실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

요약

뇌 염증 반응의 복잡성에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법이 제공됩니다. 우리는 국소 허혈의 마우스 모델에서 미세 아교 세포 / 대식 세포 표현형 마커의 공동 발현 패턴을 조사하기 위해 삼차원 촛점 분석 하였다 면역 형광 기반 프로토콜을 설명한다.

초록

뇌 스트로크 미세 아교 세포 / 대 식세포 후 (M / M)가 새로운 표면 항원의 발현 및 축적되어 염증 반응을 유지하는 매개체의 생산을 포함 극적인 형태 및 표현형의 변화와 급속한 활성화를 받고있다. 신흥 증거는 M / M은 급성 뇌 손상 후 클래식 (M1) 염증성 또는 다른 항 염증 (M2) 활성화를 가정 할 수있다 높은 플라스틱 셀 있음을 나타냅니다. 그러나 부상 뇌의 M / M 표현형 마커 표현, 자신의 colocalization을 시간적 진화의 전체 특성은 아직 행방 불명입니다.

구체적으로는 M / M 활성화의 관련 마커를 염색 면역 프로토콜은 허혈성 뇌에서 수행 될 수있다. 여기에서 우리는 현지화와 같은 M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 촛점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시CD11b를, CD68, YM1, 중대 뇌동맥 (pMCAO)의 영구적 인 폐쇄에 의해 유도 된 국소 허혈의 마우스 모델에서. 오염 된 곳의 두 가지 차원의 분석은 각각의 마커가 정의 된 M / M의 형태에 관련된 및 허혈성 병변에 지정된 현지화를 가지고 있는지 알 수있다. M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴은 허혈 영역에서 입체 공 촛점 이미징에 의해 평가 될 수있다. 이미지가 비쳐 영향을 최소화하고, 파장 중복을 피하기 위해 순차 주사 모드 (180 X 135 X 10 ㎛의 부피에 해당하는 10 ㎛ Z 축 및 0.23 μm의 스텝 사이즈) 정의 된 볼륨에서 취득 할 수있다. 이미지이어서 Imaris 소프트웨어에 의해 입체 렌더링을 얻기 위해 처리된다. 세 가지 차원 렌더링의 단단한보기는 세포의 클러스터에있는 마커 식의 정의를 할 수 있습니다. 우리는 M / M은 병변 사이트 및 TI의 위치에 따라, 표현형의 다수쪽으로 분화하는 능력을 가지고 있음을 보여나 부상 후.

서문

급성 뇌 손상 후, 미세 아교 세포가 빠르게 활성화 극적인 형태 적 형질 ^1-3을 변경 받아야합니다. 이 내장 함수는 응답은 부상 뇌 실질 ^4.5으로 마이그레이션 혈액 태생의 대 식세포의 모집에 연결되어 있습니다. 항원 적으로 구별되지 않는 미세 아교 세포 및 대식 세포의 역할은 뇌 손상에서 여전히 논의된다 (이제부터 M / M라고한다). 연구의 증가는 유사 주변 식세포에 대해 설명한 것과, 미세 아교 세포와 뇌가 대식 세포는 그 극단 (M1) 고전적인 염증성 독성이나 항 염증 보호 (M2) 표현형에 해당하는 서로 다른 표현형을 가정 할 수 모집을 나타냅니다. 프로 또는 항 염증 인자의 분비를 포함하여 다른 활성 상태는, 신경 영양 분자와 리소좀의 활동 자료는 그 발현 시간에 따라 표현형 마커의 특정 패턴을 특징으로한다주변 환경의 진화. 손상된 뇌의 이러한 M / M의 표현형의 특성은 여전히​​ 빈약하다. 우리는 뇌졸중 후 M / M 발현과 진화를 분석하는 pMCAo의 잘 확립 된 쥐 모델을 사용했다. 여기에 제시된 면역 형광 기반의 프로토콜은 특정 M / M 표현형 마커, 현지화 및 허혈성 지역에서 휴대 공동 식의 모양에 대한 통찰력을 얻기를 목표로하고 있습니다. 우리는 다른 활성화 상태 또는 표현형에 관련된 몇 가지 분자를 조사, 즉 CD11b를, 백혈구 및 M / M의 활성화 / 모집 ^6-8의 널리 사용되는 마커로 표시되는 표면 마커 CD68 리소좀 ^6,7 및 YM1 분비의 마커 단백질을 선택적으로 활성화 (M2) 대 식세포에 의해 표현 및 복구 기능 복원 ^9-10에 관련된.

두 개의 마커가 동일한 셀에 의해,하지만 서로 다른 세포 내 구획으로 표현 될 때, 혼자 colocalization을 많이 INF하지 않을 수 있습니다ormative. 이 경우, 동시 발현의 분석은 하나의 평면 뷰를 사용하여 입체 렌더링에서 수행 될 수있다. 우리는 여기에서 마커 동시 발현의 철저한 입체 분석을 얻기 위해 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

1. 면역 형광

다음의 프로토콜은 (PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 식힌 50ml의 뒤에 PBS 20 ㎖, 0.1 몰 / 리터, pH가 7.4,) transcardially 관류 된 마우스로부터 얻은 뇌 관상 저온부에서 수행된다. 살포 후, 두뇌는 신중하게 제거하고 cryoprotection위한 4 ° C에서 하룻밤 PBS의 30 % 자당에 전송. 유리 병에 밀봉하여 -70 ° C에서 사용할 때까지에 저장되기 전에 3 분 동안 45 ° C - 뇌는 다음 빠르게에서 이소 펜탄에 담가 냉동. 코로나 뇌 저온부 (20 μm의)는 직렬로 잘라 면역 프로토콜 ^{11, 6을} 실시한다.

사용하기 전에 실온에 모든 시약 및 샘플을 가져와. 항체 혈청의 제시 작업 희석이 최적의 성능을 얻기 위해 만든 시험의 결과주의하시기 바랍니다. 다른 항체 및 혈청을 사용하는 경우, 프로토콜은 검증 될 필요가있다.

안티는 CD11b 및 안티 CD68 모두 차 항체는 쥐에서 만들어지기 때문에, 우리는 형광 신호 증폭과 함께 다음에 안티는 CD11b의 높은 희석을 사용 안티 쥐 알렉사 546에 의해 교차 신호를 방지 할 수 있습니다 TSA 키트 (Cy5에 Tyramide). 우리는 단계 1.17을 제외하고는 설명 프로토콜을 수행하고 표 1에보고 된 항-CD11b를 적어도 7 가지 희석액을 사용하여 안티 CD11b를위한 최적의 작업 희석을 설정했습니다. , 여기 파장에서 알렉사 546 2) 신호가 532 nm의 1) 눈에 보이는 신호 Cy5에있는 여기 파장 646 nm에서 : 그 결과, 1:30,000 유일한 희석 달성하는 것을 선택하고있다. 이러한 방법으로, 알렉사 546 형광 신호를 선택적으로 CD68의 발현과 연관되어 있습니다.

안티는 CD11b 및 안티 CD68 항체에 대한 최적의 희석은 조직의 유형에 따라 다를 수 있으며, 공동 라벨 프로토콜을 시작하기 전에 정의해야합니다.

1. PBS로 두 번 뇌 저온부을 씻으십시오.
2. 에O ₂ (형광 증폭 고추 냉이 퍼 옥시 다제, 스트렙 타비 딘-HRP와 함께 배양을해야하므로 필요한 단계는 단계 1.12 참조) 1 % H _2를 포함하는 PBS에서 5 분 cubate 저온부.
3. 세척 저온부 PBS로 2 배.
4. 10 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어.
5. PBS는 기본 AB 쥐 안티 CD11b를 [1:30,000], 10 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함에 4 ° C에서 하룻밤 저온부를 품어.
6. 세척 PBS로 2 배 (5 분) 저온부.
7. 바이오틴 차 반대로 쥐 AB [1:200] 1 % NGS를 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어.
8. 세척 저온부 PBS로 2 배.
9. TNT (0.1 M 트리스 - 염산, 산도 7.4, 0.15 M 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20 트리스 - 염산, 염화나트륨, 트윈)와 저온부을 씻으십시오.
10. TNB에서 1​​.5 시간 동안 저온부를 품어 (버퍼 트리스 - 염산 - 염화나트륨 블로킹 : 0.1 M 트리스 - 염산, 산도 7.4, 0.15 M 염화나트륨, 적절한 키트에서 0.5 % 차단 시약 (시약의 표 참조)).
11. 씻어내는섹션은 TNT와 시간을 3 배.
12. 스트렙 타비 딘-HRP [1:100]을 포함 TNB의 저온부를 품어.
13. 세척 저온부는 TNT와 3 배.
14. 시아닌 5 Tyramide [1:300]을 포함 증폭 희석제 8 분 저온부를 품어.
15. 세척 저온부 PBS로 3 배.
16. 10 % NGS 0.1 % 트리톤을 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어.
17. PBS는 기본 AB 쥐 항 CD68 [1:200], 3 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함에 4 ° C에서 하룻밤 저온부를 품어.
18. 세척 저온부 PBS로 3 배.
19. fluorconjugated 차 AB 알렉사 546 안티 쥐 [1:500] 1 % NGS를 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어.
20. 세척 저온부 PBS로 3 배.
21. 헥스 1 ㎍ / ㎖의를 포함하는 PBS에서 10 분 동안 저온부를 품어.
22. 세척 저온부 PBS로 3 배.
23. 머리말 골드에서 저온부를 탑재합니다.

2. 공 초점 현미경으로 3 차원 영상의 획득

여기에 사용되는 현미경은 3 레이저 선으로 공 초점 스캔 장치의 FV500 장착 된 IX81 현미경이었다에 Ar-Kr을 (488nm), 그는 네브라스카 레드 (646nm), 그는 네브라스카 녹색 (532nm의) 및 UV 다이오드.

1. 흥분되는 형광 염료의 파장에 따라 여기 레이저를 선택 (Cy5에, CD11b를위한 그는 네브라스카 레드, Alexa546, CD68 및 훽스트, 핵에 대한 UV 다이오드 그는 네브라스카 녹색).
2. 빛 신호 수집을위한 최적의 다이크로 익 미러의​​ 조합을 선택합니다.
3. 800 x 600 픽셀의 최소 이미지 해상도를 설정합니다.
4. 에피 형광을 사용하여 점진적으로 40X 목적으로 배율을 증가하여 관심의 영역을 식별합니다.
5. 레이저 스캐닝 현미경 (LSM) 양상으로 전환합니다.
6. 광전자 증 배관 (PMT) 및 각 채널의 게인을 조정하는 반복적 인 검사를 실행합니다. 레이저는 셋업을 용이하게하기 위해 개별적으로 설정 될 수있다. 원치 않는 비특이적 신호를 피하기 위해 가능한 한 낮은 이득을 유지한다.
7. REPE로titive 검사 실행, z 축 (총 z 축 길이 = 10 ㎛)의 하부 및 상부 극단을 정의하는 초점 제어를 이동합니다.
8. 반복적 인 검사를 중지합니다.
9. 스텝 크기를 정의합니다. 이는 Z-축 위에 표준 1시 1분 크기 비율을 구하기 픽셀 크기 (0.225 μM)에 가능한 한 가까워 야한다.
10. 칼만 필터에게 최소한 2 회를​​ 활성화합니다.
11. 비쳐 효과를 피하기 위하여 순차 주사 모드를 활성화.
12. 반쯤 Z-축을 따라 이동하여 XY 연속 스캔을 실행합니다. PMT의 설정 및 게인 (좋은 신호 / 노이즈 비율)을 확인합니다. 만족스럽지 않은 경우, 단계를 반복합니다 2.6.
13. XYZ 인수를 실행합니다.
14. multitiff 파일로 데이터를 내 보냅니다. 각 multitiff 파일은 일반적으로 3 색 채널 (파랑, 녹색, 빨강), 44 초점 비행기가 포함되어 있습니다.

3. 공 촛점 취득 및 입체 렌더링의 3 차원보기

Imaris 소프트웨어 multitiff 파일을 업로드하고 다음을 처리 :

1. 공개 소프트웨어.
2. 능가보기를 선택합니다.
3. multitiff 파일을 업로드합니다.
4. 각 채널에 대해 원하는 색상을 선택합니다.
5. 디스플레이 조정 패널 최소값을 증가시킴으로써 배경으로부터 노이즈를 제거한다. 개별적으로 각 채널을 조정합니다.
6. 섹션보기로 이동합니다. 공동 현지화 (노란색 픽셀)을 찾고 Z-축을 따라 이동합니다.
7. colocalization을가 z 축 (즉, 고체 개체에 속하는)을 따라 존재 여부를 확인하기 위해 노란색 영역을 클릭합니다. Z-축 돌기는 그림의 오른쪽 아래 부분에 볼 수 있습니다.
8. 스냅 샷을 가져 가라.
9. 보기를 능가로 이동.
10. 셀 또는 셀 클러스터를 분리하는 3D를 자릅니다.
11. 화면 조정 패널에 하나의 채널을 선택합니다.
12. 능가 / 표면 알고리즘 빌더를 선택합니다. 알고리즘 단계 :
    1. 채널을 선택합니다.
    2. 임계 값을 정의 (t에서 동일한 최소 값을 사용그는) 조정 패널을 표시합니다.
    3. 크기 조정 정의합니다.
    4. (최고의 = 0.200) 스무딩 정의합니다.
    5. 색상의 외관을 정의합니다.
    6. 알고리즘을 종료합니다.
13. 각 채널에 대해 단계 3.12를 반복합니다.
14. 화면 조정 패널에 형광 채널을 모두 취소하고 모든 세 개의면을 선택합니다.
15. 최고의 전망을 찾기 위해 볼륨을 이동합니다.
16. 스냅 샷을 가져 가라.

결과

라벨 프로토콜 및 공 촛점 인수는 허혈 영역으로 수행 될 때 얻어진 결과의 일례는도 1a 및도 1b에 도시되어있다. 획득 된 영상의 2 차원보기는 허혈 후 이십사시간에서 (A), 리소좀 마커 CD68 (녹색) 허혈성 핵심에 존재 비대 ameboid CD11b를 세포 (적색)로 표시되어 있음을 보여줍니다. 국경 지역에서 (B)는 CD11b 양성 세포는 둥근 세포 기관 및 CD68에 대한 긍정적 인 분...

토론

우리는 여기에서 허혈 영역 (더 자세한 분석을 위해 심판 ⁶ 참조)에 M / M 표현형 마커의 현지화 및 공동 발현을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 초점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 세 가지 차원 공 촛점 이미징 M / M 활성화의 관련 마커의 특정 염색을 결합한다. 항체, 혈청 희석 작업을 fluorconjugated의 미세 조정은 조사 마커 잡음 비율로 최?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Rat Anti-mouse CD11b	Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy
Rat Anti-mouse CD68	AbD Serotec	MCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1	Stem Cell Technologies	1404
H–chst 33342	Life technologies	H21492
Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)	CHEMICON	MAB377
Biotinilated Goat Anti-Rat antibody	Jackson Immuno Research	112-065-143
TSA Cyanine 5 System	Perkin Elmer	NEL705A001KT
Prolong Gold	Invitrogen	P36930
Anti-rat alexa 546	Invitrogen	A-11081
Anti mouse Alexa 488	Invitrogen	A-21121
Anti-rabbit Alexa 594	Invitrogen	A-11037
Normal Goat Serum	Vectors Laboratories	S-1000
Tritin X-100	Sigma	T8787
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P4417-100
Equipment
Cryostat CM1850	Leica
Olympus IX81 confocal microscope	Olympus
AnalySIS software	Olympus
Imaris software 5.0	Bitplane
Photoshop cs2	Adobe Systems
Software packages GraphPad Prism version 4.0	GraphPad Software Inc.