Obtención de imágenes de tejidos biológicos por desorción ionización electrospray espectrometría de masas

Resumen

La desorción de ionización por electrospray espectrometría de masas (DESI-MS) es un método por el cual las muestras ambiente, incluidos los tejidos biológicos, se pueden obtener imágenes con la preparación mínima de la muestra. Por rastering la muestra por debajo de la sonda de ionización, esta técnica de aerosol a base proporciona una resolución espacial suficiente para discernir las características moleculares de interés dentro de las secciones de tejido.

Resumen

La espectrometría de masas de imagen (MSI) proporciona información molecular no selectiva con la mayor especificidad y la resolución espacial para la investigación de los tejidos biológicos a los cientos a decenas de escala de micras. Cuando se lleva a cabo bajo condiciones ambiente, la muestra de pre-tratamiento se hace innecesaria, simplificando de este modo el protocolo mientras se mantiene la alta calidad de la información obtenida. La desorción de ionización por electrospray (DESI) es una técnica de MSI ambiente aerosol-basado que permite el muestreo directo de las superficies al aire libre, incluso in vivo. Cuando se utiliza con una etapa de la muestra controlada por software, la muestra se tramado por debajo de la sonda de ionización DESI, y a través del dominio del tiempo, m / z información se correlaciona con la distribución espacial de la especie química '. La fidelidad de la salida DESI-MSI depende de la orientación de la fuente y el posicionamiento con respecto a la superficie de la muestra y de entrada de espectrómetro de masas. Aquí, revisamos cómo preparar las secciones de tejido de DESI imaging y condiciones experimentales adicionales que afectan directamente a la calidad de imagen. Específicamente, se describe el protocolo para la formación de imágenes de secciones de tejido de cerebro de rata por DESI-MSI.

Introducción

Formación de imágenes de Untargeted por espectrometría de masas facilita la adquisición de información química para aplicaciones de descubrimiento y de generación de hipótesis. Formación de imágenes dirigida de una sustancia química conocida de interés, por otro lado, puede facilitar el aumento de la sensibilidad y la selectividad a través del desarrollo método específico. La espectrometría de masas de imagen (MSI) se realiza con mayor frecuencia en los tejidos mediante MALDI, ¹ de iones secundarios espectrometría de masas (SIMS), ² y técnicas de ionización ambiental, incluyendo desorción ionización electrospray (DESI), ³ ablación láser de ionización electrospray (LAESI), ^{4, 5} y líquidos micro-ensambladura de la superficie Sonda de muestreo (LMJ-SSP). ⁶ En MALDI y SIMS, las muestras tienen que ser eliminados físicamente de la muestra, y tienen que ser plana y delgada, ya que se analizan a alto vacío. MALDI requiere recubrimiento de la muestra con una matriz de absorción de radiación, la adición de un paso adicional y engorroso para la preparación de la muestra. SIMStiene la mayor resolución lateral, pero el bombardeo con partículas altamente energéticas provoca graves fragmentación molecular. Por lo tanto, MSI mediante métodos ambientales llenar un nicho que es deseable un análisis suave con una preparación mínima de la muestra. Sin embargo, hasta la fecha, todos los métodos son todavía limitados por el requisito de las superficies planas de muestra.

DESI utiliza un neumáticamente asistida por disolvente de pulverización cargada dirigida a la superficie de la muestra para desorber e ionizar analitos. ⁷ El modelo de trabajo para la desorción y la posterior ionización por DESI se conoce como la "gota modelo de pick-up". ^8-10 Las gotitas cargadas primarios producida por la sonda DESI chocan con la superficie, mojando y formando una película delgada en el que el analito se disuelve por un mecanismo de microextracción sólido-líquido ⁸ subsiguiente gota colisiones resultado en la transferencia de impulso y el despegue de gotas secundarias que contienen el material extraído de la superficie ^9,10. En última instancia, el gasSe cree que los iones de fase que se produce a través de procesos ESI-como después de la evaporación de iones, los modelos de residuos de carga u otros modelos, ¹¹ sin embargo, el proceso de formación de iones precisa en DESI aún tiene que ser probada experimentalmente. ¹² DESI sensibilidad depende en gran medida de la solubilidad de los el analito en el disolvente de pulverización, como desorción se basa en la microextracción localizada. ¹³

Cuando se utiliza con una etapa de la muestra controlada por software, la muestra se escanea unidireccionalmente con el carril de paso a paso por debajo de la sonda de ionización DESI, y a través del dominio del tiempo, m / z información se correlaciona con la distribución espacial de la especie química '(Figura 1). Desde la primera prueba de principio experimento DESI-MSI reportado por Van Berkel y Kertesz en 2006, ¹⁴ la técnica ha madurado considerablemente, con ¹⁵ solicitudes reportadas en el análisis de los lípidos, ^3,16 metabolitos de drogas, enferme ^17,18biomarcadores se, ¹⁹ tejido cerebral, ^3,18,20 tejido pulmonar, ^{18 de} tejido de riñón, ^{18 de} tejido testicular, ¹⁸ glándulas suprarrenales, ¹⁷ placas de cromatografía de capa fina, ²¹ y las superficies de las algas. ²² La resolución rutinaria de imágenes obtenidas por DESI-MSI es 100-200 micras, que se determina en última instancia, por el área de superficie efectiva extraído por la pulverización, pero se han reportado resoluciones tan bajo como 40 micras. ^23-25 ​​Tal resolución y facilidad de análisis hace DESI-MSI apropiado para el análisis rápido y sencillo de muestras de tejidos biológicos con áreas de superficie en el rango de 0,5-5 cm ^2, lo que permite la adquisición de información espacial valiosa para comprender mejor los procesos biológicos ^26. Aquí, como un ejemplo de una aplicación típica DESI-MSI, se revisan los detalles de procedimiento de la realización de un experimento exitoso que implica formación de imágenes de lípidos en los tejidos de cerebro de rata. Los dos pasos más críticos en el protocolo son losPreparación del tejido ²⁷ y optimización de la fuente de iones DESI, tal como se describe a continuación.

Protocolo

1. Tejido seccionamiento

1. La tienda de tejido congelado instantáneamente, todo en congelador -80 ° C hasta que esté listo para seccionar.
2. Dejar que la muestra de tejido para llegar a la temperatura en el criomicrotomo antes de seccionamiento (30 min). Ajuste la hoja y temperatura de la muestra a -30 ° C.
3. Una vez que el tejido ha alcanzado la temperatura, el manejo de la muestra con pinzas, corte frontal o posterior del cerebro dependiendo de qué parte del cerebro es de interés para la superficie de montaje suficiente (es decir, si la parte frontal del cerebro es de importancia primaria, montar parte trasera del cerebro el mandril).
   1. Aplicar ~ 0,5 ml de corte óptimo Compuesto Temperatura (OCT, Tissue-Tek, Sakura) a chuck en el centro y, con unas pinzas, colocar la muestra en el lugar en octubre hasta que se solidifica. Una vez que octubre está completamente congelado, montaje del mismo en soporte de la muestra.
   2. Se prefiere una cantidad mínima de la OCT se utiliza para montar la muestra (en contraste con el montaje de la muestra en un bloque de la OCT como se hace comúnmente en otra histoprocedimientos lógicos) para reducir al mínimo la contaminación de la muestra. La contaminación de la muestra mediante OCT es perjudicial para la DESI y proceso de formación de imágenes debido a la supresión de iones.
4. Las secciones típicas de tejidos necesarios para la gama MS de imágenes 12-18 micras de espesor. Tejidos Sección de espesor deseado dentro del rango recomendado. Descongelar a montar cada tejido seccionado por tocar ligeramente una temperatura ambiente portaobjetos de vidrio sobre la sección. Una vez que se monta una muestra, tenga cuidado de no tocar la sección de tejido, ya que cambiará la distribución de productos químicos y composiciones.

Nota: Se recomienda montar dos secciones por diapositivas, utilizando una sección para la optimización y el otro para la imagen. Si las secciones no son para formación de imágenes inmediata, diapositivas almacenar en congelador -80 ° C en una caja de portaobjetos hasta que esté listo para el análisis.

5. Si el análisis de secciones almacenados, quite deslizante del congelador, transfiera inmediatamente al desecador de vacío, y permitir ~ 15-20min para descongelar. Dejar la muestra en el desecador ya se seca la muestra y reducir la eficiencia DESI. La optimización de la fuente de iones DESI se llevará a cabo con la muestra de tejido una vez que se ha descongelado, sin embargo, en el interés de tiempo, el período durante el cual la muestra se está derritiendo sirve como un tiempo ideal para la inicialización del equipo.
   1. Uso de acetonitrilo con ácido acético al 1% como disolvente de DESI, encender la bomba de jeringa con un caudal de 5 l / min. Una velocidad de flujo baja reducirá el lado de punto de impacto de la pulverización de DESI y tamaño efectivo de píxel, pero una velocidad de flujo más alta puede ser necesario para la sensibilidad suficiente. Por lo tanto la velocidad de flujo (típicamente 1-5 l / min) debe ser optimizado para cada aplicación y la sensibilidad y la resolución deseada. Asegúrese de que la jeringa contiene suficiente disolvente para la optimización completa y de imágenes a una velocidad de flujo dada.
   2. Una vez que el disolvente parece que gotea de la punta de la fuente, encender el gas de nebulización nitrógeno con un pressure de 160 psi.
   3. Encienda la fuente de alimentación de alta tensión conectado a la fuente de iones de aplicar 3.600 V.
6. Coloque el cursor en la fase de movimiento y comenzar fuente de iones y MS optimización

2. Optimización DESI

1. El sistema de DESI consta de una sonda de fuente (véase la figura 2), una jeringa y la bomba o sistema de suministro de disolvente alternativo, nitrógeno comprimido, etapa de la muestra traducción y montaje. Proceda con optimización de la fuente DESI una vez que el espectrómetro de masas se ha optimizado para la gama y analitos de interés masa apropiada.
   1. Si los componentes de origen no se han activado todavía, consulte las secciones 1.5.1-3 para las direcciones.
   2. Se recomiendan las variables discutidas en estas secciones para obtener imágenes de los tejidos biológicos. Sin embargo estas variables deben ser optimizados para diferentes tipos de tejido o muestra. Disolventes alternativos, caudales, presiones de gas de nebulización y tensiones se han reportado para imaging de tejidos biológicos. ^16-18
2. Asegúrese de que inicialmente la fuente DESI no toque el portaobjetos de vidrio, y no se dirige a ninguna parte de la sección de tejido. Esto asegurará que la sonda no se daña en el proceso de optimización inicial y no contaminará cualquier parte de la puesta en marcha al entrar en contacto con la muestra de tejido.
   1. Una buena posición de partida es con la punta 3 mm de la superficie de la muestra y 5 mm desde el capilar de entrada MS, con la sonda en un ángulo de 55 ° con respecto a la superficie de la muestra. El capilar interior de la sonda, debe hacerse extensivo DESI ~ 1 mm más allá del capilar externo. Todos estos parámetros se pueden optimizar.
3. La interfaz de MS capilar debe tener un ángulo de colección de ~ 15 ° con respecto a la superficie de la muestra para la transferencia óptima de iones. Ajustar la altura del escenario para que la MS se cierne capilares más de la superficie de la muestra; la capilares deben ser <1 mm de la superficie, lo más cerca posiblesin tocar.
4. Alinear la sonda DESI en la dimensión x con respecto a la entrada capilar MS para que estén directamente en línea.
5. Ajuste las yyz posiciones de la fuente DESI para una sensibilidad óptima usando la sección de tejido adicional. Tenga en cuenta que a medida que la sonda DESI se dirige a un área de la muestra, con el tiempo se desorber e ionizar todos los analitos en esa zona y la señal disminuirá gradualmente a medida que este se produce. La ejecución de este paso tan pronto como sea posible es importante.
   1. Por lo tanto, durante todo el proceso de optimización, la muestra necesita ser movido por debajo de la cabeza de pulverización para asegurarse de que está siendo analizada muestra fresca y que cualquier cambio en la señal son debido a la optimización de la fuente, no el agotamiento de la muestra. Sin embargo, teniendo en cuenta que la composición química variada de diferentes regiones del tejido, una comparación directa de la intensidad de iones a través de toda la sección del tejido no es del todo precisa. El tálamo del cerebro proporciona un área bastante grande de tamaño concomposición química más consistente, pero todavía no es perfectamente uniforme. Alternativamente, un marcado de Sharpie rojo, que contiene el colorante rodamina 6G ([M] ^+, m / z 443), en el portaobjetos de vidrio lejos de la muestra proporciona una fuerte respuesta de MS por DESI y también se puede utilizar para la optimización, pero dada la diferente forma de muestra y analito, estas condiciones no pueden todavía se correlacionan con una puesta a punto ideal para los tejidos biológicos.
   2. Y la separación recomendada entre la punta y la fuente de entrada capilar: ~ 4 mm, z separación recomendada entre la punta y la superficie de la muestra: ~ 1,5 mm. Aunque estos parámetros serán ligeramente diferentes para cada montaje experimental.
   3. Teniendo en cuenta la geometría y el ángulo de la sonda, tener en cuenta que la Y y posiciones dimensión Z están relacionados entre sí con respecto a la transmisión efectiva de las gotitas de disolvente y que contiene el analito. Un cambio en una variable requiere una modificación posterior en la otra para mantener la misma posición de impacto de pulverización ysus ángulos de transmisión.
6. Ajuste la distancia las extrusiones capilares internas del capilar externo de la fuente para la máxima sensibilidad, y el impacto del tamaño mínimo de punto. Precaución: Asegúrese de que el alto voltaje está apagado mientras realiza este ajuste.
7. La geometría de la fuente se considera óptimo cuando se observa la señal máxima.
   1. Las variables optimizadas en las secciones 2.5 a 2.6 están relacionados entre sí, por lo tanto, el ajuste de uno será inherentemente requiere el reajuste de la otra para mantener la geometría necesaria fuente-muestra-de entrada, o el ajuste de las condiciones discutido en la sección 1.5.1- 3.
8. Además, un elemento de calentamiento que rodea la transferencia capilar para el espectrómetro de masas puede mejorar la sensibilidad mediante la facilitación desolvatación de las gotitas de analitos cargados producidos durante el proceso de ionización. Aquí se utiliza un calentador de cuerda enrollada alrededor de la transferencia capilar ajustado a 100 ° C.

3. Tissue imágenes

1. Durante el proceso de formación de imágenes, la etapa de la muestra se mueve la muestra por debajo de la sonda de DESI y entrada de MS capilar y todos los otros componentes permanecen estacionarios. Los parámetros de movimiento del escenario deben ser seleccionados en función del impacto DESI tamaño de columna y la sensibilidad óptima.
   1. Un penacho de impacto más grande resultará en una mayor intensidad de iones, dado que está siendo desorbido más de la muestra, sin embargo, para formación de imágenes, sino que también dará lugar a un tamaño de píxel más grande y con ello una peor resolución de la imagen.
2. La etapa de conversión utilizado en este experimento es el hogar-construido y controlado por un programa de LabVIEW que permite el control de la velocidad y el interlineado rastering una imagen de dimensiones dadas. La etapa VI de control de movimiento utilizado en este experimento es disponible en omnispect.bme.gatech.edu. Por otra parte, una fuente DESI disponible comercialmente y el estadio podría ser utilizado como el Omni fuente 2D automatizado spray de Prosolia Inc. (Indianapolis, IN EE.UU.).
   1. Para los tejidos del cerebro de unTamaño de imagen típica es de 10 x 15 mm y teniendo en cuenta los parámetros de movimiento de la etapa de segunda mano, la imagen tomará aproximadamente 3 horas.
      1. Programe el LabView VI o software de control equivalente para las condiciones de formación de imágenes que desee, utilizando una velocidad de fase de exploración de 80 m / s, y el interlineado entre líneas de 200 micras. Cuando se utiliza la fuente de spray Omni, parámetros de movimiento se deben establecer para una velocidad de escaneo de 100 a 200 m / s, y un interlineado de 200 micras. Tenga en cuenta que estos parámetros de movimiento se pueden cambiar en función del número de píxeles deseados en cada dimensión y sensibilidad necesaria.
         1. Un espaciado de línea más pequeña se ha demostrado que mejora la calidad de imagen, con la velocidad de exploración que tiene menos de un efecto. ²⁵ Sin embargo, es importante señalar que esto no indica necesariamente y la mejora de resolución de la imagen, ya que es fuertemente dependiente de punto de impacto tamaño. Una velocidad de muestreo más lento y espaciado más pequeño aumentará significativamente el tiempo de análisis y por lo tanto deben ser optimized para cada tipo de tejido o muestra.
      2. Con la adquisición espectral MS fija en 1 exploraciones / segundo, y la imagen creada como 1 píxel / exploración, la velocidad de fase se define el tamaño de píxel en la dimensión x, mientras que el espaciado de línea determina el tamaño de píxel en la dimensión y. Aunque el tamaño de pixel verdadero de la imagen es más grande que esto debido a la difusión de rociar, de movimiento más lento permite más tiempo para la desorción y la detección de analitos.
   2. Dale ruta del directorio y el nombre de archivo para los archivos de la posición y la duración de las imágenes grabadas durante en el LabView VI.
3. En la preparación para la adquisición de datos de espectro de masas, calcular el tiempo total requerido para la formación de imágenes. El programa Labview utilizado por nuestro grupo proporciona automáticamente este valor, pero si se utiliza el control de fase alternativa, este cálculo es necesario para la configuración de adquisición de datos de MS.
   1. Cuando se utiliza un spray de fuente y la etapa automatizado Omni, cada línea de la imagen se adquiere como encorre individuo. El-por-línea del tiempo y el número de líneas necesarias para las dimensiones de imagen dados se calcularon utilizando el software de control Omni spray para ser introducidos en el software del espectrómetro de masas.
4. Asegúrese de que la velocidad del análisis del espectrómetro de masas es el 1 de espectro / seg, y establecer el tiempo de adquisición de instrumentos para que coincida con el tiempo total calculado.
   1. Ajuste la velocidad de barrido espectral espectro 1 / sec.
   2. Adquirir datos en modo de perfil y asegurarse de que el rango de m / z es apropiado para las especies de interés. Recuerde que DESI también produce analitos cargados multiplican, como en ESI.
   3. Establezca el tiempo de adquisición para que coincida con el tiempo total de la imagen dada por LabView.
5. Coloque el punto de impacto de pulverización en la parte superior izquierda del área a explorar.
6. Comience adquisición de datos de MS y el movimiento escenario al mismo tiempo.
7. Al concluir la adquisición de datos, vuelva espectrómetro de masas al modo de espera.
8. Apague alta tensión de la fuente DESI.
9. Encienda ogas nitrógeno y ss.
10. Apague la bomba de jeringa.

4. Procesamiento de Imágenes

1. Los datos de espectros de masas, en combinación con el tiempo y los datos de posición etapa guardados como archivos de texto a través de LabVIEW deben ser "dobladas" en una imagen 2D correlación de coordenadas de píxeles con los espectros correspondiente. Las imágenes que aquí se presentan fueron procesados ​​con el software Matlab basado en que está disponible gratuitamente en: omnispect.bme.gatech.edu. Si los datos se adquieren utilizando la fuente de aerosol Omni, el software de conversión de datos de luciérnaga se utiliza para crear el cubo de datos para la visualización de la imagen en BioMAP (www.maldi-msi.org).
2. Para los datos adquiridos en el AccuTOF espectrómetro de masas Jeol, el cromatograma registrado deberá ser exportado. Cdf formato para su posterior análisis.
   1. Utilizando el Data Manager dentro MassCenter, primero convierta los datos adquiridos a los datos centroided (Herramientas → Convertir datos Adquisición de centroide). A continuación, exportar datos en formato. Cdf formato utilizando la combinación de teclas Ctrl + Shift + E folseguido por Herramientas → Exportar.
3. Cargar los datos en bruto. Cdf medios espectrales y los dos archivos de texto, la posición y la hora, el sitio web OmniSpect. Datos de imágenes Firefly-procesados ​​pueden ser visualizados en BioMAP.
   1. El tratamiento posterior de los datos, incluyendo análisis estadístico Matriz de factorización no negativa o trazado de un solo ion de interés puede realizarse directamente en el sitio web.
   2. Alternativamente, el cubo de datos sin procesar se pueden exportar para su análisis en Matlab.

Resultados

La Figura 3 muestra un espectro representativo obtenido a partir de una sección de cerebro de rata no tratada. En el modo positivo, el espectro de masas está dominada por fosfatidilcolinas, debido a sus altas eficiencias de ionización (atribuido al grupo amonio cuaternario cargado positivamente). La imagen de iones total de la sección de tejido también se muestra en la Figura 3, que muestra abundante señal a través de toda la sección del cerebro. Lípidos clave detectados se ide...

Discusión

La optimización de la geometría de la fuente de DESI es crítico para experimentos exitosos MSI. Las múltiples variables que contribuyen a la alineación del sistema afectan directamente a la sensibilidad y la resolución de la imagen. Si durante la optimización, el experimentador tiene dificultades para obtener la señal, le recomendamos que utilice punto Sharpie rojo dibujado en la diapositiva como punto de referencia, el tinte, la rodamina 6G, m / z 443, produce una fuerte señal en el modo de iones positivos y s...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura-Finetek	4583	http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile	EMD	AX0156-6	OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome	Thermo Scientific	CryoStar* NX70	Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head	Prosolia Inc.		Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply	Stanford Research Systems, Inc.	PS350/5000V-25W	http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller	Omega		http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview	National Instruments	Version 7.1
Translational stage	Prior Scientific	Optiscan II	http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer	JEOL	JMS-T100LC	Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface