Desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Biyolojik Dokuların Görüntüleme

Özet

Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (DESI-MS) biyolojik dokular dahil olmak üzere örnekler, minimum numune hazırlama ile görüntülenebilir hangi bir ortam yöntemdir. Iyonizasyon probu aşağıdaki örnek rastering tarafından, bu sprey tabanlı teknik doku bölümleri içinde ilgi moleküler özellikleri ayırt etmek yeterli uzaysal çözünürlüğü sağlar.

Özet

Kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) mikron ölçekli onlarca yüzlerce biyolojik dokular araştırmak için en yüksek özgüllük ve uzaysal çözünürlüğü ile hedefsiz moleküler bilgi sağlar. Ortam koşulları altında yapıldığında, numune ön muamele edilen bilgileri ve yüksek kaliteyi korurken bu nedenle protokol basitleştirilmesi, gereksiz hale gelir. Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon (DESI) bile, in vivo olarak, açık havada yüzeylerin direkt örnekleme için izin veren bir püskürtme tabanlı bir ortam MSI tekniktir. Bir yazılım kontrollü numune aşamasında birlikte kullanıldığında, örnek DESI iyonizasyon probu altında rastered edilir ve zaman alanı ile, m / z bilgi kimyasal türlerin mekansal dağılımı ile ilişkilidir. Desi MSI çıkış aslına numune yüzeyi ve kütle spektrometresi girişi ile ilgili olarak kaynak yönlendirme ve konumlandırma bağlıdır. Bu yazıda, ben DESI için doku bölümleri hazırlamak için nasıl gözdenmaging ve doğrudan görüntü kalitesini etkileyen ek deneysel koşullar. Özellikle, DESI-MSI tarafından sıçan beyin dokusu bölümden görüntüleme için protokol açıklar.

Giriş

Kütle spektrometresi tarafından hedefsiz görüntüleme keşif ve hipotez üreten uygulamalar için kimyasal bilgi edinimi kolaylaştırır. Öte yandan, bir ilgi, bilinen kimyasal hedeflenen görüntüleme, özel yöntem geliştirilmesi yoluyla artan bir hassasiyet ve seçiciliğin kolaylaştırabilir. Kütle spektrometrisi görüntüleme (MSI) en çok MALDI, ¹ sekonder iyon kütle spektrometresi (SIMS), ² ve desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon (DESI), ³ lazerle-elektrosprey iyonizasyon (LAESI), ⁴ de dahil olmak üzere, ortam iyonizasyon teknikleri ^kullanarak dokular üzerinde gerçekleştirilir ⁵ ve MALDI ve SIMS sıvı mikro-kavşak-yüzey ölçüm probu (LMJ-SSP). ^6, örnekleri fiziksel olarak numune kaldırılacak var ve yüksek vakum altında analiz olarak, düz ve ince olmak zorunda. MALDI örnek hazırlama için ek ve hantal bir adım ekleyerek, bir radyasyon emici bir matris olan numunenin kaplama gerektirir. SIMSen yüksek yanal çözünürlüğe sahip, ama son derece enerjik parçacıklar ile bombardımanı kapsamlı moleküler parçalanma neden olur. Minimum numune hazırlama ile yumuşak analizi istendiği Bu nedenle, ortam yöntemlerle MSI bir niş doldurun. Ancak, bugüne kadar, tüm yöntemleri hala düz örnek yüzeylerin ihtiyacı ile sınırlıdır.

DESI analit dezorbe ve iyonize için örnek yüzeyinde yönelik bir pnömatik destekli ücret çözücü sprey kullanır. ⁷ DESI tarafından desorpsiyon ve sonraki iyonlaşma için çalışma modeli "pick-up modeli damlacık" olarak bilinir. ^8-10 ücret birincil damlacıkları desi prob tarafından üretilen ıslatma ve analit, bir katı-sıvı mikroekstraksiyonu mekanizması ile yüzeyden çıkarılan malzeme içeren ikincil damlacıklarının momentum transferi ve kalkış ⁸ sonraki damlacık çarpışma sonucu çözünmüş olduğu ince bir film oluşturucu, yüzey ile çarpışır . ^9,10 Sonuçta, gazfaz iyonları ancak DESI en hassas iyon oluşum sürecini deneysel kanıtlanmış olması henüz iyon buharlaşma, ücret kalıntı modelleri ya da diğer modelleri, ¹¹ sonrasında ESI benzeri süreçlerle üretilen olduğuna inanılmaktadır. ¹² DESI duyarlılık çözünürlüğüne bağlı güçlü bağlıdır Sprey çözücü içinde, analit, desorpsiyon olarak lokalize microextractiondur dayanır. ¹³

Bir yazılım kontrollü numune aşamasında birlikte kullanıldığında, örnek şeritli DESI iyonizasyon probu altında adım ile tek yönlü taranır, ve zaman tanım ile, m / z bilgi kimyasal türlerin mekansal dağılımı (Şekil 1) ile ilişkilidir. 2006 yılında Van Berkel ve Kertesz tarafından bildirilen ilke DESI-MSI deney ilk kanıtı bu yana, ¹⁴ teknik lipid analizi, ^3,16 ilaç metabolitleri, ^17,18 disea rapor uygulamaları ile, önemli ölçüde ¹⁵ olgunlaştıse biyolojik, ¹⁹ beyin dokusu, ^3,18,20 akciğer dokusu, ¹⁸ böbrek doku, ¹⁸ testis dokusu, ¹⁸ böbreküstü bezleri, ¹⁷ ince tabaka kromatografisi plakalar, ²¹ ve yosun yüzeyler. DESI-MSI ile elde edilen görüntülerin ²² rutin çözünürlük sonuçta sprey tarafından çıkarılan etkin yüzey alanı tarafından belirlenir, ancak 40 mikron gibi düşük çözünürlüklerde bildirilmiştir 100-200 mikron,. ^23-25 ​​Bu kararname ve analiz kolaylığı hızlı ve basit bir analiz için uygun DESI-MSI yapar değerli mekansal bilgi edinimi daha iyi biyolojik süreçleri ²⁶ anlamanıza olanak 0.5-5 cm ² aralığında yüzey alanları ile biyolojik doku örneklerinin. Burada, tipik bir DESI-MSI uygulama örneği olarak, biz sıçan beyin dokularında lipid görüntüleme içeren başarılı bir deney yapma usul ayrıntıları gözden geçirin. Protokolde iki en kritik adımlar vardırAşağıda tarif edildiği gibi doku hazırlanması ²⁷ ve desi iyonu kaynağı optimizasyonu.

Protokol

1. Kesit Doku

1. Mağaza kesit için hazır olana kadar -80 ° C derin dondurucuda flaş dondurulmuş, bütün doku.
2. Doku örneği (30 dakika) kesit önce cryomicrotome içinde sıcaklığına getirin. -30 ° C'ye bıçak ve örnek sıcaklığı ayarlayın
3. Bir kez doku, cımbız ile numune işleme, sıcaklığa ulaşıldığında ne beynin bir kısmında (yani beynin ön birincil öneme sahip ise, beynin arka monte yeterli montaj yüzey ilgilendiren bağlı olarak beynin ön ya da arka azalttı Chuck üzerinde).
   1. Sertleşene kadar merkezinde ayna için ~ 0.5 ml Optimal Kesme Sıcaklık Bileşik (OCT, Doku-Tek, Sakura) uygulayın ve, cımbız kullanarak, OCT yerinde örnek tutun. Bir kez Ekim tamamen numune tutucuya monte ayna, dondurulur.
   2. Örnek monte etmek için kullanılan bir OCT az miktarda (OKT bir blok olarak numune montaj aksine olarak yaygın diğer histolojik yapılır tercih edilirnumunenin kontaminasyonu en aza indirmek için mantıksal işlemleri). OCT ile örnek kirlenmesi DESI ve iyon bastırma nedeniyle görüntüleme işlemi için zararlıdır.
4. Kalınlığında 12-18 mikron MS görüntüleme aralığı için gerekli tipik doku bölümleri. Önerilen aralık dahilinde istenilen kalınlıkta Bölüm doku. Hafifçe bölümünde bir oda sıcaklık mikroskop cam slayt dokunarak her kesitli doku çözülme monte. Örnek monte edildikten sonra bu kimyasal dağılımları ve kompozisyonlar değişecek gibi, doku bölümünde dokunmamaya dikkatli olun.

Not: Biz bir optimizasyon için bölüm ve görüntüleme için başka kullanarak, slayt başına iki bölümden montaj tavsiye ederiz. Bölümleri bir slayt kutusunda ° C derin dondurucuda -80 kadar acil görüntüleme, mağaza slaytlar için analiz için hazır değildir. Ise

5. Saklanan bölümleri analiz ise, dondurucu slayt kaldırmak, hemen vakum desikatörde transfer ve izin ~ 15-20çözülme min. Uzun desikatörde numune bırakmak örnek kuru ve DESI etkinliğini azaltacaktır. O zaman çıkarına, ancak çözülmüş sonra DESI iyon kaynağının optimizasyonu doku örneği ile yapılacaktır, örnek çözme edildiği sırasında dönemin ekipman başlatma için ideal bir zaman olarak hizmet vermektedir.
   1. Çözücü desi olarak% 1 asetik asit ile asetonitril kullanarak, 5 ul / dakika 'lık bir akış oranı ile bir şırınga pompası açın. Daha düşük akış hızı DESI sprey ve etkin piksel boyutu etkisini nokta yan azaltır, ancak daha yüksek bir akış hızı yeterli duyarlılığı için gerekli olabilir. Bu nedenle akış oranı (tipik olarak 1-5 ul / dak) her bir uygulama ve istenen duyarlılık ve çözünürlüğü için optimize edilmelidir. Şırınga verilen akış hızında tam optimizasyon ve görüntüleme için yeterli solvent içerdiğinden emin olun.
   2. Çözücü kaynak ucu dışarı damlayan göründüğünde, Gerilim ile azot nebulizing gazı açın160 psi örn.
   3. 3.600 uygulayarak iyon kaynağına bağlı yüksek gerilim güç kaynağı açın V.
6. Hareket sahnede slayt monte ve iyon kaynağı ve MS optimizasyonu başlar

2. DESI Optimizasyon

1. Desi sistem kaynağı prob (bkz. Şekil 2), bir şırınga pompası ve bir çözücü ya da alternatif dağıtım sistemi, sıkıştırılmış azot, çeviri örnek sahne ve bağlama oluşur. Kütle spektrometresi uygun kütle aralığı ve ilgi analitler için ayarlanmış bir kez DESI kaynak optimizasyonu ile devam edin.
   1. Kaynak bileşenleri henüz açık değil varsa, yön bölümleri 1.5.1-3 bakın.
   2. Bu bölümlerde ele değişkenler biyolojik dokuların görüntüleme için tavsiye edilir. Bununla birlikte, bu değişkenler doku veya örneğin farklı tipleri için optimize edilmelidir. Alternatif çözücüler, akış hızı, nebulizing gaz basınçları ve gerilimleri Hü için bildirilmiştirBiyolojik dokuların ng. ^16-18
2. Başlangıçta DESI kaynak cam slayt dokunmadan değil, ve doku bölümün herhangi bir parçası yönelik olmadığından emin olun. Bu prob ilk optimizasyon sürecinde zarar görmemesi ve doku örneği ile temas tarafından ayarlanan herhangi bir kısmını kirletmeyin sağlayacaktır.
   1. İyi bir başlangıç ​​pozisyonu 55 arasında bir açıda, prob ile ucu örnek yüzeyden 3 mm ve MS kılcal giriş ila 5 mm arasında, ° numune yüzeyi ile ilgili ile. DESI prob iç kılcal dış kılcal ötesinde ~ 1 mm uzanmalıdır. Bütün bu parametreler optimize edilecektir.
3. Kılcal MS arayüzü iyonların uygun transferini numune yüzeyi ile ilgili olarak ~ 15 ° 'lik bir toplama açıda olmalıdır. Kılcal mümkün olduğunca yakın, yüzeyden <1 mm olmalıdır; numune yüzeyi üzerinde MS kılcal gezinen böylece sahne yüksekliğini ayarlayındokunmadan.
4. Doğrudan doğrultusunda böylece MS kılcal giriş ile ilgili olarak x boyutta DESI prob aynı hizaya getirin.
5. Ekstra doku bölümünü kullanarak optimum hassasiyet için DESI kaynağının y ve z konumları ayarlayın. DESI prob bir örnek alan yönelik olarak, sonunda dezorbe ve bu ortaya çıkar gibi o bölgede ve sinyal analitlerin tüm giderek azalacak iyonize unutmayın. Bu adım olarak kısa sürede yapılması önemlidir.
   1. Bu nedenle, optimizasyon işlemi boyunca, örneğin taze numune sinyalindeki değişiklikler kaynak optimizasyonu değil, örnek tükenmesi nedeniyle olduğu analiz edilirken sağlamak için sprey kafası altında hareket ettirilmesi gereklidir. Ancak, doku farklı bölgelerin çeşitli kimyasal bileşimi, tüm doku kesiti iyon yoğunluğu doğrudan bir karşılaştırma tamamen doğru olmadığını düşünüyor. Beynin talamus ile oldukça büyük boyutlu alanı sağlardaha tutarlı kimyasal bileşimi, ama yine de mükemmel bir üniforma değil. Alternatif olarak, boya rodamin içeren kırmızı Sharpie, işaretleme 6G ([M] ^+, m / z 443), uzak örnek bir cam slayt DESI ile güçlü MS yanıtı sağlar ve aynı zamanda optimizasyonu için kullanılabilir, ancak Farklı örnek form ve analit verilen, bu koşullar hala biyolojik dokular için set-up ideal için ilişkili olmayabilir.
   2. Kaynak ucu ve kılcal girişi arasındaki Önerilen y ayırma: ~ 4 mm, uç ve örnek yüzeyi arasındaki tavsiye z ayırma: ~ 1.5 mm. Bu parametrelerin her deneysel set-up için biraz daha farklı olacak olsa.
   3. Probun geometrisi ve açısı göz önüne alındığında, y ve z-boyut pozisyonları solvent ve analit içeren damlacıkların etkin iletim göre birbiriyle ilişkili olduğunu göz önünde. Tek değişkenli bir değişiklik aynı çarpma etkisi konumunu korumak ve diğer bir sonraki değişiklik gerektirecektirkendi iletim açılar.
6. Mesafe maksimum hassasiyet ve minimal etkisi spot büyüklüğü için kaynak dış kılcal gelen iç kılcal extrudes ayarlayın. Dikkat: Bu ayarı yaparken yüksek gerilim KAPALI olduğundan emin olun.
7. Maksimum sinyal gözlenir, kaynak geometri uygun kabul edilecektir.
   1. Bölümlerde 2.5-2.6 optimize değişkenleri birbiri ile ilişkilidir, bu nedenle birinin ayarlama doğal olarak diğerinin yeniden ayar bölümde ele gerekli kaynak-örnek-giriş geometrisi, ya da koşulların ayarlama 1.5.1 korumak için gerektirir 3.
8. Ayrıca, kütle spektrometresi ile kılcal transfer çevreleyen bir ısıtma elemanı iyonizasyon işlemi sırasında üretilen şarj analit damlacıkları desolvation kolaylaştırarak duyarlılığını artırmak olabilir. Burada bir ip ısıtıcı kullanmak transferi etrafında sarılmış 100 ° C ayarlı kılcal

3. TissuE Görüntüleme

1. Görüntüleme işlemi sırasında, örnek aşamasında kılcal desi prob ve MS girişi altındaki numune hareket eder ve diğer tüm bileşenler sabit kalır. Sahnenin hareket parametreleri DESI etkisi tüy boyutu ve optimal duyarlılık dayalı seçilmelidir.
   1. Daha büyük bir etki tüy ancak görüntüleme için, aynı zamanda daha büyük bir piksel boyutu ve böylece kötü bir görüntü çözünürlüğü neden olur, daha fazla örnek desorbe olan göz önüne alındığında, daha yüksek bir iyon yoğunluğu ile sonuçlanacaktır.
2. Bu deneyde kullanılan çeviri aşamasında olan ev inşa edilmiş ve verilen boyutları bir görüntü için hız ve satır aralığı rastering kontrolü için izin veren bir LabView programı tarafından kontrol. Bu deneyde kullanılan sahne hareket kontrolü VI omnispect.bme.gatech.edu mevcuttur. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen DESI kaynağı ve aşama, Prosolia Inc 2B otomatik Omni Sprey kaynağı (Indianapolis, ABD) olarak kullanılabilir.
   1. Beyin dokuları için birTipik bir görüntü boyutu 10 x 15 mm ve kullanılan sahne hareketi parametreleri göz önüne alındığında, görüntü yaklaşık 3 saat sürer.
      1. Program LabView VI veya istenen görüntüleme koşulları için eşdeğer kontrol yazılımı, bir sahne tarama 80 mikron hızı / sn ve 200 mikron sıraları arasında satır aralığı kullanarak. Omni Sprey kaynak kullanırken, hareket parametreleri 100-200 mm / sn tarama hızı ve 200 mikron bir satır aralığı için ayarlanmalıdır. Bu hareketi parametreleri her boyut ve gerekli hassasiyeti istenen piksel sayısına bağlı olarak değiştirilebilir unutmayın.
         1. Daha küçük bir satır aralığı tarama hızı etkisi daha az olan ile, görüntü kalitesini artırmak için gösterilmiştir. ²⁵ Ancak, bu mutlaka işaret ve gelişmiş görüntü çözünürlüğü değildir dikkat etmek önemlidir bu kadar etkisi noktada güçlü bağlıdır boyutu. Daha yavaş bir tarama hızı ve daha küçük satır aralığı önemli ölçüde analiz süresi artacak ve bu nedenle optimizasyon olmalıdırdoku ya da örneğin her türü için zed.
      2. Satır aralığı y boyutta piksel boyutunu belirler ise MS spektral satın alma 1 set ile tarama / sn ve 1 piksel / tarama olarak oluşturulan görüntü, sahne hızı, x boyutta piksel boyutunu tanımlar. Resmin gerçek bir piksel boyutuna yayılan püskürtülmesi nedeniyle daha büyük olmasına rağmen, daha yavaş hareket desorpsiyon ve analitlerin saptanması için daha fazla zaman sağlar.
   2. Dizin yolunu ve LabView VI içindeki görüntüleri sırasında kaydedilecek konum ve zaman dosyalar için dosya adı verin.
3. Kütle spektral veri toplama için hazırlık, görüntüleme için gereken toplam zamanı hesaplamak. Grubumuz tarafından kullanılan Labview programı otomatik olarak bu değer sağlar, ama alternatif katı kontrolü kullanılırsa, bu hesaplama MS veri toplama ayarları için gereklidir.
   1. Bir Omni Sprey otomatik kaynak ve sahne kullanırken, resmin her satırı olarak elde edilirMünferit çalışır. Zaman-başına-line ve verilen görüntüleme boyutları için gerekli satır sayısı kütle spektrometresi yazılımı içine girilmesi için Omni Sprey kontrol yazılımı kullanılarak hesaplanmıştır.
4. Kütle spektrometresi tarama hızı 1 spektrumu / sn olduğundan emin olun, ve hesaplanan toplam süre maç için araç satın alma saati ayarlayın.
   1. Spektral tarama hızı 1 spektrum / sn olarak ayarlayın.
   2. PROFİLİ modunda veri kazanmak ve m / z aralığı ilgi türler için uygun olduğundan emin olun. Bu DESI da ESI olduğu gibi, çarpma ücret analitleri üretir unutmayın.
   3. LabView tarafından verilen toplam resim zaman maç için satın alma saati ayarlayın.
5. Görüntülü alanın üst sol çarpma etkisi nokta yerleştirin.
6. Aynı anda MS veri ve sahne hareket satın başlayın.
7. Veri toplama sonucu üzerine STANDBY moduna kütle spektrometresi dönmek.
8. DESI kaynağının yüksek gerilim kapatın.
9. O çevirinff azot gazı.
10. Şırınga pompası kapatın.

4. Görüntü İşleme

1. Toplu spektral veri, evre süresi ve LabView ile metin dosyaları olarak kaydedilir konum verileri ile birlikte gelen spektrumları ile piksel koordinatları ilişkilendirerek bir 2D görüntü içine "katlanmış" olmalıdır. Omnispect.bme.gatech.edu: Burada sunulan görüntüleri serbestçe kullanılabilir Matlab tabanlı yazılım kullanılarak işlendi. Veri Omni Sprey kaynak kullanılarak elde edilir ise, Firefly veri dönüştürme yazılımı BioMAP (www.maldi-msi.org) görüntü görselleştirme için veri küp oluşturmak için kullanılır.
2. Jeol AccuTOF kütle spektrometresi ile elde edilen veriler için, kaydedilen kromatogram daha fazla analiz için. ED formatında ihraç edilmelidir.
   1. MassCenter içinde Data Manager kullanarak, ilk centroided veri (Araçlar → Geometrik için Toplama Veri dönüştürme) için elde verileri dönüştürmek. Daha sonra klavye kombinasyonu Ctrl + Shift + E fol kullanarak. ED biçimde veri ihracatAraçlar → İhracat ile onun ardından.
3. OmniSpect web sitesine ham. ED kütle spektral veri ve iki metin dosyaları, konum ve zaman, yükleyin. Firefly işlenmiş görüntüleme verileri BioMAP olarak görüntülenebilir.
   1. Sigara Negatif Matrix çarpanlara tarafından istatistiksel analiz de dahil olmak üzere ya da ilgi tek bir iyon komplo verilerin işlenmesi doğrudan web sitesinde yapılabilir.
   2. Alternatif olarak, ham veri küp Matlab analiz için ihraç edilebilir.

Sonuçlar

Şekil 3, tedavi edilmemiş bir sıçan beyin bölümünden elde edilen temsili bir spektrumunu göstermektedir. Olumlu modunda, kütle spektrumu yüksek iyonizasyon verimliliği (pozitif yüklü dörtlü amonyum gruba atfedilen) nedeniyle fosfatidilkolinler hakimdir. Doku kesiti toplam iyon görüntü aynı zamanda tüm beyin kesiti boyunca bol sinyali gösteren, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Tespit Anahtar lipidler edebiyat karşılaştırmalar ile Tablo 1'de açıkla...

Tartışmalar

DESI kaynak geometri optimizasyonu başarılı MSI deneyler için önemlidir. Sistemin uyum katkıda birden çok değişken doğrudan hassasiyet ve görüntü çözünürlüğü etkiler. Optimizasyon sırasında, deneyci sinyal elde zorluklar varsa, bir kriter olarak slayt çizilmiş kırmızı Sharpie nokta kullanmanızı öneririz, boya, rodamin 6G, m / z 443, pozitif iyon modunda güçlü bir sinyal üretir ve kullanılabilir ilk optimizasyon. Analit iletim ve iyonizasyon oluşan ince bir film haline yüzeyinden anal...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura-Finetek	4583	http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile	EMD	AX0156-6	OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome	Thermo Scientific	CryoStar* NX70	Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head	Prosolia Inc.		Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply	Stanford Research Systems, Inc.	PS350/5000V-25W	http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller	Omega		http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview	National Instruments	Version 7.1
Translational stage	Prior Scientific	Optiscan II	http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer	JEOL	JMS-T100LC	Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface