 minutos antes da experiência.

7. Pós-imagem

Transferir a placa 4 poços contendo a matriz nanowell numa incubadora (37 ° C / 5% CO ₂₎ durante 6 horas.

8. Imagem 2

Adquirir as imagens no segundo ponto do tempo, conforme descrito no Passo 6.

9. Análise de Imagem

1. A ocupação de células dentro da nanowells é determinada através da utilização de programas apropriados de segmentação de imagem (por exemplo, ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) essencialmente como descrito anteriormente ^9,12.
2. A análise do conjunto inicial de imagens de microscópio (t = 0 horas, t ₀₎ é utilizado para gerar um banco de dados das nanowells individuais contendo exactamente uma célula alvo vivo (identificadopor CellTracker Red, vermelho) e sem células mortas (identificados por anexina V coloração, verde) _[0 T1t nanowells].
3. Análise de o segundo conjunto de imagens de microscópio (t = 6 horas; t ₆₎ é utilizado para determinar de forma independente um segundo banco de dados de nanowells contendo uma célula alvo (vermelho) _[6 T1t nanowells]. Uma verificação de integridade (consulta de banco de dados) é implementada para assegurar que todos os alvos vivos em t ₀ são compatíveis com alvos em t ₆ para produzir um conjunto final de metas combinadas (implementado como nanowells que têm T1t ₀ = T1t _6, designado como T1match)
4. O número de células efectoras em nanowells é determinada utilizando coloração violeta Vybrant em t ₀ [E1 nanowells]
5. Uma consulta de base de dados é implementado para identificar nanowells contendo efectores individuais co-incubado com alvos individuais (definida como nanowells que têm _{correspondência} E1 e T1, designados como E1T1)
6. Apoptose induzida efetor é marcado por i dentifying alvos que estão anexina V negativa em t ₀ e V Anexina positivo em t ₄ (E1T1 com anexina V na coloração de alvo t _6).

10. Imagem Time-lapse opcional de Matar Usando BioStation Nikon IM

1. Pegue uma placa de Petri com o fundo lamela e cortar um pequeno pedaço do chip matriz nanowell (preparado na Etapa 5) que vai caber exatamente na lamela. Certifique-se de que o chip fica molhada durante o corte.
2. Misturar 1 x 10 ⁶ alvos e 1 x 10 ⁶ células T em 100 ul de meios de comunicação, e pipeta-lo para a lamela.
3. Permitir que cerca de 15-30 minutos para permitir que as células resolver.
4. Rapidamente inverter o chip matriz pequena nanowell e colocá-lo sobre a lamela.
5. A fim de assegurar que o chip não será capaz de se mover durante a imagiologia lugar, um ou dois 20 milímetros x 20 milímetros lamelas sobre a parte superior do chip. Aplicar uma pressão suave para empurrar o chip para o fundo do prato.

tenda "> Nota: bottom O chip matriz nanowell é muito grande para imagens de alta resolução e, portanto, tem que ser virado de cabeça para baixo Durante este, muitas das células são lavadas para fora Uma vez que este não pode ser facilmente controladas, o número de células no Passo 9.2.. e tempo de incubação na etapa 9,3 têm de ser optimizados.

Resultados

Um exemplo da aplicação do ensaio de elevado débito citolítica é demonstrado na Figura 2. Resumidamente, CD19 marcado específico CAR ⁺ células T foram co-incubadas com células EL4 marcadas rato alvo nos poços individuais de uma matriz nanowell (secções 1-5). Uma imagem inicial foi gravado no microscópio fluorescente automatizada para identificar a ocupação (efectores e / ou alvos) de cada nanowell único na matriz (Secção 6). Processamento de imagem foi usada para identificar ...

Discussão

Temos descrito o protocolo para um ensaio de elevado rendimento de célula única citolítica activado através de co-incubação de efectores e alvos em matrizes de nanowells (Figura 1). Além disso a taxa de transferência de uma grande vantagem da técnica é a capacidade de monitorizar efectora mediada por citotoxicidade contra células alvo desejadas, sem a necessidade para a engenharia de células alvo, que por sua vez permite o uso de autólogos ou matched / primário de células tumorais, como a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
RPMI-1640 w / o L-glutamina	Cellgro	15-040 CV-
Penicilina-estreptomicina	Cellgro	30-002 CI-	10.000 UI de penicilina estreptomicina 10000 ug / ml
L-glutamina	Cellgro	25-005 CI-	200 mM de solução de
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
De soro fetal bovino (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lote testado
Rastreador de celular mancha vermelha	Invitrogen	C34552	50 ug
Vybrant DyeCycle Violeta Mancha	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX Ácido Nucleico mancha verde	Invitrogen	S7020	5 mM
Anexina V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 ul
PBS Dulbecco	Cellgro	21-031 CV-	500 ml
Agar Noble	DISCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0,4% de líquido, filtrado estéril
Hemocitômetro	Hausser Scientifics	1492	Linha brilhante
4-bem chapa	Thermo Fisher	167603
Harrick Cleaner Plasma	Harrick Plasma	PDC-32G	Aspirador de plasma básica
Observer.Z1	ZEISS		Microscópio de fluorescência (funciona com as três partes abaixo)
Lambda 10-3	Instrumento Sutter		Filtro controlador
Lambda DG-4	Instrumento Sutter		Ultra-High-Speed ​​Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD da câmera	Hamamatsu	C9100-13	Microscópio CCD da câmera
15 tubo cônico ml	BD Falcon	352097
50 ml tubo cónico	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Vidro prato de cultura de fundo	MatTek Corporação	P35G-0	35 milímetros placa de Petri de 10 mm de micropoços