解吸电喷雾电离质谱成像的生物组织

摘要

电喷雾解吸电离质谱（DESI-MS）是一个环境样本，包括生物组织，可以用最少的样品制备成像方法。通过离子探针光栅下面的示例，这个喷雾基于技术组织切片内辨别分子功能提供了足够的空间分辨率。

摘要

质谱成像（MSI）提供不相关的分子调查在几百到几十微米规模的生物组织具有最高特异性和空间分辨率的信息。当在环境条件下，进行样​​品的前处理变得不必要了，从而简化了协议，而得到的信息保持高品质。解吸电喷雾电离（DESI）是一个基于喷雾环境的MSI的技术，它允许在露天的表面，即使是在体内直接采样。一起使用时，一个由软件控制的样品台，样品下方光栅DESI电离探针，通过时域的m / z的信息是相关的化学物种的空间分布。的DESI-MSI输出的保真度取决于源的方向和定位，对于样品表面和质谱仪入口。在此，我们回顾一下如何准备组织切片DESI我的maging和额外的实验条件下，直接影响图像质量。具体来说，我们描述成像大鼠脑组织切片的DESI-MSI的协议。

引言

无针对性的质谱成像，有利于发现和假说产生应用化学信息的收购。目标成像，在另一方面，还公知的化学，可以方便的灵敏度和选择性的增加，通过特定的方法的发展。质谱成像（MSI）是最常见的组织上进行二次离子质谱（SIMS），使用MALDI ²和环境离子化技术，包括解吸电喷雾电离（DESI），激光烧蚀电喷雾离子化^{（LAESI），4， 5}和液体微结表面取样探头^{（LMJ-SSP）6} MALDI和SIMS，样品标本进行物理删除，并有平而薄，因为他们是在高真空下进行分析。 MALDI需要涂层的辐射吸收矩阵的样品，样品的制备增加一个额外的，繁琐的步骤。 SIMS具有最高的横向分辨率，但高度高能粒子轰击导致广泛的分子碎片。因此，微星环境的方法填补一个利基，用最少的样品制备软分析是可取的。然而，迄今为止，所有的方法仍然由平坦的样品表面的要求的限制。

DESI ⁷采用了气动辅助充电冲着样品表面解吸和电离分析物的溶剂喷雾解吸电离和后续DESI工作模型被称为"液滴回升模型^"8-10主要液滴带电DESI探头所产生的碰撞的表面润湿，并形成薄膜，到其中的分析物被溶解的固-液微萃取机制⁸随后的液滴碰撞的结果中包含从表面提取的物质的二次液滴动量转移和起飞^9,10，气体最终相离子被认为是离子蒸发，电荷残基模型或其他模型^，11后通过ESI-状突起DESI然而，精确的离子形成过程中仍有待实验证明。的溶解度^12的 DESI灵敏度是强烈地依赖于中的分析物的喷雾溶剂，解吸依赖于本地化的微萃取¹³

一起使用时，一个由软件控制的样品台，样品与车道步进DESI电离探针下方单向扫描，通过时域的m / z的信息是相关的化学物种的空间分布（ 图1）。 DESI-MSI原理实验报告由Van Berkel的凯尔泰斯在2006年以来的首次证明^，14的技术已经相当成熟^，15血脂分析，药物代谢产物^3,16，17,18 disea报告应用硒的生物标志物，脑组织^{，19 3,18,20}肺组织，肾组织^{18 18}睾丸组织^，18个肾上腺^，17薄层层析板^，21和藻类表面²²例行DESI-MSI所获得的图像分辨率100-200微米，最终由喷雾提取的有效表面积，但已报告低至40微米的分辨率^{。23-25 ​​日}这样的分辨率和便于分析，使DESI-MSI适合的快速和简单的分析生物组织样本的表面区域在0.5-5厘米^2的范围内，使宝贵的空间信息的收购，以更好地理解生物过程^26。在这里，DESI-MSI一个典型的应用程序作为一个例子，我们进行了成功的实验，涉及成像大鼠脑组织中脂质的程序细节。在协议中两个最重要的步骤是组织制备²⁷和DESI离子源优化，如下所述。

研究方案

1。组织切片

1. 商店闪光灯冷冻，在-80℃冷冻，直到整个组织准备切片。
2. 允许的组织样本中的温度达到之前的冷冻切片机切片（30分钟）。设置的叶片和样品温度至-30℃。
3. 一旦组织中已达到的温度，处理的试样用小钳子，切正面或背面的脑的部分的大脑还有足够的安装表面（ 即 ，如果前面的大脑是最重要的，大脑后部安装卡盘上）。
   1. 应用〜0.5毫升最佳切削温度化合物（华侨城，组织康樱）夹头中心，使用镊子，并保持样品在华侨城的地方，直到它变硬。华侨城一旦被完全冻结，安装夹头样品架。
   2. 用于装载样品的OCT优选的最小量（对比试样安装在一个块中的OCT是常见的做在其他组织相容逻辑程序），以尽量减少样品的污染。样品的污染，由华侨城损害到DESI和成像过程中，由于离子抑制。
4. 典型的组织切片所需的MS的成像范围从12至18微米厚。节组织的建议范围内所需的厚度。解冻挂载每个切片组织超过部分室温下的显微载玻片轻轻触摸。一旦样品被安装，请小心不要触摸，因为它会改变组织切片的化学分布和组成。

注意:我们建议安装两个部分每张幻灯片，使用一节进行优化，和其他成像。如果部分是没有立即成像，存储滑梯-80℃的冰箱在幻灯片中，直到准备好进行分析。

5. 如果分析存储部分，从冰箱中删除幻灯片，立即转移到真空干燥器，并允许〜15-20最小解冻。离开试样干燥器中不再将干燥样品，，并降低DESI效率。一旦解冻，但是，在时间的关系，DESI离子源的优化工作将与组织样本，将样品解冻的期间作为一个理想的时间用于该设备的初始化。
   1. 使用作为DESI溶剂与1％乙酸的乙腈，打开取5μl/分钟的流速注射泵。较低的流速将降低的的DESI喷有效像素尺寸的影响点侧的，但更高的流速可能是必要的足够的灵敏度。因此，流量（通常1-5微升/分钟）应该为每个应用程序和所需的灵敏度和分辨率进行了优化。确保注射器在给定的流量的全面优化和成像包含足够的溶剂。
   2. 一旦溶剂源尖端出现滴水，打开氮气雾化气体与PRESSURE 160磅。
   3. 打开高压电源连接到离子源申请3,600 V。
6. 装载的运动舞台上的幻灯片，并开始离子源和MS优化

2。 DESI优化

1. DESI系统包括源探针（参见图2），注射器，泵或替代溶剂输送系统，压缩氮气，翻译样品台和安装。继续进行优化DESI源质谱仪​​一次已经调整为适当的质量范围和分析物。
   1. 如果源组件尚未尚未打开，请参阅第1.5.1-3的方向。
   2. 这些部分中的所讨论的变量被推荐为生物组织成像。然而，这些变量进行优化，以不同类型的组织或样本。已报告的想象中的替代溶剂，流速，雾化气体的压力和电压的生物组织^16-18纳克
2. 确保初期DESI源不接触载玻片上，而不是冲着任何部分组织部分。这将确保探头的初始优化过程中不被损坏，不会污染任何接触到的组织样本集的一部分。
   1. 一个很好的起点位置是从样品表面的前端3毫米到5毫米，从MS毛细管进样口，其中探头的角度55°相对于样品表面。内毛细血管的DESI探头应延长〜1毫米超越外毛细管所有这些参数将被优化
3. MS接口毛细管应该有一个收集〜15°的角度相对于最佳的离子转移到样品表面。调整阶段高度，从而MS对样品表面的毛细管悬停在毛细管应该是小于1 mm的表面，尽量靠近不接触。
4. 对齐的DESI探头在x维度相对于向MS毛细管进样口，使它们直接符合。
5. 调整的y和z的的DESI源的最佳灵敏度，使用额外的组织切片的位置。注意DESI探针是针对一个样本区域，它将最终解吸和电离当这发生时，在这方面，信号的分析物将逐渐减小。重要的是尽可能快地执行此步骤。
   1. 因此，整个优化过程中，需要移动的喷射头的下面，以确保新鲜样品进行分析，然后在信号中的任何变化，由于源优化，而不是样品耗​​尽样品。然而，考虑到不同区域的组织的各种化学组合物的离子强度在整个组织切片，直接的比较，虽然不完全准确。丘脑的大脑提供一个相当大的大小的区域的更为一致的化学成分，但仍然没有完全统一。或者，标记红色的骗子，其中包含的染料若丹明6G（[M] ^+，米/ Z 443），在载玻片上相差的样品提供了一个强有力的MS响应由DESI也可以用于优化，但给出了不同的样品形式和分析物，这些条件可能仍然没有建立一个理想的生物组织相关。
   2. 推荐Ÿ源尖和毛细管入口之间的分离:〜4毫米，推荐Ž分离针尖和样品表面:〜1.5毫米之间。虽然每个实验设置这些参数会略有不同。
   3. 考虑到探头的几何形状和角度，以考虑到，y和z维度的位置，相对于溶剂和含被分析物的液滴的有效传输是相互关联的。在一个变量的改变将需要在后续的修改，以保持相同的喷流冲击位置和其传动角。
6. 距离调整为从外最大的灵敏度，影响最小的光点尺寸的信号源毛细管内的毛细管挤出。注意:确保高电压是关闭，而这种调整。
7. 时观察到的最大信号源几何体将被认为是最优的。
   1. 第2.5-2.6优化的变量是相互关联的，因此，调整一个固有的需要进行重新调整，以维持必要的源样品入口的几何形状，或调整第1.5.1节中所讨论的条件3。
8. 此外，加热元件周围的传输毛细管到质谱仪促进在电离过程中产生的带电分析物的液滴的去溶剂化，可以提高灵敏度。在这里，我们用绳子加热器盘绕在转让毛细管设置为100℃。

3。布甲É成像

1. 在成像过程中，在样品台上将样品下方的的DESI探针和质谱入口毛细管和所有其他组件保持静止。舞台上的运动参数，应选择基础上的DESI影响羽规模和最佳的灵敏度。
   1. 较大的影响羽流将导致较高的离子强度，因为更多的样品被解吸，但是成像，它也将在更大范围内的像素尺寸和图像分辨率差从而导致。
2. 本实验中使用的翻译阶段是建立和控制由LabView的程序，允许控制速度和给定尺寸的图像的行间距的光栅。本实验中使用的载物台的运动控制VI提供omnispect.bme.gatech.edu。另外，市售的的DESI源和阶段可以用于如2D自动化全方位喷雾源从Prosolia公司（印第安纳波利斯，IN USA）。
   1. 对于脑组织一典型的图像大小为10 x 15毫米，并使用阶段的运动参数，图像将需要约3小时。
      1. 编程LabView的VI或等效控制软件的期望的成像条件下，使用一个阶段的扫描速度为80微米/秒，和行线之间的间距为200μm。当使用的全喷雾源，运动参数应设置为100-200微米/秒的扫描速度和线间距为200μm。请注意，根据所希望的像素数在每个维度和必要的灵敏度，这些运动参数是可以改变的。
         1. 一个较小的线间距已被证明能提高图像质量，与扫描速度具有以下的效果^。25，但要注意，这并不一定表明，提高了图像的分辨率，它是显着的，因为这是强烈地依赖于影响光斑大小。较慢的扫描速度和更小的行距将显着增加分析时间，因此必须优化作业捷思为每个不同的组织或样本。
      2. 与MS采集光谱扫描/秒，并作为1个像素/扫描产生的图象设定为1，阶段速度定义在x维度上的像素大小，行间距，而决定的像素大小中的y维度。虽然真正的像素的图像尺寸大于这是由于喷雾传播，速度较慢的运动允许更多的时间进行解吸和分析物的检测。
   2. 给目录期间要记录在LabVIEW VI图像的位置和时间的文件的路径和文件名。
3. 在制备用于质谱数据采集，计算成像所需的总时间。本集团所用的Labview程序自动提供此值，但如果使用替代阶段控制，以此计算的MS数据采集的设置是必要的。
   1. 当使用全向自动喷雾源和阶段中，每行的图像获取在灵敏度独立运行。时间每行所需的给定的成像尺寸的行数指的是使用全喷雾要输入到质谱仪的软件的控制软件。
4. 确保质谱仪的扫描速度为1频谱/秒，和设置在仪器的采集时间，以计算出的总时间相匹配。
   1. 设置光谱扫描速度为1频谱/秒。
   2. 简介模式采集数据，并确保在m / z范围是适当的利益的物种。记住DESI也产生多电荷分析，在ESI。
   3. 设置采集时间，以配合由LabVIEW图像总时间。
5. 喷流冲击点在成像区域左上角的位置。
6. 同时开始的MS数据采集和舞台运动。
7. 数据采集​​结束后，返回到待机模式质谱仪。
8. 关闭高电压DESI源。
9. 转ØFF氮气。
10. 关闭注射泵。

4。图像处理

1. 质谱数据，必须在结合阶段的时间和位置数据保存为一个文本文件通过LabView的"折叠"成2D图像相关联的坐标的像素与相应的光谱。这里呈现的图像处理采用基于Matlab软件是免费提供:omnispect.bme.gatech.edu。如果数据采集采用全方位喷雾源，萤火虫数据的转换软件是用来创建多维数据集的图像可视化在BioMAP（www.maldi msi.org）。
2. 所记录的色谱对于数据上JEOL AccuTOF。质谱仪收购，必须出口。CDF格式进行进一步的分析。
   1. 使用DataManager的内MassCenter，首先将采集的数据到centroided数据（工具→习得数据转换重心）。然后将数据导出。CDF格式通过使用键盘组合键Ctrl + Shift + E键FOL然后再由"工具"→"导出。
3. 上传原料CDF质谱数据和两个文本文件，位置和时间，的OmniSpect网站。萤火虫处理的图像数据可以可视化BioMAP。
   1. 可以直接在网站上进行进一步处理的数据包括非负矩阵分解的统计分析或绘制一个单一离子的利益。
   2. 另外，原始数据立方体可以导出在Matlab分析。

结果

图3示出了代表性的频谱得到的未经处理的大鼠的脑切片。质谱在正离子模式，主要是由于其高离子化效率（归因于带正电的季铵基团）的磷脂酰胆碱。组织切片的总离子图像也显示在图3中 ，示出在整个脑切片的丰富的信号。通过文献比较表1主要血脂检测确定。

例如血脂的空间分布（ 图4）显示不同的卵磷脂物种的相对丰?...

讨论

DESI源的几何形状的优化MSI实验成功的关键。促进的系统的对应的多个变量直接影响灵敏度和图像分辨率。如果在优化过程中，实验者获得信号有困难，我们建议使用Sharpie笔现货为基准，在幻灯片上绘制红色染料罗丹明6G，M / Z 443，在正离子模式，并产生一个强烈的信号，可用于初始优化。为DESI此外，溶剂的选择是至关重要的灵敏度，分析物传输和电离取决于从表面到所形成的薄膜的被分析物的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura-Finetek	4583	http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile	EMD	AX0156-6	OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome	Thermo Scientific	CryoStar* NX70	Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head	Prosolia Inc.		Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply	Stanford Research Systems, Inc.	PS350/5000V-25W	http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller	Omega		http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview	National Instruments	Version 7.1
Translational stage	Prior Scientific	Optiscan II	http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer	JEOL	JMS-T100LC	Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface