偏振的实验性脑损伤小胶质细胞/巨噬细胞标志物的三维共聚焦分析

摘要

一种方式来获得新的见解的大脑炎症反应的复杂性呈现。我们描述了免疫为基础的协议，其次是三维共聚焦分析，以探讨局灶性脑缺血小鼠模型共表达小胶质细胞/巨噬细胞表型标志物的图案。

摘要

脑卒中小胶质细胞/巨噬细胞后（M / M）进行快速活化，包括新颖的表面抗原和生产的建立和维持炎症反应介质的表达显着形态学和表型的改变。新的证据表明，M / M是高塑性细胞急性脑损伤后，可以假定经典的促炎症（M1）或替代消炎（M2）的激活。但是M / M型标志物表达，他们的共存和时间演化的脑损伤的完整的特征是人仍下落不明。

免疫荧光协议专门染色的M / M激活相关标志物可在缺血性脑进行。在这里，我们提出了免疫为基础的协议，其次是三维共聚焦分析，作为一个强大的方法，调查本地化和共表达M / M型标志，如图案细胞CD11b，CD68，的Ym1，在小鼠局灶性脑缺血引起的大脑中动脉（PMCAO）的永久性闭塞模型。污渍区域的二维分析表明，每个标记是关联到一个定义的M / M的形态，并具有一个给定的定位中的缺血性损伤。 M / M的表型标记物的共表达模式可以通过在局部缺血区域的三维共聚焦成像来评估。图像可以在一个确定的容积被收购（10μm的z轴和一个0.23微米的步长大小，对应于180×135×10微米的体积）与连续扫描模式，以尽量减少渗色的效果，并避免波长重叠。图像，然后处理由软件Imaris里的手段来获得三维渲染。三维效果图实视图允许在集群细胞标志物表达的定义。我们表明，M / M具有分化向多个表型的能力，这取决于在病变部位和Ti的位置我受伤后。

引言

急性脑损伤，小胶质细胞迅速激活并发生剧烈的形态和表型的变化^1-3。这种内在的反应相关联招聘血液出生的巨噬细胞迁移到损伤脑实质^4,5。小胶质细胞和巨噬细胞的抗原性是无法区分的作用（以下称为M / M）在脑损伤仍有争议。越来越多的研究表明，与什么所述外围巨噬细胞，小胶质细胞和脑招募巨噬细胞可以假定不同的表型，其极端对应于经典的促炎性毒性（M1）或抗炎保护（M2）的表型。在不同的激活状态，包括亲或抗炎因子分泌，神经营养分子和溶酶体活性释放的特征的表型标志物的特定图案，其表达依赖于时间周围环境的演变。这些M / M表型在脑损伤的特征仍然是一知半解。我们使用PMCAO的一套行之有效的小鼠模型来分析的M / M表达和进化中风后。这里提出了一种基于免疫的协议旨在让洞察特定的M / M型标志，其本地化和细胞共同表达在缺血区的外观。我们研究了相关的不同的激活状态，或表型的分子数，即细胞CD11b，白细胞和M / M激活/招聘^6-8的一种广泛使用的标记表示的表面标志物CD68溶酶体^6,7和的Ym1分泌的标志蛋白替代性活化（M2）巨噬细胞表达和相关的回收和功能恢复^9-10。

当两个标记都表达了相同的细胞，但在不同亚细胞区室，独自一人共定位可能不会有太大的INFormative。在这种情况下，可以通过使用单一的平面视图和三维效果进行共表达的分析。在这里，我们描述了一个协议来获取标记共表达的透彻三维分析。

研究方案

1。免疫荧光

下面的协议是从心脏灌注小鼠（20毫升的PBS，0.1摩尔/升，pH为7.4，随后加入50毫升PBS中冷却的多聚甲醛中4％）中获得冠状脑冷冻切片进行。灌注后，大脑小心移除，并转移到30％蔗糖的PBS中于4℃过夜冷冻保护。 45℃下进行3分钟被密封到小瓶中并储存在-70℃直至使用前 - 大脑，然后迅速通过浸没在冷冻中的异戊烷。冠状脑冷冻切片（20微米）被连续切割，并进行免疫荧光协议^11，6。

将所有试剂和样品至室温后方可使用。请注意，抗体和血清中所呈现的工作稀释液造成的，以获得最佳的性能做试验。当不同的抗体和血清的使用，该协议需要被验证。

请注意，因为两者的抗CD11b和抗CD68一抗大鼠制成，由抗大鼠的Alexa 546，我们使用了高稀释的抗CD11b的接着用荧光信号放大避免交叉信号全港性系统评估套件（Cy5的酪胺）。我们已经成立了由执行只是步骤1.17所描述的协议，并使用至少7种不同的抗CD11b的稀释液作为记录在表1的最佳工作稀释度的抗CD11b。其结果是，1:30,000已被选定作为唯一稀释实现：1）可见信号用Cy5在激发波长为646纳米; 2）没有用Alexa 546信号在激发波长为532纳米。以这种方式，Alexa的546荧光信号有选择地与CD68表达相关。

最佳稀释度为抗CD11b和抗CD68抗体可能取决于组织的类型而变化，并且必须开始共同的标签协议事先定义。

1. 用PBS洗两次脑冰冻切片。
2. 在cubate冷冻切片5分钟，在PBS中含1％H _{2 O 2（}必需的，因为在荧光扩增需要孵化与辣根过氧化物酶，链霉抗-HRP步骤，参见步骤1.12）。
3. 洗涤冷冻切片2倍的PBS。
4. 孵育冷冻切片在PBS中含有10％NGS和0.3％的Triton 60分钟。
5. 在PBS中含有初级抗体鼠抗CD11b [1:30,000]，10％NGS和0.3％的Triton孵育冷冻切片在4℃下过夜。
6. 洗涤冷冻切片2×（5分钟），用PBS。
7. 冰冻切片孵育在PBS中含有生物素标记的二抗鼠抗体[1:200]和1％NGS 60分钟。
8. 洗涤冷冻切片2倍的PBS。
9. 与TNT（：0.1M的Tris-HCl，pH值7.4,0.15 M氯化钠，0.05％吐温20的Tris-HCl，氯化钠，吐温）洗涤冷冻切片。
10. 孵育冷冻切片1.5小时在TNB（Tris-盐酸 - 氯化钠 - 封闭缓冲液：0.1M Tris-盐酸，pH值7.4,0.15 M氯化钠，从适当的试剂盒的0.5％封闭试剂（见表试剂））。
11. 洗冷冻部3X倍与TNT。
12. 孵育含链霉素-HRP [1:100]中冰冻切片TNB。
13. 洗3倍冰冻切片与TNT。
14. 冰冻切片孵育含有花青5酪胺[1:300]中扩增稀释8分钟。
15. 洗涤冷冻切片3倍的PBS。
16. 孵育冷冻切片在PBS中含有10％NGS，0.1％的Triton 60分钟。
17. 在PBS中含有初级抗体鼠抗CD68 [1:200]，3％NGS和0.3％的Triton孵育冷冻切片在4℃下过夜。
18. 洗涤冷冻切片3倍的PBS。
19. 冰冻切片孵育在PBS中含有fluorconjugated二抗Alexa的546抗鼠[1:500]和1％NGS 60分钟。
20. 洗涤冷冻切片3倍的PBS。
21. 孵育冷冻切片含有Hoechst的1微克/毫升的PBS 10分钟。
22. 洗涤冷冻切片3倍的PBS。
23. 在延长黄金装冰冻切片。

2。收购三维图像激光共聚焦显微镜

这里所用的显微镜​​是IX81显微镜配备激光共聚焦扫描单元FV500 3激光线：氩氪（488nm处），氦氖红色（646nm）和氦氖绿色（532）和紫外二极管。

1. 选择激励激光器取决于荧光染料被激发的波长（氦 - 氖红为Cy5标记，细胞CD11b;氦氖绿色Alexa546，CD68和紫外二极管为Hoechst公司，核）。
2. 选择最佳的分色镜组合的光信号采集。
3. 设置图像分辨率最低为800 x 600像素。
4. 用落射荧光和逐步增加放大倍率为40倍物镜识别感兴趣的区域。
5. 切换到激光扫描显微镜（LSM）的模式。
6. 运行重复扫描来调节光电倍增管（PMT）和每个通道的增益。激光器可以逐个打开，以方便套起来。保持增益尽可能低，以避免不必要的非特异性信号。
7. 与REPEtitive扫描运行时，将焦点移动控制来定义z轴（总z轴的长度= 10微米）的下部和上部极端。
8. 停止重复扫描。
9. 定义步长。它应该是尽可能地接近，以像素大小（0.225微米），以获得一个必须是标准1:1尺寸比例在z轴。
10. 激活卡尔曼滤波器的至少2倍。
11. 启动顺序扫描模式，以避免流血通的效果。
12. 去中途沿z轴和运行的xy顺序扫描。检查设置了光电倍增管和增益（良好的信号/噪声比）。如果不理想，请重复步骤2.6。
13. 运行XYZ收购。
14. 将数据导出为multitiff文件。每个multitiff文件通常包含3个颜色通道（蓝色，绿色和红色）和44的焦平面。

3。共焦收购和三维渲染的三维视图

上传multitiff文件Imaris里的软件，并将它们处理如下：

1. 打开软件。
2. 选择超越看法。
3. 上传multitiff文件。
4. 为每个通道选择所需的颜色。
5. 通过增加显示调整面板上的最小值从背景中消除噪音。单独调整每个通道。
6. 去剖面视图。移动沿z轴寻找的共定位（黄色像素）。
7. 点击一个黄色的区域，以查看是否共定位为沿z轴（ 即属于一个固体物体）存在。 Z轴凸起是可见的图中的右侧和底部。
8. 拍摄快照。
9. 回去超越看法。
10. 裁剪三维分离的细胞或细胞群。
11. 选择显示调节面板上的一个通道。
12. 选择超越/面算法生成器。算法步骤：
    1. 选择通道。
    2. 定义阈值（使用相同的最小值在T他显示调节面板）。
    3. 定义调整大小。
    4. 定义平滑（最好= 0.200）。
    5. 定义颜色的外观。
    6. 结束算法。
13. 每个通道重复步骤3.12。
14. 取消选择荧光通道显示调节面板，并选择所有的三个面 。
15. 移动音量，以找到最好的景色。
16. 拍摄快照。

结果

当标记协议和共焦的采集进行入缺血区得到的结果的一个例子示于图1A和1B。获得的图像的二维视图显示，在缺血后24小时（A），溶酶体标记CD68（绿色）表示肥厚ameboid CD11b的细胞（红色）出现在缺血中心。在边境区（B）的CD11b阳性细胞显示圆形胞体和积极的CD68分枝过程。 Z轴投影（A和B的右侧和底部）允许的记录是否在?...

讨论

我们在座的免疫为基础的协议，其次是三维共聚焦分析作为一个强大的方法，调查国产化的M / M型标志物和共表达到缺血区域（更详细的分析见文献^6）。此方法结合了M / M活化与三维共焦成像相关的标记物的特异性染色。抗体，血清和fluorconjugated工作稀释度的微调提供了最佳的信号被调查指标的信噪比。图像处理以获得三维渲染允许在细胞群标志物表达的定义，使得所获取的图像表示的M /...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Rat Anti-mouse CD11b	Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy
Rat Anti-mouse CD68	AbD Serotec	MCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1	Stem Cell Technologies	1404
H–chst 33342	Life technologies	H21492
Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)	CHEMICON	MAB377
Biotinilated Goat Anti-Rat antibody	Jackson Immuno Research	112-065-143
TSA Cyanine 5 System	Perkin Elmer	NEL705A001KT
Prolong Gold	Invitrogen	P36930
Anti-rat alexa 546	Invitrogen	A-11081
Anti mouse Alexa 488	Invitrogen	A-21121
Anti-rabbit Alexa 594	Invitrogen	A-11037
Normal Goat Serum	Vectors Laboratories	S-1000
Tritin X-100	Sigma	T8787
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P4417-100
Equipment
Cryostat CM1850	Leica
Olympus IX81 confocal microscope	Olympus
AnalySIS software	Olympus
Imaris software 5.0	Bitplane
Photoshop cs2	Adobe Systems
Software packages GraphPad Prism version 4.0	GraphPad Software Inc.