Imagem de tecidos biológicos por dessorção ionização electrospray Espectrometria de Massa

Resumo

Dessorção de espectrometria de massa com ionização por electropulverização (DESI-MS) é um método pelo qual as amostras do ambiente, incluindo os tecidos biológicos, pode ser trabalhada com a preparação da amostra mínima. Por rastering a amostra abaixo da sonda de ionização, esta técnica baseada em pulverizador fornece resolução espacial suficiente para discernir as características moleculares de interesse dentro de cortes de tecido.

Resumo

Espectrometria de massa de imagem (MSI) fornece informações molecular segmentados com a maior especificidade e resolução espacial para a investigação de tecidos biológicos para as centenas para dezenas de escala de microns. Quando realizada sob condições ambiente, o pré-tratamento da amostra torna-se desnecessário, simplificando assim o protocolo, mantendo a elevada qualidade das informações obtidas. Dessorção de ionização por electrospray (DESI) é uma técnica baseada em MSI ambiente de pulverização, que permite a amostragem directa das superfícies, ao ar livre, mesmo in vivo. Quando usado com uma fase de amostra controlado por software, a amostra é rastered debaixo da sonda de ionização de DESI, e através do domínio do tempo, m / z informação é correlacionada com a distribuição espacial da espécie química ". A fidelidade da saída DESI MSI depende da orientação da fonte e do posicionamento em relação à superfície da amostra e uma entrada de espectrómetro de massa. Aqui, nós revisamos como preparar cortes de tecido para DESI imaging e condições experimentais adicionais que afetam diretamente a qualidade de imagem. Especificamente, nós descrevemos o protocolo para a imagem de cortes de tecidos de cérebro de rato por desi-MSI.

Introdução

Imagem não segmentados por espectrometria de massa facilita a aquisição de informações químicas para aplicações de descoberta e hipótese de geração. Imaging alvo de uma substância química conhecida de interesse, por outro lado, pode facilitar o aumento da sensibilidade e seletividade através de desenvolvimento de método específico. Espectrometria de massa de imagem (MSI) é mais comumente realizada em tecidos utilizando MALDI, ^uma espectrometria de massa de íons secundários (SIMS), ² e técnicas de ionização ambiente, incluindo dessorção ionização electrospray (DESI), ^3-ablação a laser de ionização electrospray (LAESI), ^{4, 5} e líquido micro-junção da superfície Sonda (LMJ-SSP). ⁶ Em MALDI e SIMS, as amostras têm de ser fisicamente removido do espécime, e tem que ser plana e fina, como são analisados ​​sob alto vácuo. MALDI requer revestimento da amostra com uma matriz de absorção de radiação, a adição de um passo adicional e pesado para a preparação da amostra. SIMStem a mais alta resolução lateral, mas o bombardeamento com partículas altamente energéticas provoca a fragmentação molecular grande. Portanto, a MSI por métodos ambientais preencher um nicho onde a análise macio com a preparação da amostra mínima é desejável. No entanto, até à data, todos os métodos são ainda limitada pela exigência de superfícies de amostras planas.

DESI usa um spray solvente carregada pneumaticamente assistida dirigido para a superfície da amostra para desadsorver e ioniza analitos. ⁷ O modelo de trabalho para a dessorção e ionização por subsequente DESI é conhecida como a "gota de pick-up model". ^8-10 As gotículas carregadas primárias produzido pela sonda DESI colidem com a superfície, e molhando-formação de uma película fina em que o analito é dissolvido por um mecanismo microextracção sólido-líquido ⁸ subsequente gota resultam em colisões de transferência de momento e descolagem de gotículas secundárias contendo o material extraído da superfície . ^9,10 Finalmente, o gásiões de fase são acreditados para ser produzido através de processos como a ESI-após evaporação de iões, os modelos de resíduos de carga ou de outros modelos, ¹¹ no entanto, o processo de formação de iões preciso em DESI ainda tem que ser comprovada experimentalmente. sensibilidade ¹² DESI é fortemente dependente da solubilidade do analito em solvente do pulverizador, como dessorção depende do microextracção localizada ^13.

Quando usado com uma fase de amostra controlado por software, a amostra é analisada unidireccionalmente com pista pisar debaixo da sonda de ionização de DESI, e através do domínio do tempo, m / z informação é correlacionada com a distribuição espacial da espécie química "(Figura 1). Desde a primeira prova de princípio experimento DESI-MSI relatado por Van Berkel e Kertesz em 2006, ¹⁴ a técnica amadureceu consideravelmente, ¹⁵ com aplicações relatadas na análise de lipídios, ^3,16 metabólitos de drogas, ^17,18 doenbiomarcadores si, ¹⁹ tecido cerebral, ^3,18,20 tecido pulmonar, ^{18 de} tecido do rim, ^{18 de} tecido testicular, ¹⁸ glândulas supra-renais, ¹⁷ placas de cromatografia em camada delgada, ²¹ e superfícies de algas. ²² A resolução rotina de imagens obtidas por DESI-MSI é 100-200 um, que é finalmente determinada pela área de superfície efectiva extraída pelo spray, mas resoluções tão baixo como 40 um foram relatados. ^23-25 ​​Tal resolução e facilitar a análise torna-DESI MSI adequado para a análise rápida e simples de amostras de tecidos biológicos com áreas de superfície na faixa de 0,5-5 cm ^2, permitindo a aquisição de informação espacial valioso para entender melhor os processos biológicos ^26. Aqui, como um exemplo de uma aplicação típica DESI-MSI, vamos rever os detalhes processuais da realização de uma experiência bem sucedida envolvendo imagens de lipídios nos tecidos de cérebro de rato. As duas etapas mais críticas do protocolo são apreparação de tecido ²⁷ e DESI optimização fonte de iões, tal como descrito abaixo.

Protocolo

1. Tissue Seccionamento

1. Loja de tecidos flash-congelado, inteiro em freezer -80 ° C até que esteja pronto para o corte.
2. Permitir que a amostra de tecido para atingir a temperatura no cryomicrotome antes de seccionamento (30 min.) Conjunto da lâmina e a temperatura da amostra a -30 ° C.
3. Uma vez que o tecido tenha atingido a temperatura, a manipulação da amostra com uma pinça, corte frontal ou traseira do cérebro, dependendo de qual parte do cérebro é de interesse para montagem em superfície suficiente (ou seja, se a parte frontal do cérebro é de primordial importância, monte traseira do cérebro por chuck).
   1. Aplicar ~ 0,5 ml Optimal Cutting Composto Temperatura (OCT, Tissue-Tek, Sakura) para chuck no centro e, usando uma pinça, segure amostra no lugar em outubro, até ela se solidifica. Uma vez que outubro está completamente congelado, montagem do mandril no suporte da amostra.
   2. Uma quantidade mínima de outubro usado para montar a amostra é preferido (em contraste com a montagem do espécime num bloco de outubro como é feito geralmente na outra histoprocedimentos lógicos) para minimizar a contaminação da amostra. A contaminação da amostra por OCT é prejudicial para o processo de gravação e DESI devido à supressão de iões.
4. Cortes de tecidos típicos necessários para Range Imaging MS 12-18 m de espessura. Tecidos seção na espessura desejada dentro da faixa recomendada. Descongele montar cada tecido seccionado tocando levemente a temperatura ambiente lâmina de vidro sobre a seção. Uma vez que uma amostra é montada, tenha cuidado para não tocar a secção de tecido, uma vez que irá alterar as distribuições e composições químicas.

Nota: Recomendamos a montagem de dois pontos por slide, usando uma seção para a otimização, eo outro para a imagem latente. Se seções não são para a imagem imediato, armazenar lâminas de -80 ° C freezer em uma caixa de slides até que esteja pronto para análise.

5. Se analisar seções armazenadas, remova slide freezer, transferir imediatamente para exsicador de vácuo, e permitir ~ 15-20min para descongelar. Deixando o espécime no exsicador mais vai secar a amostra e reduzir a eficiência DESI. A optimização da fonte de iões de DESI será feito com a amostra de tecido, uma vez que foi descongelado, no entanto, no interesse de tempo, o período durante o qual a amostra é descongelamento serve como um tempo ideal para a inicialização do equipamento.
   1. Usando acetonitrilo com 1% de ácido acético como solvente de DESI, ligar a bomba de seringa, com uma taxa de fluxo de 5 ul / min. Uma taxa de fluxo mais baixa irá reduzir lado do pulverizador DESI e tamanho efectivo de pixel local de impacto, mas uma taxa de fluxo mais elevada pode ser necessário para a sensibilidade suficiente. Portanto, a taxa de fluxo (tipicamente 1-5 mL / min) devem ser otimizados para cada aplicação e a sensibilidade ea resolução desejada. Certifique-se de que a seringa contém solvente suficiente para a otimização completa e imagem em determinada vazão.
   2. Uma vez que o solvente aparece pingando da ponta fonte, ligue o gás nitrogênio nebulização com um pressure de 160 psi.
   3. Ligue a fonte de alimentação de alta tensão ligado a fonte de íons de aplicar 3.600 V.
6. Montar o slide no palco de movimento e começar a fonte de íons e MS otimização

2. DESI Otimização

1. O sistema DESI consiste de uma sonda de origem (ver Figura 2), uma seringa e uma bomba ou sistema de entrega de solvente alternativo, nitrogênio comprimido, estágio da amostra tradução e montagem. Prossiga com a otimização fonte DESI uma vez que o espectrômetro de massas foi ajustado para o intervalo e analitos de interesse massa apropriada.
   1. Se os componentes de origem não ter sido ligado, no entanto, referem-se às seções 1.5.1-3 para direções.
   2. As variáveis ​​discutidas nestas secções são recomendados para a imagiologia de tecidos biológicos. No entanto, estas variáveis ​​devem ser otimizados para diferentes tipos de tecido ou amostra. Solventes alternativos, vazões, pressões de gás de nebulização e tensões têm sido relatados por imaginaçãong de tecidos biológicos ^16-18.
2. Certifique-se de que, inicialmente, a fonte de DESI não está tocando a lâmina de vidro, e não dirigida a qualquer parte da secção de tecido. Isto irá assegurar que a sonda não seja danificado no processo de optimização inicial e não contaminará qualquer parte do conjunto se ao entrar em contacto com a amostra de tecido.
   1. Um bom ponto de partida é, com a ponta 3 mm da superfície da amostra e 5 mm a partir da entrada capilar MS, com a sonda a um ângulo de 55 ° em relação à superfície da amostra. O capilar interna da sonda DESI deve estender ~ 1 mm para além do capilar exterior. Todos esses parâmetros serão otimizados.
3. A interface MS capilar deve ter um ângulo de recolha de ~ 15 ° em relação à superfície da amostra de transferência óptima de iões. Ajustar a altura da fase de modo que os capilares MS paira sobre a superfície da amostra, o capilar deve ser <1 mm a partir da superfície, o mais próximo possívelsem tocar.
4. Alinhar a sonda DESI na dimensão x com respeito à entrada de MS capilar de modo a que eles estão directamente em linha.
5. Ajuste as yez posições da fonte de DESI para a sensibilidade ideal usando a seção de tecido extra. Note-se que como a sonda de DESI é dirigida a uma área da amostra, que irá, eventualmente, s sorver e ionizar todos os analitos em que a área e o sinal irá diminuir gradualmente como esta ocorre. Executando esta etapa tão rapidamente quanto possível, é importante.
   1. Por conseguinte, durante todo o processo de optimização, a amostra tem de ser movido por baixo da cabeça de pulverização para garantir que a nova amostra está a ser analisada e que quaisquer alterações no sinal são devidos a optimização fonte, não depleção da amostra. No entanto, considerando-se que a composição química variada de diferentes regiões do tecido, uma comparação directa da intensidade de iões através da secção de tecido inteiro não é totalmente precisa. O tálamo do cérebro fornece uma área razoavelmente grande porte comcomposição química mais consistente, mas ainda não é perfeitamente uniforme. Alternativamente, uma marcação de Sharpie vermelho, que contém o corante rodamina 6G ([M] ^+, m / z 443), sobre a lâmina de vidro longe da amostra fornece uma resposta forte por MS de DESI, e também pode ser utilizado para a optimização, mas dada a forma diferente da amostra e do analito, estas condições ainda não se correlacionam com um set-up ideal para tecidos biológicos.
   2. Recomendado separação y entre a ponta da fonte e entrada capilar: ~ 4 mm, separação z recomendado entre a ponta ea superfície da amostra: ~ 1,5 mm. Embora estes parâmetros será um pouco diferente para cada experimental set-up.
   3. Considerando a geometria e no ângulo da sonda, levar em conta que as posições z-y e dimensão estão inter-relacionados no que diz respeito à transmissão eficaz de gotas de solvente e do analito contendo. Uma alteração numa variável exige uma modificação ulterior no outro para manter a mesma posição de impacto e de pulverizaçãoseus ângulos de transmissão.
6. Ajuste a distância das extrusões capilares internas do capilar exterior da fonte para o máximo de sensibilidade, e o tamanho do ponto de impacto mínimo. Atenção: Certifique-se de que a alta tensão é OFF ao fazer este ajuste.
7. A geometria da fonte será considerado óptimo quando o sinal máximo é observado.
   1. As variáveis ​​otimizadas nas seções 2,5-2,6 estão inter-relacionados, portanto, o ajuste de um vai inerentemente requer o reajuste do outro para manter a geometria necessária fonte-sample-entrada, ou ajuste de condições discutido na seção 1.5.1- 3.
8. Além disso, um elemento de aquecimento em torno da transferência capilar para o espectrómetro de massa pode melhorar a sensibilidade, facilitando dessolvatação das gotículas carregadas de analito obtidos durante o processo de ionização. Aqui usamos um aquecedor corda enrolada em torno da transferência capilar definido para 100 ° C.

3. Tissue Imagem

1. Durante o processo de gravação, a fase de amostra move-se a amostra por baixo da sonda DESI e MS capilar de entrada e de todos os outros componentes permanecem estacionários. Os parâmetros do movimento da fase deve ser seleccionado com base no impacto de DESI tamanho pluma e sensibilidade óptima.
   1. A pluma de maior impacto resultará numa maior intensidade de iões, uma vez que mais de amostra está a ser dessorvida, no entanto, para imagiologia, ele irá também resultar em um tamanho maior do pixel e, assim, piorar a resolução da imagem.
2. O estágio de translação utilizado nesta experiência é o lar construído e controlado por um programa Labview que permite o controlo da velocidade e rastering espaçamento de linha para uma imagem de dimensões dadas. O VI controle de movimento palco utilizado neste experimento está disponível em omnispect.bme.gatech.edu. Em alternativa, uma fonte de DESI comercialmente disponíveis e poderiam ser utilizados fase tal como o 2D automatizado Omni fonte de borrifar Prosolia Inc. (Indianapolis, IN EUA).
   1. Para tecidos cerebrais atamanho típico imagem é de 10 x 15 mm, e tendo em conta os parâmetros de movimento de palco, a imagem vai demorar cerca de 3 horas.
      1. Programa LabView VI ou software de controle equivalente para condições de imagem desejada, usando uma velocidade de fase de digitalização de 80 mM / seg, e espaçamento entre linhas de 200 mM. Ao utilizar a fonte de spray Omni, parâmetros de movimento deve ser definido para uma velocidade de digitalização de 100-200 mM / seg e um espaçamento entre linhas de 200 mM. Note-se que estes parâmetros do movimento podem ser alteradas, dependendo do número de pixels em cada dimensão desejadas e sensibilidade necessárias.
         1. Um espaçamento menor foi mostrado para melhorar a qualidade da imagem, com a velocidade de varredura de ter menos de um efeito. ²⁵ No entanto, é importante notar que isso não necessariamente indicar e melhor resolução de imagem, uma vez que é fortemente dependente do ponto de impacto tamanho. A velocidade de varredura lenta e espaçamento entre linhas menor vai aumentar significativamente o tempo de análise e, portanto, deve ser optimizaçãozado para cada tipo de tecido ou amostra.
      2. Com a aquisição espectral MS fixado em 1 leitura / seg, e a imagem criada como um pixel de / digitalização, a velocidade de fase define o tamanho do pixel na dimensão x, enquanto o espaçamento entre linhas determina o tamanho do pixel na dimensão y. Embora o tamanho do pixel verdadeira da imagem é maior que este, devido à propagação de pulverizar, o movimento mais lento permite mais tempo para a dessorção e detecção de analitos.
   2. Dê caminho do diretório eo nome do arquivo para a posição e tempo de arquivos a serem gravados durante imagens dentro do LabView VI.
3. Na preparação para a aquisição de dados de espectro de massa, calcular o tempo total requerido para a imagem latente. O programa Labview utilizado por nosso grupo fornece automaticamente este valor, mas se controle estádio alternativo é usado, este cálculo é necessário para as configurações de aquisição de dados MS.
   1. Quando se utiliza uma fonte de pulverização e Omni fase automatizado, cada linha da imagem é adquirida como emindivíduo é executado. O tempo por linha e o número de linhas necessárias para determinadas dimensões de imagem são calculados utilizando o programa de controle do pulverizador Omni ser inseridos no software espectrómetro de massa.
4. Certifique-se que a velocidade de verificação espectrômetro de massa é um espectro / seg, e definir o tempo de aquisição de instrumento para coincidir com o tempo total calculado.
   1. Definir espectral velocidade de digitalização de um espectro / sec.
   2. Aquisição de dados em modo PROFILE e garantir que a gama m / z é apropriado para as espécies de interesse. Lembre-se que DESI também produz analitos multiplicam carregadas, como em ESI.
   3. Definir o tempo de aquisição para combinar tempo total da imagem dada pelo LabView.
5. Posicione o ponto de impacto de pulverização no canto superior esquerdo da área a ser trabalhada.
6. Comece a aquisição de dados de MS e de movimento fase simultaneamente.
7. Após a conclusão da aquisição de dados, retornar espectrômetro de massa para o modo standby.
8. Desligue alta tensão da fonte de DESI.
9. Desligue ogás nitrogênio ff.
10. Desligar a bomba de seringa.

4. Processamento de Imagem

1. Dados espectrais de massa, em combinação com a fase de tempo e dados de posição guardadas como ficheiros de texto através LabView deve ser "dobrado" numa imagem 2D correlacionando coordenadas de pixels com os espectros correspondentes. As imagens aqui apresentadas foram processadas utilizando o software baseado em Matlab que está disponível gratuitamente em: omnispect.bme.gatech.edu. Se os dados são adquiridos por meio da fonte de pulverização Omni, o software de conversão de dados do vaga-lume é usada para criar o cubo de dados para a visualização da imagem em BioMAP (www.maldi-msi.org).
2. Para os dados adquiridos na Jeol AccuTOF espectrômetro de massa, o cromatograma registrado devem ser exportados em formato cdf., Para posterior análise.
   1. Usando o DataManager dentro MassCenter, primeiro converta os dados adquiridos aos dados centroided (Ferramentas → converter dados Aquisição de Centroid). Em seguida, exportar os dados em formato cdf. Usando a combinação de teclas Ctrl + Shift + E folseguido pelas Tools → Exportar.
3. Faça o upload dos dados brutos. Cdf massa espectrais e os dois arquivos de texto, posição e tempo, para o site OmniSpect. Dados de imagem Firefly-processados ​​podem ser visualizados em BioMAP.
   1. Processamento adicional dos dados, incluindo análise estatística pelo Fatoração Matrix não-negativo ou plotagem de um único íon de interesse pode ser realizada diretamente no site.
   2. Alternativamente, o cubo de dados brutos podem ser exportados para análise em Matlab.

Resultados

A Figura 3 mostra um espectro obtido a partir de um representante secção de cérebro de rato não tratado. No modo positivo, o espectro de massa é dominada por fosfatidilcolinas, devido às suas elevadas eficiências de ionização (atribuído ao grupo amónio quaternário carregado positivamente). A imagem total de iões da secção de tecido é também mostrada na Figura 3, que mostra o sinal abundante em toda a secção do cérebro inteiro. Lípidos chave detectados são identific...

Discussão

A otimização da geometria de origem DESI é fundamental para as experiências bem-sucedidas MSI. As múltiplas variáveis ​​que contribuem para o alinhamento do sistema de afectar directamente a sensibilidade e resolução de imagem. Se durante a optimização, o experimentador tem dificuldades na obtenção do sinal, é recomendável usar mancha vermelha Sharpie desenhada na corrediça, como um valor de referência, o corante, a rodamina 6G, m / z 443, produz um forte sinal no modo de ião positivo e pode ser usa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura-Finetek	4583	http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile	EMD	AX0156-6	OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome	Thermo Scientific	CryoStar* NX70	Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head	Prosolia Inc.		Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply	Stanford Research Systems, Inc.	PS350/5000V-25W	http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller	Omega		http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview	National Instruments	Version 7.1
Translational stage	Prior Scientific	Optiscan II	http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer	JEOL	JMS-T100LC	Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface