탈착 전기 분무 이온화 질량 분석에 의한 생물 조직의 이미지

요약

탈착 전기 분무 이온화 질량 분석법 (DESI-MS)는 생체 조직 등의 시료는 최소한의 샘플 준비로 이미징 할 수있는 주위 방법입니다. 이온화 프로브 아래에 샘플을 래스터로,이 스프레이 기반 기술은 조직 섹션에서 관심의 분자 기능을 식별 할 수있는 충분한 공간 해상도를 제공합니다.

초록

질량 분석 이미징 (MSI)는 마이크론 규모의 수십 수백에서 생체 조직 조사를위한 높은 특이성과 공간 해상도와 타겟이 불분명 한 분자 정보를 제공합니다. 환경 조건 하에서 수행 할 때, 샘플 전처리 얻은 정보의 높은 품질을 유지하면서 따라서 프로토콜을 단순화, 불필요한됩니다. 탈착 전기 분무 이온화 (DESI)는도 생체 내에서 야외에서 표면의 직접 샘플링을 허용하는 스프레이 기반의 주위 MSI 기술입니다. 소프트웨어 제어 샘플 스테이지와 함께 사용할 경우, 샘플은 DESI 이온화 프로브 아래 래스터 (raster)하고, 시간 영역을 통해 M / Z 정보는 화학 종의 공간적 분포와 상관된다. DESI-MSI 출력의 충실도는 샘플 표면과 질량 분석기의 입구에 대하여 소스 방향과 위치에 따라 달라집니다. 여기서, 우리는 내가 DESI에 대한 조직 섹션을 준비하는 방법을 검토maging 직접 이미지 품질에 영향을 미치는 추가적인 실험 조건. 특히, 우리는 DESI-MSI에 의한 쥐의 뇌 조직 섹션의 이미징을위한 프로토콜을 설명합니다.

서문

질량 분석법에 의해 타겟이 불분명 한 영상은 발견과 가설 생성 응용 프로그램에 대한 화학 물질 정보의 취득을 용이하게합니다. 반면에 관심 알려진 화학 물질의 대상 영상은, 특정 방법 개발을 통해 증가 된 감도와 선택성을 용이하게 할 수 있습니다. 질량 분석 이미징 (MSI)은 가장 일반적으로 MALDI, ¹ 차 이온 질량 분석 (SIMS), ^2, 탈착 전기 분무 이온화 (DESI), ³ 레이저 절제 - 전기 분무 이온화 (LAESI), ⁴ 등 주변 이온화 기술을 ^사용하여 조직에서 수행됩니다 ^5와 MALDI 및 SIMS 액체 마이크로 접합 표면 샘플링 프로브 (LMJ-SSP). ^6, 샘플은 물리적 표본에서 제거 할 수 있고, 그들이 높은 진공 하에서 분석으로, 평평하고 얇은해야합니다. MALDI는 샘플 준비에 추가 번거로운 단계를 추가, 방사선 흡수 행렬 샘플의 코팅이 필요합니다. SIMS높은 측면 해상도를 가지고 있지만, 고 에너지 입자 충격은 광범위한 분자 분열의 원인이됩니다. 최소한의 샘플 준비 소프트 분석은 바람직한 곳에 따라서 주위 방법으로 MSI는 틈새 시장을 입력합니다. 그러나 현재까지의 모든 방법은 여전히​​ 평평한 시료 표면의 요구 사항에 의해 제한됩니다.

