Tridimensionale confocale Analisi dei marcatori microglia / macrofagi di polarizzazione in Experimental Brain Injury

Riepilogo

Un modo per acquisire nuove conoscenze nella complessità della risposta infiammatoria del cervello è presentato. Descriviamo protocolli basati immunofluorescenza-seguita da analisi confocale tridimensionale per indagare il pattern di co-espressione di marcatori fenotipici microglia / macrofagi in un modello murino di ischemia focale.

Abstract

Dopo l'ictus cerebrale microglia / macrofagi (M / M) sottoposti attivazione rapida con i cambiamenti morfologici e fenotipici drammatici che includono l'espressione di antigeni di superficie innovativi e la produzione di mediatori che si accumulano e mantengono la risposta infiammatoria. Prove emergenti indica che M / M sono cellule altamente plastica che possono assumere classico antinfiammatorio (M2) attivazione pro-infiammatoria (M1) o alternativo dopo danno cerebrale acuto. Tuttavia una caratterizzazione completa di M / M espressione marcatore fenotipo, la loro colocalizzazione e l'evoluzione temporale nel cervello danneggiato è ancora mancante.

Protocolli di immunofluorescenza specificamente colorazione pertinenti marcatori di attivazione M / M possono essere eseguite nel cervello ischemico. Presentiamo qui protocolli basati immunofluorescenza-seguita da analisi confocale tridimensionale come un approccio efficace per indagare il pattern di localizzazione e co-espressione di M / M marcatori fenotipici qualiCD11b, CD68, YM1, nel modello murino di ischemia focale indotta da occlusione permanente dell'arteria cerebrale media (pMCAO). Analisi bidimensionale della zona macchiata rivela che ciascun marcatore è associato un definito M / M morfologia e ha una data localizzazione nella lesione ischemica. Modelli di M / M marcatore fenotipo co-espressione può essere valutata da tridimensionale confocale nella zona ischemica. Le immagini possono essere acquisite nel corso di un volume definito (10 micron asse z e una dimensione 0,23 um passo, corrispondente ad un volume di 180 x 135 x 10 micron) con una modalità di scansione sequenziale per minimizzare gli effetti di spurgo-through della lunghezza d'onda ed evitare sovrapposizioni. Le immagini vengono poi elaborati per ottenere il rendering tridimensionale per mezzo di software Imaris. Vista solida di tre rendering tridimensionale consente la definizione di espressione marcatore in ammassi di cellule. Abbiamo dimostrato che le M / M hanno la capacità di differenziare verso una moltitudine di fenotipi, a seconda della posizione del sito di lesione e time dopo l'infortunio.

Introduzione

Dopo il danno cerebrale acuto, microglia stanno rapidamente attivata e sottoposti drammatica morfologica e fenotipica cambia ^1-3. Questa risposta intrinseca è associata al reclutamento di macrofagi del sangue nato che migrano nel infortunato ^4,5 parenchima cerebrale. Il ruolo della microglia e macrofagi che non sono antigenicamente distinguibili (d'ora in poi denominato M / M) nel trauma cranico è ancora dibattuta. Un numero crescente di studi indicano che, analogamente a quanto descritto per macrofagi periferici, microglia e macrofagi reclutati cervello possono assumere diversi fenotipi i cui estremi conforme a classico pro-infiammatoria tossico (M1) o anti-infiammatoria protettiva (M2) fenotipo. I diversi stati di attivazione, compreso secrezione di fattori pro o anti-infiammatorie, rilascio di molecole neurotrofici e dell'attività lisosomiale sono caratterizzate da un modello specifico di marcatori fenotipici, la cui espressione dipende dal temporaleevoluzione dell'ambiente circostante. La caratterizzazione di questi fenotipi M / M nel cervello danneggiato è ancora scarsa. Abbiamo utilizzato un modello murino consolidata di pMCAo per analizzare l'espressione M / M e l'evoluzione dopo l'ictus. Protocolli di immunofluorescenza basato presentate qui mirano ad ottenere comprensione nella comparsa di specifici marcatori fenotipici M / M, la loro localizzazione e cellulari co-espressione nella zona ischemica. Abbiamo studiato alcune molecole associate diverso stato di attivazione o fenotipo, cioè CD11b, un marker di superficie espressa da leucociti e un indicatore ampiamente usato di M / M di attivazione / reclutamento ^6-8, CD68 un marcatore dei lisosomi ^6,7 e YM1 un secretoria proteina espressa alternativamente attivati ​​(M2) e macrofagi associati al recupero e funzione di ripristino ^9-10.

Quando due marcatori sono espresse dalla stessa cellula, ma in differenti compartimenti subcellulari, solo colocalizzazione non può essere molto informative. In questo caso, l'analisi di coexpression può essere eseguita utilizzando un'unica vista in pianta e rendering tridimensionali. Siamo qui descriviamo un protocollo per ottenere un'approfondita analisi tridimensionale del marcatore coexpression.

Protocollo

1. Immunofluorescenza

Il seguente protocollo è eseguita su criosezioni cerebrali coronali ottenuti da topi transcardially perfusi (20 ml di PBS, 0,1 mol / l, pH 7,4, seguita da 50 ml di paraformaldeide refrigerate 4% in PBS). Dopo perfusione, i cervelli sono accuratamente rimossi e trasferiti al 30% di saccarosio in PBS a 4 ° C per una notte per crioprotezione. I cervelli sono poi rapidamente congelati per immersione in isopentano a - 45 ° C per 3 minuti prima di essere sigillato in fiale e conservato a -70 ° C fino all'utilizzo. Criosezioni cerebrali coronali (20 micron) sono tagliati in serie e sottoposti a protocollo immunofluorescenza ^{11, 6.}

Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente prima dell'uso. Si prega di notare che le diluizioni di lavoro presentati di anticorpi e siero risultato di studi effettuati al fine di ottenere le migliori prestazioni. Quando vengono utilizzati diversi anticorpi e siero, il protocollo deve essere convalidato.

Nota che, poiché gli anticorpi primari sia anti-CD11b e anti-CD68 sono realizzati nel ratto, per evitare segnale cross dalla destra anti-ratto Alexa 546, abbiamo usato una elevata diluizione di anti-CD11b seguita da amplificazione del segnale fluorescente con kit TSA (Cy5 Tyramide). Abbiamo istituito la diluizione di lavoro ottimale per anti-CD11b eseguendo il protocollo descritto tranne passo 1.17 e utilizzando almeno 7 diverse diluizioni di anti-CD11b come riportato in tabella 1. Come risultato, 1:30.000 è stata scelta essendo l'unico diluizione conseguire: 1) segnale visibile con Cy5 alla lunghezza d'onda di eccitazione 646 nm, 2) nessun segnale con Alexa 546 a lunghezza d'onda di eccitazione 532 nm. In questo modo, il segnale fluorescente Alexa 546 è selettivamente associata con l'espressione di CD68.

Le diluizioni ottimali per anti-CD11b e anticorpi anti-CD68 possono variare a seconda del tipo di tessuto e devono essere definiti prima di iniziare il protocollo co-etichettatura.

1. Lavare criosezioni cervello due volte con PBS.
2. Incriosezioni cubate per 5 min in PBS contenente 1% H ₂ O ₂ (passo richiesto, poiché l'amplificazione fluorescente bisogno incubazione con perossidasi di rafano, streptavidina-HRP, vedere il passo 1.12).
3. Criosezioni Lavare 2x con PBS.
4. Incubare criosezioni per 60 min in PBS contenente il 10% NGS e 0,3% Triton.
5. Incubare criosezioni a 4 ° C per una notte in PBS contenente primario Ab Rat anti-CD11b [1:30.000], il 10% NGS e 0,3% Triton.
6. Lavare criosezioni 2x (5 min) con PBS.
7. Incubare criosezioni per 60 min in PBS contenente biotinilato secondario anti-Rat Ab [1:200] e 1% NGS.
8. Criosezioni Lavare 2x con PBS.
9. Lavare criosezioni con TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20).
10. Incubare criosezioni per 1,5 ore a TNB (tampone Tris-HCl-NaCl-Blocking: 0.1 M TRIS-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0,5% Blocco reagente da apposito kit (vedi tabella dei reagenti)).
11. Wash criosezioni 3x volte con TNT.
12. Incubare criosezioni in TNB contenente streptavidina-HRP [1:100].
13. Criosezioni Lavare 3x con TNT.
14. Incubare criosezioni per 8 minuti in Amplification diluente contenente Cyanine 5 Tyramide [1:300].
15. Criosezioni Lavare 3x con PBS.
16. Incubare criosezioni per 60 min in PBS contenente il 10% NGS e 0,1% Triton.
17. Incubare criosezioni a 4 ° C per una notte in PBS contenente primario Ab Rat anti-CD68 [1:200], 3% NGS e 0,3% Triton.
18. Criosezioni Lavare 3x con PBS.
19. Incubare criosezioni per 60 min in PBS contenente fluorconjugated secondario Ab Alexa 546 anti-Rat [1:500] e 1% NGS.
20. Criosezioni Lavare 3x con PBS.
21. Incubare criosezioni per 10 min in PBS contenente Hoechst 1 ug / ml.
22. Criosezioni Lavare 3x con PBS.
23. Montare criosezioni in Prolungare oro.

2. Acquisizione di immagini tridimensionali per Microscopia confocale

Il microscopio utilizzato qui è stato un microscopio IX81 dotato di FV500 confocale unità di scansione con 3 linee laser: Ar-KR (488nm), He-Ne rosso (646nm), e He-Ne verde (532nm) e un diodo UV.

1. Selezionare i laser di eccitazione a seconda delle lunghezze d'onda dei coloranti fluorescenti per essere entusiasti (He-Ne rosso per Cy5, CD11b, He-Ne verde per Alexa546, CD68 e il diodo UV per la Hoechst, nuclei).
2. Selezionare la migliore combinazione specchio dicroico per la raccolta segnale luminoso.
3. Impostare la risoluzione delle immagini ad un minimo di 800 x 600 pixel.
4. Individuare una zona di interesse utilizzando epi-fluorescenza e progressivamente aumentare l'ingrandimento con l'obiettivo 40X.
5. Passare a Laser Scanning Microscopy (LSM) modalità.
6. Eseguire scansioni ripetitive per regolare il fotomoltiplicatore (PMT) e il guadagno per ogni canale. I laser possono essere attivati ​​individualmente per facilitare il set up. Mantenere guadagno più basso possibile per evitare segnali non specifici indesiderati.
7. Con repetitivo scansione in esecuzione, spostare il controllo del fuoco per definire gli estremi inferiore e superiore della z (lunghezza totale asse z = 10 micron).
8. Smettere di scansione ripetitiva.
9. Definire passo. Dovrebbe essere il più vicino possibile alla dimensione dei pixel (0,225 micron) per ottenere un rapporto 1:1 formato standard sopra l'asse z.
10. Attivare filtro di Kalman almeno 2 volte.
11. Attivare la modalità di scansione sequenziale per evitare effetti sanguinare-through.
12. Vai a metà strada lungo l'asse z ed eseguire una scansione sequenziale xy. Controllare il set-up di PMT e di guadagno (buon rapporto segnale / rumore). Se non è soddisfacente, ripetere il punto 2.6.
13. Eseguire acquisizione xyz.
14. Esportare dati come file multitiff. Ogni file multitiff genere contiene tre canali di colore (blu, verde e rosso) e 44 piani focali.

3. Tridimensionale Vista Acquisizioni confocale e rendering tridimensionale

Caricare file multitiff al software Imaris ed elaborarli come segue:

1. Software Open.
2. Selezionare la vista sorpassare.
3. Caricare il file multitiff.
4. Selezionare il colore desiderato per ogni canale.
5. Rimuovere il rumore di fondo da aumentando il valore minimo sul pannello di regolazione del display. Regolare singolarmente ciascun canale.
6. Vai alla vista di sezione. Muovetevi lungo l'asse z in cerca di co-localizzazione (pixel giallo).
7. Istruzioni su un'area gialla per vedere se la colocalizzazione è presente lungo l'asse z (cioè appartiene ad un oggetto solido). Proiezioni asse Z sono visibili nella parte destra e inferiore della figura.
8. Prendete uno snapshot.
9. Torna a superare vista.
10. Raccolto 3D per isolare una cella o un gruppo di celle.
11. Selezionare un canale sul pannello di regolazione del display.
12. Selezionare la sorpassare / superfici algoritmo costruttore. Passi algoritmo:
    1. Selezionare il canale.
    2. Definire soglia (utilizzare lo stesso valore minimo in tegli visualizzare pannello di regolazione).
    3. Definire ridimensionamento.
    4. Definire smoothing (migliore = 0,200).
    5. Definire l'aspetto del colore.
    6. Fine algoritmo.
13. Ripetere passo 3.12 per ogni canale.
14. Deselezionare i canali di fluorescenza sul pannello di regolazione del display e selezionare tutte le tre superfici.
15. Spostare il volume di trovare la migliore vista.
16. Prendete uno snapshot.

Risultati

Un esempio dei risultati ottenuti quando vengono effettuate etichettatura protocolli e acquisizioni confocali fuori nella regione ischemica è illustrato nelle figure 1A e 1B. Una visione bidimensionale di immagini acquisite mostra che a ventiquattro anni ore dopo ischemia (A), il marcatore CD68 lisosomiale (verde) viene espresso in cellule ipertrofiche ameboide CD11b (rosso) presenti nel nucleo ischemico. Nella zona di confine cellule positive (B) CD11...

Discussione

Vi presentiamo qui protocolli basati immunofluorescenza, seguita da analisi confocale tridimensionale come un approccio efficace per indagare la localizzazione e la co-espressione di M / M marcatori fenotipici nella zona ischemica (per un'analisi più dettagliata vedi rif ^6). Questo metodo combina colorazione specifica pertinente marker di attivazione M / M con confocale tridimensionale. La messa a punto di anticorpi, siero e fluorconjugated diluizioni di lavoro permette di segnale ottimale rumore dei mar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Rat Anti-mouse CD11b	Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy
Rat Anti-mouse CD68	AbD Serotec	MCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1	Stem Cell Technologies	1404
H–chst 33342	Life technologies	H21492
Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)	CHEMICON	MAB377
Biotinilated Goat Anti-Rat antibody	Jackson Immuno Research	112-065-143
TSA Cyanine 5 System	Perkin Elmer	NEL705A001KT
Prolong Gold	Invitrogen	P36930
Anti-rat alexa 546	Invitrogen	A-11081
Anti mouse Alexa 488	Invitrogen	A-21121
Anti-rabbit Alexa 594	Invitrogen	A-11037
Normal Goat Serum	Vectors Laboratories	S-1000
Tritin X-100	Sigma	T8787
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P4417-100
Equipment
Cryostat CM1850	Leica
Olympus IX81 confocal microscope	Olympus
AnalySIS software	Olympus
Imaris software 5.0	Bitplane
Photoshop cs2	Adobe Systems
Software packages GraphPad Prism version 4.0	GraphPad Software Inc.