Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Resumen

Se describe una sola célula de alto rendimiento de ensayo para medir la citotoxicidad de las células T cuando se incuba con las células diana tumorales. Este método emplea una matriz densa, elastómero de sub-nanolitros pozos (~ 100.000 pozos / matriz) para confinar espacialmente las células T y las células diana en proporciones definidas, y está acoplado a la microscopía de fluorescencia para monitorizar efector-diana conjugación y posterior apoptosis.

Resumen

Inmunoterapia del cáncer puede aprovechar la especificidad de la respuesta inmune para atacar y eliminar tumores. Terapia celular adoptiva (ACT) sobre la base de la transferencia adoptiva de células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) ha mostrado una promesa considerable en los ensayos clínicos ^1-4. Hay varias ventajas de utilizar CAR ⁺ células T para el tratamiento de cánceres, incluyendo la capacidad de apuntar no-MHC antígenos restringidos y para funcionalizar las células T para la supervivencia óptima, mensajeras y persistencia dentro del huésped, y finalmente para inducir la apoptosis de CAR ⁺ células T en el caso de toxicidad para el huésped ^5.

La delineación de las funciones óptimas de CAR ⁺ células T asociados con un beneficio clínico es esencial para el diseño de la próxima generación de ensayos clínicos. Los recientes avances en imágenes de animales vivos como microscopía multifotónica han revolucionado el estudio de la función celular inmune in vivo ^6,7. Aunque estos estudios han avanzado nuestra comprensión de las funciones de las células T in vivo, las células T ACT basada en ensayos clínicos, requiere la necesidad de vincular las características moleculares y funcionales de las células T preparaciones de pre-infusión con eficacia clínica después de la infusión, utilizando en ensayos in vitro de vigilancia de células T como las funciones, la citotoxicidad y la secreción de citoquinas. Estándar de citometría de flujo basados ​​en ensayos han sido desarrollados que determinan el funcionamiento general de las poblaciones de células T a nivel de una sola célula, pero estos no son adecuados para el seguimiento de la formación de conjugado y tiempos de vida o la capacidad de la misma célula para matar múltiples objetivos ^8.

Arrays microfabricados diseñado en polímeros biocompatibles, como el polidimetilsiloxano (PDMS) son un método particularmente atractivo para confinar espacialmente efectores y objetivos en volúmenes pequeños ^9. En combinación con la microscopía de fluorescencia automatizado time-lapse, aunqueusands de interacciones efector-objetivo pueden ser controlados simultáneamente por los distintos pozos de imágenes de una gran nanowell. Se presenta aquí una metodología de alto rendimiento para el seguimiento de la citotoxicidad de células T mediada a nivel de una sola célula que puede aplicarse ampliamente para estudiar la funcionalidad de las células T citolítica.

Protocolo

1. Reactivos Preparación

1. Preparar RPMI-PLGH mediante la mezcla de 500 ml ml de RPMI-1640 y 5 de cada uno de penicilina-estreptomicina, L-glutamina, y la solución de HEPES.
2. Preparar R10 solución mediante la mezcla de RPMI-PLGH con suero fetal bovino al 10% (FBS). El FBS es inactivado por calor a 56 ° C durante 30 min antes de la adición.
3. Pre-caliente a 37 º C 50 ml de medio RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, y 15 de R10 en tubos cónicos estériles.
4. Fabricación de matrices de nanowells en PDMS: El maestro de silicio se fabrica utilizando fotolitografía esencialmente como se describe anteriormente ^10. Mezclar bien la base de Sylgard 184 kit elastómero y el agente endurecedor a una relación de peso de 10:1 en un vaso desechable usando un cuchillo de plástico. Desgasificar la mezcla en una cámara de vacío durante 1 hora. Vierta la mezcla sobre la matriz nanowell, selle con un portaobjetos de vidrio y se deja reposar durante 30 minutos. Transferir el conjunto en un horno a 80 ° C durante 2 horas y se deja enfriar a temperatura ambiente durante 1 hr. El elastómero se acte durante este período y se adhiere a la placa de vidrio. La lámina de vidrio que contiene la matriz PDMS nanowell es cuidadosamente levantado del maestro de silicio, cubierta con cinta adhesiva y se almacena hasta su uso futuro.

2. Célula diana (T) Etiquetado

1. Contar 5 millones de células diana de cultivo de células utilizando un hemocitómetro y sedimentar las células en un tubo estéril de 15 ml cónico por centrifugación a 340 xg durante 5 min. El cultivo celular se divide el día anterior en el volumen total de 5 ml (densidad = 1 millón / ml) y se cultivaron en matraz T-25 (VWR). Los protocolos para el recuento de células usando un hemocitómetro se han descrito en detalle previamente ¹¹
2. Aspirar el exceso de material dejando atrás aproximadamente 50 l de medios de comunicación.
3. Preparar una solución de trabajo de Cell Tracker Red (CTR) mediante la mezcla de 0,5 l de stock CTR (1 mM) a 150 l de RPMI-PLGH (concentración final 2,5 mM). Añadir 150 l de la solución de trabajo a las células diana y mezclar cuidadosamente con una pipeta P200.Alternativamente, PKH 26 (concentración final de 2 mM) se pueden utilizar células de etiqueta de destino de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Incubar a 37 ° C / 5% de CO ₂ durante 20 min.

3. Efector (E) Cell etiquetado

1. Contar 5 millones de células efectoras procedentes de cultivo de células utilizando un hemocitómetro y sedimentar las células en un tubo estéril de 15 ml cónico por centrifugación a 340 xg durante 5 min.
2. Aspirar el exceso de material
3. Preparar una solución de trabajo de Vybrant solución Stain DyeCycleViolet mediante la adición de 1 l de 5 mM de existencias Violet Vybrant a 1 ml de R10 medios (concentración final de 5 mM). Añadir la solución de trabajo a las células y resuspender usando P200 pipeta. Alternativamente, PKH 67 (concentración final de 2 mM) se pueden utilizar células de etiqueta de destino de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Si PKH 67 se utiliza, a continuación, Sytox Green no debería utilizarse ya que están en el mismo canal de fluorescencia. La enumeración de los objetivos de apoptosis se realiza exclusivamente mediante unnnexinV tinción en este caso.
   Nota: Si se realiza lapso de tiempo y no mediciones de punto final, como tintes UV Violet Vybrant debe ser evitado.
4. Incubar a 37 ° C / 5% de CO ₂ durante 20 min.

4. Separación de células vivas y muertas por gradiente de densidad

1. Añadir 6,8 ml y 6,0 ml de RPMI-PLGH a diana y células efectoras, respectivamente, y mezclar pipeteando arriba y abajo suavemente.
2. Capa de 3,5 ml de Ficoll-Paque Plus a fondo de cada tubo cónico que contenía diana y células efectoras. Capa de la Ficoll lentamente para asegurar una buena formación de capas entre Ficoll y medios de comunicación.
3. Centrifugar ambos tubos a 340 xg durante 30 min. sin freno y aceleración.
4. Durante la centrifugación, transferir 7 ml de PBS precalentado a una placa de 4 pocillos. Preparar matriz nanowell (fabricado en PDMS): parte inferior de la placa de vidrio limpia con etanol y oxidar el PDMS en ajuste alto de RF utilizando plasma oxidante durante 1 min. Este paso steRilize la matriz nanowell al mismo tiempo haciendo que el PDMS hidrófilo. Mueva inmediatamente la matriz nanowell en la placa que contiene PBS.
5. Colocar la placa a una cabina de bioseguridad y aspirar el exceso de PBS. Hacer 10 ml 1% de agar noble por la adición de 100 mg de polvo de agar a 10 ml de agua desionizada y luego el microondas durante 30-45 segundos. Aplicar calentar 1% de agar noble en el borde superior e inferior del portaobjetos de vidrio que contiene la matriz de nanowell para inmovilizar la matriz y esperar 10 minutos para agar para solidificar. Añadir 3 ml de PBS y agar exceso de aspiración.
6. Añadir 3 ml de R10 en la parte superior de la matriz nanowell y se deja equilibrar durante aproximadamente 10 minutos.
7. Con posterioridad a la centrifugación de Ficoll, aspirar 5 ml de medio de la capa superior de cada tubo. Tenga cuidado de no aspirar la capa que contiene las células.
8. Recoger las células (capa blanca) mediante la recuperación de 1-2 ml de la capa entre Ficoll y medios de comunicación con P1, 000 pipeta y se mueven a nuevos tubos cónicos estériles. Repita esto para los dos grupos de células mientras se asegura de que usted máximaize las células de recuperación.
9. Añadir 3 ml de pre-calentado RPMI-PLGH a cada tubo, mezclar mediante pipeteo y sedimento por centrifugación a 340 xg durante 5 min en plena aceleración y freno.
10. Aspirar el exceso de material, añadir 5 ml de pre-calentado RPMI-PLGH a cada tubo y repetir la centrifugación a 340 xg durante 5 min.
11. Aspirar el exceso de material y resuspender el pellet celular en 500 l de R10.
12. Contar las células vivas utilizando el método de exclusión de azul tripán en un hemocitómetro.

5. Célula de carga en matriz Nanowell

1. Aspirar el exceso de material de la matriz nanowell y añadir 2 ml de R10 fresco a través de la matriz. Aspire de nuevo mientras se asegura la parte superior de la matriz nanowell no es demasiado húmedo / seco ya que afectará a la distribución de células.
2. Depósito 1 x 10 ⁵ células efectoras en 200 l de R10 sobre la superficie de matriz nanowell (densidad = 5 x 10 ⁵ células / ml).
3. Vamos células se asienten durante 5 min y utilizando un estándar de cultivo de tejido de verificación para microscopio enAsegúrese de que la distribución de las células es deseable. Agregar más celdas si es necesario.
4. Depósito 1 x 10 ⁵ células diana en 200 R10 l en la superficie de matriz nanowell (densidad = 5 x 10 ⁵ células / ml).
5. Vamos células se asienten durante 5 min y utilizando un estándar de cultivo de tejido de verificación microscopio para asegurarse de que la distribución de las células es deseable. Agregar más celdas si es necesario.
6. Enjuagar cuidadosamente con arreglo nanowell 2 ml R10 y el exceso de material aspirado.
7. Preparar 3 ml precalentado R10 en un tubo cónico de 15 ml estéril. Añadir 3 l de 0,5 mM Sytox Nucleic Acid Green Stain (mM concentración final de 0,5) y 60 l de Annexin V-Alexa Fluor 647 para preparar la solución de trabajo. Añadir la solución de trabajo sobre la placa de 4 pocillos cuidadosamente mientras se asegura que las células no son desplazados de los pocillos.
8. Incubar a 37 ° C / 5% de CO ₂ durante 15 min.

6. Imagen 1

1. Adquirir imágenes de la matriz nanowell utilizando un micr fluorescenciaoscope: En este ejemplo, se utiliza un Observador ZEISS Z-1 microscopio equipado con una platina motorizada y Lambda-DG4.
2. Inicializar el software y el microscopio y comprobar la intensidad de señal en la luz transmitida y los otros canales fluorescentes. En general, habrá cinco canales correspondientes a: luz transmitida, Anexina V-647 (Cy5 filtro), CTR (DsRed filtro), Sytox Green (filtro FITC), y Vybrant Violet (DAPI filtro). Asegúrese de que el microscopio configurarlo para garantizar la máxima señal a ruido y evitar la saturación.
3. Establecer ejes X e Y para la matriz nanowell. Comenzar el proceso de ajuste de la posición cero y la inicialización de enfoque en el centro de 7 x 7 nanowell bloque de matriz en la esquina superior izquierda de la marca de gama nanowell. Establecer los ejes X, Y puestos a coincidir con el centro de cada bloque y el valor z para reflejar con precisión la concentración en cada bloque.
4. Una vez que la posición y el enfoque está todo listo, asegúrese de establecer la adquisición de imágenes en modo lineal y adquirir imágenes. Nota: Si giro necesario en la incubadora y CO ₂ en el microscopio de al menos 30 min antes del experimento.

7. Mensaje de imágenes

Colocar la placa de 4 pocillos que contiene la matriz nanowell en una incubadora (37 ° C / 5% CO ₂₎ durante 6 horas.

8. Imagen 2

Adquirir las imágenes en el segundo punto de tiempo como se indica en el Paso 6.

9. Análisis de Imagen

1. La ocupación de las células dentro de la nanowells se determina por el uso de los apropiados programas de segmentación de imágenes (por ejemplo ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) esencialmente como se describe previamente ^9,12.
2. Análisis del conjunto inicial de imágenes de microscopio (t = 0 h; t ₀₎ se utiliza para generar una base de datos de los nanowells individuales que contienen exactamente una célula diana en vivo (identificadopor CellTracker Rojo, rojo) y no hay células muertas (identificados por tinción con Anexina V, verde) [T1t ₀ nanowells].
3. Análisis de la segunda serie de imágenes de microscopio (t = 6 h, t ₆₎ se utiliza para determinar de forma independiente una segunda base de datos de nanowells que contienen 1 célula diana (rojo) [T1t ₆ nanowells]. La comprobación de integridad (consulta de base de datos) se implementa para asegurar que todos los objetivos en vivo en t ₀ se hacen coincidir con los objetivos en t ₆ para producir un conjunto final de objetivos coincidentes (implementada como nanowells que tienen T1t ₀ = T1t _6, designada como T1match)
4. El número de células efectoras en nanowells se determina mediante tinción con violeta Vybrant en t ₀ [nanowells E1]
5. Una consulta de base de datos se lleva a cabo para identificar nanowells que contienen efectores individuales co-incubadas con objetivos individuales (definidas como nanowells que tienen _partido E1 y T1, designados como E1T1)
6. Apoptosis inducida Effector es calificada por i DENTIFICACIÓN objetivos que son Anexina V negativo en t ₀ y Anexina V positivo en t ₄ (E1T1 con tinción Anexina V en blanco t _6).

10. Opcional Time-lapse de imágenes de la matanza Uso BioStation Nikon IM

1. Tome una cápsula de Petri con fondo cubreobjetos y cortar un pedazo pequeño de la gama de chips nanowell (preparado en el paso 5) que se ajuste exactamente en el cubreobjetos. Asegúrese de que el chip se mantiene húmeda durante el corte.
2. Mezclar 1 x 10 ⁶ dianas y 1 x 10 ⁶ células T en 100 medios de comunicación, y mu l pipeta que en el cubreobjetos.
3. Espere unos 15-30 minutos a que las células se asiente.
4. Rápidamente invertir el pequeño chip nanowell matriz y colóquela sobre el cubreobjetos.
5. Con el fin de asegurar que el chip no será capaz de moverse durante la formación de imágenes, el lugar de una o dos cubreobjetos de 20 mm x 20 mm sobre la parte superior del chip. Aplicar presión para empujar suavemente el chip a la parte inferior del plato.

tienda de campaña "> Nota: bottom El chip array nanowell es demasiado gruesa para imágenes de alta resolución y por lo tanto tiene que ser al revés Durante este tiempo, muchas de las células se lavan Puesto que esto no puede ser fácilmente controladas, el número de células en el Paso 9.2.. y tiempo de incubación en el paso 9,3 se deben optimizar.

Resultados

Un ejemplo de la aplicación del ensayo citolítico de alto rendimiento se demuestra en la Figura 2. Brevemente, etiquetado específico CD19-CAR ⁺ células T se co-incubaron con células diana marcadas ratón EL4 en los pocillos individuales de una matriz de nanowell (Secciones 1-5). Una imagen inicial se registró en el microscopio fluorescente automatizada para identificar la ocupación (efectores y / o metas) de todos y cada uno nanowell en la matriz (Sección 6). El procesamiento de imág...

Discusión

Hemos esbozado el protocolo para un alto rendimiento de una sola célula ensayo citolítico habilitado a través de co-incubación de los efectores y metas en las matrices de nanowells (Figura 1). Además de rendimiento de una de las principales ventajas de la técnica es la capacidad de controlar efectora mediada por la citotoxicidad contra células diana deseadas sin la necesidad de la ingeniería de las células diana que a su vez permite el uso de células tumorales autólogas o apareadas / primaria...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI-1640 w / o L-glutamina	Cellgro	15-040 CV-
Penicilina-estreptomicina	Cellgro	30 a 002-CI	10.000 UI de penicilina 10.000 g / ml estreptomicina
L-glutamina	Cellgro	25 a 005-CI	200 mM de solución
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Suero fetal bovino (FBS)	Atlanta Biológicos	S11150	Lote probado
Cell Tracker mancha roja	Invitrogen	C34552	50 g
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
Sytox ácido nucleico mancha verde	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 l
PBS de Dulbecco	Cellgro	21-031 CV-	500 ml
Agar Noble	DIFCO	2M220	100 g
Azul de tripano	Sigma Aldrich	T8154	0,4% de líquido, se filtró estéril
Hemocitómetro	Hausser Científicos	1492	Bright línea
4 pocillos	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic limpiador de plasma
Observer.Z1	ZEISS		Microscopio de fluorescencia (trabaja con las tres partes abajo)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filtro regulador
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-alta velocidad de conmutación de longitud de onda
Hamamatsu EM-CCD cámara	Hamamatsu	C9100-13	Microscopio cámara CCD-
Tubo cónico de 15 ml	BD Falcon	352097
Tubo cónico de 50 ml	VWR	3282-345-300
Nikon BioStation	Nikon Instruments Inc.	BioStation IM
Fondo de cristal placa de cultivo	MatTek Corporación	P35G-0	35 mm placa de Petri de 10 mm micropocillo