Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Résumé

Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu'ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l'espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l'apoptose subséquente.

Résumé

L'immunothérapie du cancer permet d'exploiter la spécificité de la réponse immunitaire à cibler et à éliminer les tumeurs. Thérapie cellulaire adoptive (ACT) basé sur le transfert adoptif de lymphocytes T génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur d'antigène chimérique (CAR) a montré très prometteur dans les essais cliniques ^1-4. Il ya plusieurs avantages à utiliser CAR ⁺ lymphocytes T pour le traitement de cancers, y compris la capacité de cibler des antigènes du CMH non réglementées et pour fonctionnaliser les lymphocytes T pour la survie optimale, tête chercheuse et de la persistance dans l'hôte, et enfin à induire l'apoptose de CAR ⁺ Les cellules T dans le cas de ⁵ toxicité hôte.

La délimitation des fonctions optimales de CAR ⁺ lymphocytes T associés à un bénéfice clinique est essentielle pour concevoir la prochaine génération des essais cliniques. Les progrès récents de l'imagerie des animaux vivants comme la microscopie multiphotonique ont révolutionné l'étude de la fonction des cellules immunitaires in vivo ^6,7. Bien que ces études ont fait progresser notre compréhension des fonctions des cellules T in vivo, des cellules T ACT basée sur des essais cliniques nécessite la nécessité de relier les caractéristiques moléculaires et fonctionnelles des cellules T préparations pré-infusion avec une efficacité clinique après la perfusion, en utilisant en tests in vitro des cellules T surveillance des fonctions telles que, la cytotoxicité et la sécrétion de cytokines. Standard de cytométrie en flux ont été basés sur des tests élaborés pour déterminer le fonctionnement global des populations de cellules T au niveau d'une seule cellule, mais celles-ci ne sont pas appropriés pour le suivi et la formation de conjugués vie ou la capacité de la cellule même de tuer plusieurs cibles ^8.

Microfabriqués tableaux conçus dans des polymères biocompatibles tels que le polydiméthylsiloxane (PDMS) constituent une méthode particulièrement attrayante pour limiter l'espace effecteurs et des cibles dans de petits volumes ^9. En combinaison avec la microscopie à fluorescence automatisé time-lapse, quoiqueusands d'effecteur-cible interactions peuvent être surveillés simultanément par des puits individuels d'imagerie d'un tableau nanowell. Nous présentons ici une méthode à haut débit pour la surveillance cytotoxicité à médiation cellulaire T-au niveau d'une seule cellule qui peut être largement appliquée à l'étude de la fonctionnalité des lymphocytes T cytolytiques.

Protocole

1. Préparation des réactifs

1. Préparer un milieu RPMI-PLGH en mélangeant 500 ml du milieu RPMI-1640 et 5 ml de pénicilline-streptomycine, L-glutamine, l'HEPES et de la solution.
2. Préparer R10 solution en mélangeant RPMI-PLGH avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS). La FBS est inactivé par la chaleur à 56 ° C pendant 30 min avant l'addition.
3. Préchauffer à 37 ° C 50 ml de RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, et 15 de la R10 dans des tubes coniques stériles.
4. Fabrication des tableaux de nanowells dans PDMS: Le maître de silicium est fabriqué en utilisant la photolithographie essentiellement comme décrit précédemment ^10. Bien mélanger le Sylgard 184 kit de base élastomère et le durcisseur 10:1 poids dans un gobelet jetable en utilisant un couteau en plastique. Dégazer le mélange dans une chambre à vide pendant 1 heure. Verser le mélange sur le tableau nanowell, sceller avec une lame de verre et laissez-le reposer pendant 30 min. Transfert de l'ensemble dans un four réglé à 80 ° C pendant 2 heures et laisser refroidir à température ambiante pendant 1 heure. L'élastomère sera actue au cours de cette période et la volonté de se lier à la lame de verre. La lame de verre contenant le réseau PDMS nanowell est soigneusement décollé le maître silicium, recouvert avec du scotch et stocké jusqu'à son utilisation future.

2. Cellule cible (T) Marquage

1. Compter 5 millions de cellules de culture de cellules cibles à l'aide d'un hémocytomètre et sédimenter les cellules dans un tube de 15 ml stérile conique par centrifugation à 340 g pendant 5 min. La culture de cellules est divisé le jour précédent dans 5 ml de volume total (densité = 1 millions / ml) et cultivées en flacon T-25 (VWR). Protocoles pour le comptage des cellules à l'aide hémocytomètre ont été décrits en détail antérieurement ¹¹
2. Aspirer les supports en excès, laissant derrière d'environ 50 pi de médias.
3. Préparer une solution de travail de la cellule Tracker Rouge (CTR) en mélangeant 0,5 ul de stock CTR (1 mM) à 150 ul de RPMI-PLGH (concentration finale 2,5 uM). Ajouter 150 ul de la solution de travail aux cellules cibles et bien mélanger à l'aide d'une pipette P200.Alternativement, PKH 26 (concentration finale de 2 uM) peut être utilisé cellules cibles étiquettes selon les instructions du fabricant.
4. Incuber à 37 ° C / 5% de CO ₂ pendant 20 min.

3. Marquage cellulaire effectrice (E)

1. Compter 5 millions de cellules effectrices de culture de cellules à l'aide d'un hématimètre et le culot des cellules dans un tube de 15 ml stérile conique par centrifugation à 340 g pendant 5 min.
2. Aspirer les supports en excès
3. Préparer une solution de travail de Vybrant solution Stain DyeCycleViolet en ajoutant 1 pl de 5 stock Violet mM Vybrant à 1 ml de R10 médias (concentration finale de 5 uM). Ajouter la solution de travail à l'aide de cellules et remettre en suspension P200 pipette. Alternativement, PKH 67 (concentration finale de 2 uM) peut être utilisé cellules cibles étiquettes selon les instructions du fabricant. Si PKH 67 est utilisé, alors SYTOX vert ne doit pas être utilisés car ils sont dans le même canal de fluorescence. L'énumération des objectifs de apoptotiques se fait exclusivement en utilisant uncoloration nnexinV dans ce cas.
   Remarque: Si vous effectuez time-lapse et les mesures de point final non, colorants UV comme Violet Vybrant doit être évitée.
4. Incuber à 37 ° C / 5% de CO ₂ pendant 20 min.

4. Séparation des cellules vivantes et mortes par gradient de densité

1. Ajouter 6,8 ml et 6,0 ml de RPMI-PLGH à la cible et les cellules effectrices, respectivement, et mélanger par pipetage de haut en bas doucement.
2. Couche de 3,5 ml de Ficoll-Paque Plus à fond de chaque tube conique contenant la cible et les cellules effectrices. La couche FICOLL lentement pour assurer une bonne formation de couches entre FICOLL et des médias.
3. Centrifuger les deux tubes à 340 xg pendant 30 min. sans frein et d'accélération.
4. Lors de la centrifugation, transférer 7 ml de PBS préchauffé à une plaque 4-bien. Préparer ensemble nanowell (fabriqué en PDMS): pour nettoyer le fond de la lame de verre avec de l'éthanol et de l'oxydation du PDMS au réglage élevé RF à l'aide d'oxydation plasma pendant 1 min. Cette étape va sterilize la matrice, tout en rendant nanowell le PDMS hydrophile. Immédiatement déplacer la baie nanowell dans la plaque contenant du PBS.
5. Placer la plaque d'une enceinte de biosécurité et aspirer excès de PBS. Faire 10 ml 1% de gélose noble par addition de 100 mg de poudre d'agar 10 ml d'eau déminéralisée, puis au micro-ondes pendant 30-45 sec. Appliquer réchauffer 1% d'agar noble sur le bord supérieur et inférieur de lame de verre qui contient le tableau nanowell pour immobiliser le réseau et attendre 10 minutes pour solidifier la gélose à. Ajouter 3 ml de PBS et aspirée agar excès.
6. Ajouter 3 ml de R10 sur le haut de gamme nanowell et le laisser s'équilibrer pendant environ 10 min.
7. Après la centrifugation sur Ficoll, aspirer 5 ml de milieu de la couche supérieure de chaque tube. Attention de ne pas aspirer la couche contenant les cellules.
8. Récolter les cellules (couche blanche) en récupérant 1-2 ml de la couche entre FICOLL et les médias avec P1, 000 pipette et passage à de nouveaux tubes coniques stériles. Répétez cette opération pour les deux ensembles de cellules tout en veillant à ce que vous maximeiser les cellules de récupération.
9. Ajouter 3 ml de pré-chauffé RPMI-PLGH dans chaque tube, mélanger par pipetage et par centrifugation à 340 g pendant 5 min à pleine accélération et de freinage.
10. Aspirer les supports en excès, ajouter 5 ml de pré-chauffé RPMI-PLGH à chaque tube et répétez centrifugation à 340 xg pendant 5 min.
11. Aspirer les supports en excès et remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pl de R10.
12. Compter les cellules vivantes en utilisant la méthode d'exclusion du bleu trypan sur un hématimètre.

5. Chargement en cours cellule sur tableau Nanowell

1. Aspirer les supports en excès gamme nanowell et ajouter 2 ml de R10 frais à travers le réseau. Aspirer à nouveau tout en s'assurant que le haut de gamme nanowell n'est pas trop humide / sec car il aura une incidence sur la distribution des cellules.
2. Des dépôts 1 x 10 ⁵ cellules effectrices dans 200 pl de R10 sur une surface large nanowell (densité = 5 x 10 ⁵ cellules / ml).
3. Laissez cellules se déposent pendant 5 min et en utilisant un chèque-type de tissus culture microscope pour ens'assurer que la distribution des cellules est souhaitable. Ajouter plus de cellules si nécessaire.
4. Dépôt de garantie 1 x 10 ⁵ cellules cibles dans 200 ul R10 sur nanowell surface de réseau (densité = 5 x 10 ⁵ cellules / ml).
5. Laissez cellules se déposent pendant 5 min et en utilisant un chèque-type de tissus culture microscope pour s'assurer que la distribution des cellules est souhaitable. Ajouter plus de cellules si nécessaire.
6. Rincer soigneusement à l'ensemble nanowell 2 ml R10 et aspirer les supports en excès.
7. Préparer 3 ml préchauffé R10 dans un tube conique de 15 ml stérile. Ajouter 3 pi de 0,5 mM SYTOX vert Nucleic Acid Stain (concentration finale de 0,5 uM) et 60 pl de l'annexine V-Alexa Fluor 647 pour préparer la solution de travail. Ajouter la solution de travail sur la plaque 4-bien attentivement tout en s'assurant que les cellules ne sont pas déplacés dans les puits.
8. Incuber à 37 ° C / 5% de CO ₂ pendant 15 min.

6. Image 1

1. Acquérir des images de la matrice en utilisant une encre magnétique nanowell fluorescenceoscope: Dans cet exemple, nous utilisons un observateur ZEISS Z-1 microscope équipé d'une platine motorisée et Lambda-DG4.
2. Initialiser le logiciel et le microscope et vérifier l'intensité du signal de la lumière transmise et les autres canaux fluorescents. Dans l'ensemble, il y aura cinq canaux correspondant à: la lumière transmise, l'annexine V-647 (Cy5 filtre), CTR (DsRed filtre), SYTOX vert (filtre FITC), et Vybrant Violet (DAPI filtre). Assurez-vous que le microscope il configuré pour assurer un signal au bruit maximal tout en évitant la saturation.
3. Réglez la position X et Y de la matrice nanowell. Début du processus de réglage de la position zéro et initialiser l'accent sur le centre de 7 x 7 Bloc de réseau nanowell sur le coin supérieur gauche de la matrice nanowell timbre. Réglez les positions X, Y pour les faire coïncider avec le centre de chaque bloc et la valeur z pour refléter fidèlement l'accent sur chaque bloc.
4. Une fois la position et l'orientation constituent tous ensemble, assurez-vous de régler l'acquisition d'images en mode linéaire et acquérir des images. Remarque: Si nécessaire, à son tour sur l'incubateur et du CO ₂ sur le microscope au moins 30 min avant l'expérience.

7. Post-imagerie

Placer la plaque 4-puits contenant le tableau nanowell dans un incubateur (37 ° C / 5% CO ₂₎ pendant 6 heures.

8. Imagerie 2

Acquérir les images à la seconde fois, le point comme il est indiqué à l'étape 6.

9. Analyse d'images

1. L'occupation des cellules dans la nanowells est déterminée par l'utilisation de programmes appropriés de segmentation d'image (par exemple ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ ), essentiellement comme décrit précédemment ^9,12.
2. Analyse de la première série d'images de microscope (t = 0 h, t ₀₎ est utilisée pour générer une base de données des nanowells individuels contenant exactement une cellule cible en temps réel (identifiéspar CellTracker rouge, rouge) et pas de cellules mortes (identifié par l'annexine V coloration, vert) [T1T ₀ nanowells].
3. Analyse du second ensemble d'images de microscope (t = 6 h, t ₆₎ est utilisé pour déterminer de manière indépendante une seconde base de données contenant des nanowells 1 cellule cible (rouge) _[6 T1T nanowells]. Un contrôle d'intégrité (requête de base de données) est mis en œuvre pour s'assurer que toutes les cibles vivantes à t ₀ sont adaptés aux objectifs à t ₆ pour produire un ensemble final de cibles appariées (mis en œuvre nanowells qui ont T1T ₀ = T1T _6, désigné comme T1match)
4. Le nombre de cellules effectrices dans nanowells est déterminée en utilisant une coloration violette Vybrant à l'instant t ₀ [nanowells E1]
5. Une requête de base de données est mis en œuvre pour identifier nanowells contenant effecteurs simples co-incubées avec des objectifs simples (définie comme nanowells qui ont _{du match} E1 et T1, désignés comme E1T1)
6. Effecteur l'apoptose induite est marqué par i DENTIFIER cibles qui sont annexine V négatif à l'instant t ₀ et l'annexine V positif à l'instant t ₄ (E1T1 avec coloration annexine V cible à l'instant t _6).

10. En option imagerie time-lapse de l'abattage Utilisation de Nikon BioStation IM

1. Prenez une boîte de Pétri à fond la lamelle et couper un petit morceau de la puce de réseau nanowell (préparé à l'étape 5) qui s'adaptent exactement sur la lamelle. Assurez-vous que la puce reste humide pendant la coupe.
2. Mélanger 1 x 10 ⁶ cibles et 1 x 10 ⁶ cellules T dans 100 ul de médias, et il pipette sur la lamelle.
3. Prévoyez environ 15-30 minutes pour laisser les cellules se déposent.
4. Rapidement inverser la puce petit tableau nanowell et le placer sur la lamelle.
5. Afin de s'assurer que la puce ne sera pas capable de se déplacer pendant l'imagerie, le lieu d'une ou deux lamelles 20mm x 20mm sur la partie supérieure de la puce. Appliquer une pression pour pousser doucement la puce au fond de la cuvette.

tente "> Remarque: Le fond de la puce de réseau nanowell est trop épais pour l'imagerie haute résolution et doit donc être renversé Pendant ce temps, la plupart des cellules sont lavées Puisque cela peut ne pas être facilement contrôlées, le nombre de cellules à l'étape 9.2.. et le temps d'incubation de l'étape 9.3 doivent être optimisés.

Résultats

Un exemple de l'application de l'analyse à haut débit cytolytique est démontré dans la figure 2. En bref, étiqueté CD19 spécifique CAR ⁺ cellules T ont été co-incubées avec des cellules de souris marqués cibles EL4 dans les puits individuels d'un tableau nanowell (articles 1-5). Une image initiale a été enregistré sur le microscope fluorescent automatisé pour identifier l'occupation (effecteurs et / ou cibles) de chaque nanowell unique sur le réseau (section 6)...

Discussion

Nous avons décrit le protocole pour un haut débit seule cellule d'essai cytolytique activé via la co-incubation des effecteurs et des cibles dans les tableaux de nanowells (figure 1). En plus de débit d'un avantage majeur de cette technique est la possibilité de surveiller effecteur cytotoxicité à médiation contre des cellules cibles désirées sans avoir besoin de l'ingénierie cellulaire cible qui à son tour permet l'utilisation de autologues ou appariés / primaire cellules t...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif / Matériel	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI-1640 w / o L-glutamine	Cellgro	15 à 040 CV-
Pénicilline-streptomycine	Cellgro	30-002-CI	10.000 UI de pénicilline 10000 ug / ml de streptomycine
L-glutamine	Cellgro	25 à 005-CI	Solution 200 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Sérum fœtal bovin (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot testé
Cellule Tracker tache rouge	Invitrogen	C34552	50 ug
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
Acide nucléique SYTOX tache verte	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexine V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 pi
PBS Dulbecco	Cellgro	21-031 CV-	500 ml
Agar Noble	DIFCO	2M220	100 g
Bleu trypan	Sigma Aldrich	T8154	0,4% de liquide, on filtre stérile
Hémocytomètre	Hausser Scientifics	1492	Ligne claire
4-plaque à puits	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic nettoyeur à plasma
Observer.Z1	ZEISS		Microscope à fluorescence (fonctionne avec les trois parties ci-dessous)
Lambda 10-3	Instrument Sutter		Contrôleur de filtre
Lambda DG-4	Instrument Sutter		Ultra-High-Speed ​​longueur d'onde de commutation
Hamamatsu EM-CCD de la caméra	Hamamatsu	C9100-13	Microscope caméra CCD
15 ml tube conique	BD Falcon	352097
50 ml tube conique	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Europe BV	Biostation IM
Boîte de culture à fond de verre	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm boîte de Petri de 10 mm micropuits