DESI는 분석을 탈착 이온화 시료 표면에 지시 공압 보조 충전 용매 스프레이를 사용합니다. ^7은 DESI에 의해 탈착 이후의 이온화에 대한 작업 모델은 "픽업 모델 물방울"로 알려져있다. ^8-10 청구 기본 방울 DESI 프로브에 의해 생성하면 습윤 및 분석은 고체 - 액체 microextraction 메커니즘에 의해 표면에서 추출한 물질을 포함하는 보조 방울의 운동량 전달 이륙 ⁸ 후속 물방울 충돌 결과를 용해되는에 얇은 피막을 형성, 표면과 충돌 . ^9,10 결국, 가스,위상 이온은 그러나 DESI의 정확한 이온 형성 과정이 실험적으로 입증 아직까지 이온 증발 충전 잔류 모델이나 다른 모델 ¹¹ 다음 ESI 같은 과정을 통해 생산 될 것으로 추정된다. ¹² DESI 감도의 용해도에 따라 크게 의존합니다 스프레이 용매 분석은 탈착으로 지역화 된 microextraction에 의존합니다. ¹³

소프트웨어 제어 샘플 스테이지와 함께 사용할 경우, 샘플은 차선 DESI 이온화 프로브 아래에 단계별로 단일 방향 스캔 및 시간 도메인을 통해 M / Z 정보는 화학 종의 공간 분포 (그림 1)과 상관 관계가있다. 2006 년 밴 Berkel이와 Kertesz에 의해보고 된 원칙 DESI-MSI 실험의 첫 번째 증거 때문에, ¹⁴ 기술은 지질의 분석, ^3,16 약물 대사, ^17,18 disea에서보고 응용 프로그램과 상당히 ¹⁵ 성숙SE 생체, ¹⁹ 뇌 조직, ^3,18,20 폐 조직, ¹⁸ 신장 조직, ¹⁸ 고환 조직, ¹⁸ 부신, ¹⁷ 얇은 층 크로마토 그래피 판, ²¹ 조류 ​​표면. DESI-MSI에 의해 얻어진 이미지 ²² 일상적인 해상도는 궁극적으로 스프레이 추출 된 유효 면적에 의해 결정되지만, 40 μM의 낮은 해상도가보고되었습니다 100-200 μm의. ^23-25 ​​이러한 해상도와 분석의 용이성은 신속하고 간단한 분석을위한 적절한 DESI - MSI 수 있습니다 소중한 공간 정보의 취득이 더 생물학적 과정에게 ²⁶ 이해 할 수 있도록 0.5-5 cm ² 범위의 표면 영역과 생물학적 조직 샘플의. 여기에 일반적인 DESI - MSI 응용 프로그램의 예로서, 우리는 쥐의 뇌 조직에서 지질의 이미지를 포함하는 성공적인 실험을 수행의 절차 세부 사항을 검토합니다. 프로토콜 두 가지 가장 중요한 단계입니다아래에 설명 된대로 조직의 준비 ²⁷ DESI 이온 소스 최적화.

프로토콜

1. 단면 조직

1. 스토어 단면 준비까지 -80 ° C 냉동고 플래시 냉동, 전체 조직.
2. 조직 샘플 (30 분) 단면 전에 cryomicrotome의 온도에 도달 할 수 있습니다. -30 ° C.에 블레이드와 샘플 온도를 설정
3. 일단 조직, 핀셋으로 시료를 처리, 온도에 도달 무엇 두뇌의 부분은 (즉, 뇌의 앞쪽이 가장 중요 경우, 뇌의 뒤쪽 마운트 충분한 장착면에 대한 관심의에 따라 두뇌의 앞뒤를 잘라있다 척에).
   1. 이 응고 할 때까지 중앙 척에 ~ 0.5 ML 최적의 절삭 온도 화합물 OCT (, 조직 테크, 사쿠라)을 적용하고, 핀셋을 사용하여 OCT의 장소에서 샘플을 누릅니다. 일단 10월이 완전히 샘플 홀더에 마운트 척이 고정됩니다.
   2. 샘플을 마운트하는 데 사용의 OCT 최소 금액은 OCT (의 블록에 시험편을 장착 대조적으로 일반적으로 다른 조직을에서 수행하는 것이 좋습니다샘플의 오염을 최소화하기 위해 논리적 절차). OCT에서 샘플의 오염 DESI 및 이온 억제로 인해 이미징 프로세스에 해로운 것입니다.
4. 두께 12 ~ 18 ㎛ 인 MS 이미징 범위에 필요한 일반적인 조직 섹션을 참조하십시오. 권장 범위 내에서 원하는 두께로 섹션 조직. 가볍게 섹션을 통해 실내 온도 현미경 유리 슬라이드를 터치하여 각각의 단면 조직을 해동 마운트합니다. 샘플을 설치 한 후에는 화학적 분포 및 구성을 변경하므로, 조직 부분을 만지지 않도록주의하십시오.

참고 : 우리는 하나의 최적화를위한 섹션 및 이미징을위한 기타를 사용하여 슬라이드 당 두 개의 섹션을 장착 좋습니다. 섹션 슬라이드 상자에 ° C의 냉동고까지 -80에서 즉시 영상, 상점 슬라이드에 대한 분석을위한 준비가되지 않습니다. 경우

5. 저장된 섹션을 분석하면, 냉장고에서 슬라이드를 제거, 즉시 진공 건조기로 전송하고, 수 ~ 15-20해동 분. 이상 데시 케이 터에서 표본을 남겨 두는 것은 시료를 건조하고 데시 효율성을 줄일 수 있습니다. 그것은 시간의 관심, 그러나, 해동되면 DESI 이온 소스의 최적화가 조직 샘플에 수행됩니다, 샘플을 해동되는 동안 기간은 장비의 초기화를위한 이상적인 시간을 제공합니다.
   1. 용매 DESI로 1 % 아세트산 아세토 니트릴을 사용하여 5 μL / min의 유량 주사기 펌프를 켭니다. 낮은 유량 DESI 스프레이하고 효과적인 픽셀 크기의 영향 자리면을 줄일 수 있지만, 높은 유량은 충분한 감도 필요할 수 있습니다. 따라서 유량 (일반적으로 1-5 μL / 분) 각 응용 프로그램에서 원하는 감도와 해상도에 맞게 최적화해야한다. 주사기 주어진 유량 완전한 최적화 및 이미징을위한 충분한 용매 포함되어 있는지 확인합니다.
   2. 용매가 소스 끝에서 떨어지는 나타나면 pressur을 가진 질소 nebulizing 가스를 켜십시오160 PSI의 전자.
   3. 3,600 적용 이온 소스에 연결된 고압 전원 공급 장치의 전원을 켭니다 V.
6. 모션 무대에서 슬라이드를 마운트 이온 소스 및 MS 최적화를 시작합니다

2. DESI 최적화

1. DESI 시스템은 소스 프로브 (그림 2 참조), 주사기 펌프 또는 다른 용매 전달 시스템, 압축 질소, 번역 샘플 무대와 산으로 구성되어 있습니다. 질량 분석기가 적절한 질량 범위 및 그 분석을 위해 조정 된 후 DESI 소스 최적화를 진행합니다.
   1. 소스 구성 요소가 아직 켜져 있지 않은 경우, 방향에 대한 섹션 1.5.1-3를 참조하십시오.
   2. 이 섹션에서 설명 변수는 생물학적 조직의 이미징을위한 권장됩니다. 그러나 이러한 변수는 조직 또는 샘플의 다른 유형을 위해 최적화되어야한다. 다른 용매, 유량, nebulizing 가스 압력과 전압은 이마 기 위해보고 된 바있다생물 조직의 NG. ^16-18
2. 처음 DESI 소스가 유리 슬라이드에 닿지 않도록하고, 조직 섹션의 어떤 부분에 지시되지 않았는지 확인합니다. 이 프로브가 초기 최적화 과정에서 손상되지 않고 조직 샘플과 접촉하여 집합의 모든 부분을 오염되지 않도록합니다.
   1. 좋은 시작 위치는 55의 각도 프로브 팁의 샘플 표면에서 3mm와 MS 모세관 입구에서 5mm, ° 시료 표면에 대하여에이다. DESI 프로브의 내부 모세관는 외부 모세관 이상 ~ 1mm를 확장해야합니다. 이러한 매개 변수가 모두 최적화됩니다.
3. 모세관 MS 인터페이스는 이온의 최적 전송을위한 시료 표면에 대하여 ~ 15 °의 컬렉션 각도를해야한다. 모세관 최대한 가까이, 표면 :​​ <1 mm 이상이어야한다 시료 표면 MS 모세관 놓으면 그렇게하는 단계 높이를 조정건드리지 않고.
4. 그들은 직접 라인에 있도록 MS 모세관 입구에 대하여 X 치수에 DESI 프로브를 맞 춥니 다.
5. 여분의 조직 섹션을 사용하여 최적의 감도 DESI 소스의 y 및 z 위치를 조정합니다. DESI 프로브가 하나의 샘플 영역에 지시하기 때문에, 결국 탈착이 발생할 때 그 지역 및 신호 분석의 모든 점차 감소 할 이온화 것을 유의하십시오. 이 단계를 가능한 한 빨리 수행하는 것이 중요합니다.
   1. 따라서, 최적화 과정을 통해, 샘플 신선한 샘플 신호 변경 소스 최적화되지 샘플 고갈로 인한 것으로 분석되고 있음을 보장하기 위해 스프레이 헤드 아래로 이동해야합니다. 그러나 조직의 다른 지역의 다양한 화학 조성, 전체 조직 섹션에 걸쳐 이온 강도의 직접적인 비교가 완전히 정확하지 고려. 뇌의 시상과 합리적 대형 영역을 제공보다 일관성있는 화학 성분,하지만 여전히 완벽하게 균일하지. 또한, 염료 로다 민을 포함 붉은 빈틈, 마킹 세대 ([M] ^+, M / Z 443), 멀리 샘플에서 유리 슬라이드에 DESI하여 강력한 MS 응답을 제공하며 최적화를 위해 사용할 수 있지만 다른 샘플 양식 분석 주어, 이러한 조건은 여전히​​ 생물학적 조직을위한 셋업 이상으로 연관되지 않을 수 있습니다.
   2. 소스 팁과 모세관 입구 사이에 권장 y를 분리 : 1 ~ 4 mm의 팁과 시료 표면 사이의 권장 Z 분리 : ~ 1.5 mm. 이러한 매개 변수는 각각의 실험 셋업이 약간 다를 수 있지만.
   3. 프로브의 형상과 각도를 고려, Y 및 Z 차원 위치가 용매 분석 함유 방울의 효과적인 전송에 대하여 상호 관련되어 있음을 고려. 한 변수의 변화는 같은 스프레이 충격력의 위치를​​ 유지하기 위해 기타 국가에서 후속의 변경이 필요합니다의 전송 각도.
6. 거리에게 최대 감도, 최소한의 영향을 미치는 점 크기에 대한 소스의 외부 모세 혈관의 내부 모세관 돌출을 조정합니다. 주의 :이 조정을하는 동안 높은 전압이 OFF인지 확인하십시오.
7. 최대 신호가 관찰 될 때 소스 형상 최적 간주됩니다.
   1. 섹션 2.5-2.6에서 최적화 변수 간 관련 있으며, 따라서 하나의 조정은 본질적으로 다른 재 조정이 섹션에서 설명한 필요한 소스 샘플 입구 형상이나 조건의 조정 1.5.1을 유지하기 위해 필요합니다 3.
8. 또한, 질량 분석기에 모세관 전송을 둘러싼 가열 요소는 이온화 과정에서 생성 된 청구 분석 방울의 desolvation을 촉진하여 감도를 향상시킬 수 있습니다. 여기에 우리가 로프 히터를 사용하여 전송 주위에 코일 100 ° C로 설정 모세관

3. TISSU전자 이미징

1. 이미징 프로세스 중에 샘플 단계는 모세관 DESI 프로브와 MS 입구 아래 샘플을 이동하고 다른 모든 구성 요소은 고정 된 상태로 유지됩니다. 무대의 움직임 매개 변수는 DESI 영향 깃털 크기와 최적의 감도에 따라 선택해야합니다.
   1. 큰 충격 깃털 그러나 영상을 위해, 그것은 또한 더 큰 픽셀 크기 때문에 나쁜 이미지 해상도가 발생합니다, 더 많은 샘플이 탈착되고 주어진 높은 이온 강도가 발생합니다.
2. 이 실험에 사용 된 번역 단계는 홈 구축하고 주어진 크기의 이미지 속도와 줄 간격을 래스터를 제어 할 수있는 LabVIEW 프로그램에 의해 제어됩니다. 이 실험에서 사용 된 무대 모션 컨트롤 VI는 omnispect.bme.gatech.edu에서 사용할 수 있습니다. 또한, 상용 DESI 소스와 무대 등 Prosolia 사의 2D 자동화 옴니 스프레이 소스 (인디애나 폴리스, 미국)로 사용할 수 있습니다.
   1. 뇌 조직에 대한일반적인 이미지 크기는 10 × 15mm, 및 사용 단계 동작 매개 변수를 주어, 이미지가 약 3 시간이 소요됩니다.
      1. 프로그램은 LabVIEW VI 또는 원하는 영상 조건에 해당하는 제어 소프트웨어, 무대 스캔 80 μm의 속도 / 초, 200 μM의 행 사이의 줄 간격을 사용하여. 옴니 스프레이 소스를 사용하는 경우 동작 매개 변수는 100-200 μm의 / 초 스캔 속도와 200 ㎛의 줄 간격에 대해 설정해야합니다. 이러한 동작 매개 변수는 각 차원에 필요한 감도 원하는 픽셀의 수에 따라 변경 될 수 있습니다.
         1. 작은 줄 간격은 스캔 속도가 영향을 덜 갖는, 이미지 품질을 개선하기 위해 표시되었습니다. ²⁵ 그러나, 이것은 반드시 표시하고 향상된 이미지 해상도를하지 않는 것을주의하는 것이 중요하다 그와 같은 영향을 미치는 자리에 크게 의존 크기입니다. 느린 스캔 속도와 작은 줄 간격이 크게 분석의 시간이 증가하고 따라서 optimi해야합니다조직 또는 샘플의 각 유형에 대한 데이빗.
      2. 줄 간격은 Y 차원의 픽셀 크기를 결정하는 반면 MS 스펙트럼 인수를 1로 설정하여 스캔 / 초, 1 픽셀 / 스캔으로 생성 된 이미지, 무대 속도가 X 차원의 픽셀 크기를 정의합니다. 이미지의 실제 픽셀 크기가 퍼지는 스프레이 할이 때문에보다 큰이지만, 느린 움직임은 탈착 분석의 검출에 더 많은 시간을 허용합니다.
   2. 디렉토리 경로와 LabVIEW VI에서 이미지 동안 기록 할 위치와 시간을 파일의 파일 이름을 지정합니다.
3. 질량 스펙트럼 데이터 수집을위한 준비, 이미징에 필요한 총 시간을 계산합니다. 우리 그룹에서 사용하는 LabVIEW 프로그램이 자동으로이 값을 제공하지만 다른 단계 제어를 사용하는 경우,이 계산은 MS 데이터 수집 설정이 필요합니다.
   1. 옴니 스프레이 자동화 된 소스와 단계를 사용하는 경우, 이미지의 각 라인과 같이 취득분리 된이 실행됩니다. 시간 당 라인과 주어진 영상 크기에 필요한 회선 수는 질량 분석기 소프트웨어에 입력 할 옴니 스프레이 제어 소프트웨어를 사용하여 계산됩니다.
4. 질량 분석기 스캔 속도가 1 스펙트럼 / 초 있는지 확인하고 계산 된 총 시간을 일치하도록 악기 수집 시간을 설정합니다.
   1. 스펙트럼 스캔 속도 1 스펙트럼 / 초로 설정합니다.
   2. PROFILE 모드에서 데이터를 수집하고 M / Z 범위는 그 종에 적합한 지 확인합니다. 그 DESI는 ESI와 같이 곱셈 청구 분석을 생산하고 기억한다.
   3. LabView를에 의해 주어진 총 이미지를 시간에 맞게 수집 시간을 설정합니다.
5. 이미지에 표시 할 영역의 왼쪽에있는 스프레이 영향 자리를 배치합니다.
6. 동시에 MS 데이터 및 단계 운동의 획득을 시작합니다.
7. 데이터 수집의 결론에 따라, 대기 모드로 질량 분석기를 반환합니다.
8. DESI 소스의 높은 전압의 전원을 끕니다.
9. (을)를 돌려FF 질소 가스.
10. 주사기 펌프를 끕니다.

4. 이미지 처리

1. 질량 스펙트럼 데이터, 무대 시간과 LabView를 통해 텍스트 파일로 저장된 위치 데이터와 함께 해당 스펙트럼을 가진 픽셀의 좌표를 상호 연관 2D 이미지로 "접힌"해야합니다. omn​​ispect.bme.gatech.edu : 여기에 제시된 이미지에서 자유롭게 사용할 수 있습니다 Matlab을 기반으로 소프트웨어를 사용하여 처리 하였다. 데이터 옴니 스프레이 소스를 사용하여 취득하는 경우, 반딧불 데이터 변환 소프트웨어는 BioMAP (www.maldi-msi.org)의 이미지 시각화를위한 데이터 큐브를 만드는 데 사용됩니다.
2. JEOL AccuTOF 질량 분석기에서 수집 된 데이터의 경우, 기록 된 크로마토 그램은 추가 분석을 위해. CDF 형식으로 내보낼 수 있어야합니다.
   1. MassCenter 내 DataManager에를 사용하여 첫 번째 centroided 데이터 (도구 → 중심으로 투자 법인 데이터를 변환)에 수집 된 데이터를 변환합니다. 그런 다음 키보드 조합 Ctrl + Shift + E FOL을 사용하여. CDF 형식으로 데이터를 내보낼도구 → 수출에 의해 lowed.
3. OmniSpect 웹 사이트에 원료. CDF 질량 스펙트럼 데이터를 두 개의 텍스트 파일의 위치와 시간을 업로드 할 수 있습니다. 반딧불 처리 된 영상 데이터는 BioMAP으로 시각화 할 수 있습니다.
   1. 음수가 아닌 매트릭스 인수 분해에 의한 통계 분석을 포함하거나 관심의 단일 이온의 플롯 데이터의 추가 처리는 웹 사이트에서 직접 수행 할 수 있습니다.
   2. 또는 원시 데이터 큐브 매트랩 분석을 위해 내보낼 수 있습니다.

결과

그림 3은 치료 쥐의 뇌 부분에서 얻은 대표적인 스펙트럼을 보여줍니다. 긍정적 인 모드 질량 스펙트럼은 자신의 이온화 효율 (양전하 차 암모늄 그룹에 의한)에 의한 phosphatidylcholines에 의해 지배된다. 조직 섹션의 총 이온 이미지는 뇌 전체 영역에 걸쳐 풍부한 신호를 보여주는 그림 3에 나와 있습니다. 검색 키 지질은 문학의 비교를 표 1에 식별됩니다.

토론

DESI 소스 형상의 최적화는 성공적인 MSI 실험을 위해 중요합니다. 시스템의 정렬에 기여하는 여러 변수를 직접 감도와 이미지 해상도에 영향을 미칩니다. 최적화하는 동안, 실험 신호를 얻기 어려움이있는 경우에, 우리는 벤치 마크 슬라이드에 그려진 빨간색 빈틈 자리를 사용하는 것이 좋습니다, 염료, 로다 민 6G, m / Z 443, 양이온 모드에서 강한 신호를 생성하고 사용할 수 있습니다 초기 최적화. ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura-Finetek	4583	http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile	EMD	AX0156-6	OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome	Thermo Scientific	CryoStar* NX70	Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head	Prosolia Inc.		Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply	Stanford Research Systems, Inc.	PS350/5000V-25W	http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller	Omega		http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview	National Instruments	Version 7.1
Translational stage	Prior Scientific	Optiscan II	http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer	JEOL	JMS-T100LC	Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface