ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית

Summary

דרך להשיג תובנות חדשות על המורכבות של התגובה הדלקתית במוח מוצגת. אנו מתארים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדים כדי לחקור את הדפוס של שיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ מיקרוגליה / מקרופאג במודל של עכברים של איסכמיה מוקד.

Abstract

לאחר מיקרוגליה שבץ המוחי / מקרופאגים (ז / ז) עובר שפעול מהיר עם שינויים מורפולוגיים ופנוטיפי דרמטיים הכוללים ביטוי של פני השטח אנטיגנים רומן וייצור של מתווכים כי לבנות ולתחזק את התגובה הדלקתית. ראיות מצביעות על כך שמתעוררים M / M הם תאי פלסטיק מאוד שיכול להניח הפעלה קלאסית פרו דלקתית (M1) או חלופית אנטי דלקתית (M2) לאחר פגיעה מוחית חריפה. עם זאת אפיון של ביטוי M / M סמן פנוטיפ, colocalization והתפתחות הטמפורלית במוח נפגע מלא עדיין חסר.

פרוטוקולי Immunofluorescence במיוחד מכתימים סמנים רלוונטיים של הפעלת M / M יכולים להתבצע במוח איסכמי. כאן אנו מציגים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדי כגישה רבת עוצמה כדי לחקור את הדפוס של לוקליזציה ושיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ M / M כגוןCD11b, CD68, Ym1, במודל של עכברים של איסכמיה מוקד הנגרמת על ידי חסימה קבועה של עורק המוח האמצעי (pMCAO). ניתוח דו ממדי של האזור המוכתם מגלה כי כל סמן קשור למורפולוגיה M / M מוגדר ויש לו לוקליזציה נתון בנגע איסכמי. דפוסים של שיתוף ביטוי סמן פנוטיפ M / M ניתן להעריך על ידי confocal הדמיה תלת ממדית באזור איסכמי. ניתן לרכוש תמונות על נפח מוגדר (10 מיקרומטר Z-ציר וגודל צעד 0.23 מיקרומטר, המקביל ל 180 x 135 x 10 מיקרומטר נפח) עם מצב סריקה רציף כדי למזער את ההשפעות לדמם דרך ולהימנע מגל חופף. אז תמונות מעובדות להשיג הדמיות תלת ממדיות באמצעות תוכנת Imaris. השקפה מוצקה של שלוש הדמיות ממדיות מאפשרת ההגדרה של ביטוי סמן באשכולות של תאים. אנחנו מראים שיש לי M / M היכולת להבדיל כלפי מספר רב של פנוטיפים, תלוי במיקום באתר הנגע וtiשלי אחרי פציעה.

Introduction

לאחר פגיעה מוחית חריפה, מיקרוגליה במהירות מופעלים ולעבור מורפולוגיים ופנוטיפי דרמטיים משתנים ^1-3. תגובה מהותית זה קשור לגיוס של מקרופאגים יליד דם אשר נודדים לתוך ^4,5 parenchyma המוח נפגע. התפקיד של מיקרוגליה ומקרופאגים אשר antigenically לא להבחין (המכונה מעתה כז / ז) בפגיעה מוחית עדיין במחלוקת. מספר גדל והולך של מחקרים מצביע על כך, באופן דומה למה שתאר למקרופאגים היקפיים, מיקרוגליה ומוח מגויסים מקרופאגים יכולים להניח פנוטיפים שונים קיצוניות שמתאימה לרעיל קלאסי הפרו דלקתי (M1) או הפנוטיפ אנטי דלקתי מגן (M2). מצבי ההפעלה השונים, כולל הפרשה של גורמים פרו או אנטי דלקתיים, שחרורו של מולקולות נוירוטרופי ופעילות lysosomal מתאפיינים בדפוס מסוים של סמנים פנוטיפי, ביטוי שתלוי בזמןאבולוציה של הסביבה. האפיון של פנוטיפים M / M אלה במוח נפגע הוא עדיין מועט. אנחנו השתמשנו במודל עכברי מבוסס היטב של pMCAo לנתח ביטוי M / M ואבולוציה לאחר שבץ. פרוטוקולי Immunofluorescence מבוססים שהוצגו כאן שואפים לקבל תובנה המראה של סמנים ספציפיים M / M פנוטיפ, הלוקליזציה שלהם ושיתוף ביטוי סלולארי באזור איסכמי. אנחנו בדקנו כמה מולקולות הקשורות למצב הפעלה שונה או פנוטיפ, כלומר CD11b, סמן משטח לידי ביטוי על ידי כדוריות דם לבנות וסמן בשימוש נרחב של הפעלה / גיוס M / M ^6-8, CD68 סמן של lysosomes ^6,7 וYm1 הפרשה חלבון לידי ביטוי על ידי מקרופאגים מופעלים לחלופין (M2) וקשורה להחלמה ושיקום תפקוד ^9-10.

כאשר שני סמנים באים לידי ביטוי על ידי אותו התא, אך בתאי subcellular שונים, colocalization לבד לא יכול להיות הרבה informative. במקרה זה, ניתוח של coexpression יכול להתבצע על ידי שימוש בתצוגת מישור אחד וע"י הדמיות תלת ממד. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול כדי להשיג ניתוח תלת ממדים יסודי של coexpression סמן.

Protocol

1. Immunofluorescence

הפרוטוקול הבא מבוצע על cryosections מוח העטרה שהתקבל בעכברים perfused transcardially (20 מיליליטר של PBS, 0.1 mol / ליטר, pH 7.4, ואחריו 50 מיליליטר של paraformaldehyde המצונן 4% ב-PBS). לאחר זלוף, המוח יוסרו בזהירות והועבר לסוכרוז 30% PBS ב 4 ° C למשך הלילה לcryoprotection. אז המוח מוקפא במהירות על ידי טבילה בisopentane ב-- 45 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לפני שנחתם לתוך צלוחיות ומאוחסנים ב -70 ° C עד לשימוש. cryosections העטרה המוח (20 מיקרומטר) נחתכים באופן סדרתי וכפוף לפרוטוקול immunofluorescence ^{11, 6.}

להביא את כל חומרים כימיים ודגימות לטמפרטורת חדר לפני השימוש. אנא שים לב כי דילולים עובדים הציגו נוגדנים וסרום כתוצאה מניסויים שנעשו על מנת לקבל את הביצועים הטובים ביותר. כאשר נוגדנים וסרום שונים משמשים, הפרוטוקול צריך להיות מאומת.

class = "jove_content"> הערה שבגלל נוגדנים עיקריים הן אנטי CD11b ואנטי CD68 מבוצעים בעכברים, כדי למנוע אות צלב על ידי אנטי עכברוש אלקסה 546, השתמשנו דילול גבוה של אנטי CD11b אחרי ההגברה אות ניאון עם ערכת ה-TSA (Cy5 tyramide). הקמנו דילול העבודה האופטימלי עבור אנטי CD11b על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר פרט לצעד 1.17 ושימוש לפחות 7 דילולים שונים של אנטי CD11b כפי שדווח בטבלה 1. כתוצאה מכך, 1:30,000 נבחרו להיות הדילול רק השגת: 1) אות גלויה עם Cy5 בננומטר 646 גל העירור; 2) אין אות עם אלקסה 546 בגל עירור 532 ננומטר. בדרך זו, Alexa 546 אות ניאון קשורה באופן סלקטיבי עם ביטוי CD68.

דילולים אופטימליים עבור אנטי CD11b ונוגדנים נגד CD68 עשויים להשתנות בהתאם לסוג של רקמה וחייבים להיות מוגדרים מראש כדי להתחיל את פרוטוקול שיתוף תיוג.

1. שטוף cryosections המוח פעמיים עם PBS.
2. בתוךcryosections cubate למשך 5 דקות בPBS המכילות 1% H ₂ O ₂ (שלב נדרש מאז ההגברה הניאון צריכה דגירה עם חזרת peroxidase, streptavidin-HRP, ראה שלב 1.12).
3. cryosections לשטוף 2X עם PBS.
4. דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות NGS 10% ו0.3% טריטון.
5. דגירה cryosections ב 4 ° C למשך הלילה בPBS המכיל עיקרי Ab עכברוש אנטי CD11b [1:30,000], NGS 10% ו0.3% טריטון.
6. לשטוף cryosections 2x (5 דק ') עם PBS.
7. דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות המשני אנטי העכברוש Ab biotinylated [1:200] ו1% NGS.
8. cryosections לשטוף 2X עם PBS.
9. שטוף cryosections עם TNT (טריס-HCl, NaCl, Tween: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20).
10. דגירה cryosections ל1.5 שעות בTNB (טריס-HCl-NaCl-חסימת חיץ: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.5% מגיב חסימה מערכה מתאימה (ראה טבלה של חומרים כימיים)).
11. cryo שטפי סעיפי 3x פעמים עם TNT.
12. דגירה cryosections בTNB מכיל streptavidin-HRP [1:100].
13. cryosections לשטוף 3x עם TNT.
14. דגירה cryosections במשך 8 דקות בהגברה ממסה המכילות Cyanine 5 tyramide [1:300].
15. cryosections לשטוף 3x עם PBS.
16. דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות NGS 10% ו0.1% טריטון.
17. דגירה cryosections ב 4 ° C למשך הלילה בPBS המכיל Ab העכברוש אנטי CD68 העיקרי [1:200], 3% NGS ו0.3% טריטון.
18. cryosections לשטוף 3x עם PBS.
19. דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות Ab Alexa 546 אנטי עכברוש fluorconjugated המשני [1:500] ו1% NGS.
20. cryosections לשטוף 3x עם PBS.
21. דגירה cryosections עבור 10 דקות בPBS המכילות מיקרוגרם / מיליליטר Hoechst 1.
22. cryosections לשטוף 3x עם PBS.
23. הר cryosections בלהאריך את זהב.

2. רכישת תמונות תלת ממדיות על ידי מיקרוסקופיה confocal

s = "jove_content"> מיקרוסקופ משמש כאן היה מיקרוסקופ IX81 מצויד FV500 יחידת סריקת confocal עם 3 קווי לייזר: Ar-Kr (488nm), אדום הוא Ne-(646nm), וירוק הוא Ne-(532nm) ו דיודות UV.

1. בחר לייזרי העירור בהתאם לאורכי הגל של צבעי ניאון כדי להיות נרגש (אדום הוא Ne-לCy5, CD11b; ירוק הוא Ne-לAlexa546, CD68 ודיודות UV לHoechst, גרעינים).
2. בחר את השילוב הטוב ביותר עבור מראה dichroic אוסף אותות אור.
3. הגדר את רזולוציית תמונה במינימום של 800 600 פיקסלים.
4. לזהות את תחומי עניין של באמצעות עלית הקרינה והדרגה להגדיל את ההגדלה לאובייקטיבית 40X.
5. לעבור לשיטת לייזר סריקה מיקרוסקופית (LSM).
6. הפעל סריקות חוזרות ונשנות כדי להתאים את מכפיל (PMT) ורווח לכל ערוץ. לייזרים יכולים להיות מופעלים בנפרד כדי להקל להגדיר. שמור על רווח נמוך ככל האפשר כדי להימנע מאותות שאינם ספציפיים לא רצויים.
7. עם repetitive סריקה פועל, העבר את מוקד השליטה להגדיר קצוות העליונים ותחתונים של ציר Z (סה"כ אורך ציר z = 10 מיקרומטר).
8. תפסיק סריקה חוזרת ונשנית.
9. הגדרת גודל צעד. זה צריך להיות קרוב ככל האפשר לגודל פיקסל (0.225 מיקרומטר) כדי לקבל יחס של 1:1 בגודל סטנדרטי על ציר ה-z.
10. הפעל מסנן קלמן לפחות 2 פעמים.
11. הפעל מצב סריקה רציף כדי למנוע תופעות לדמם דרך.
12. עבור חצי דרך לאורך ציר z ולהריץ סריקה רציפה XY. בדוק את ההגדרה של PMT ורווח (יחס אות / רעש טוב). אם אינו משביע רצון, חזור על שלב 2.6.
13. הפעל רכישת XYZ.
14. נתוני יצוא כקובץ multitiff. כל קובץ multitiff בדרך כלל מכיל 3 ערוצי צבע (כחול, ירוק ואדום) ו44 מטוסי מוקד.

3. צפו בתלת ממדי של רכישות Confocal ועיבוד תלת ממדי

להעלות קבצי multitiff לתוכנת Imaris ולעבד אותם באופן הבא:

1. תוכנה פתוחה.
2. בחר את התצוגה לעלות.
3. העלה את קובץ multitiff.
4. בחר את הצבע הרצוי עבור כל ערוץ.
5. הסרת רעש מהרקע על ידי הגדלת הערך המינימאלי בלוח התאמת תצוגה. התאם כל ערוץ בנפרד.
6. עבור לתצוגת הסעיף. לנוע לאורך ציר z מחפש שיתוף לוקליזציה (פיקסלים צהובים).
7. לחץ על אזור צהוב כדי לראות אם colocalization נמצא לאורך ציר Z (כלומר שייך לאובייקט מוצק). תחזיות ציר ה-Z נראות בחלק הימני ותחתון של הדמות.
8. קח את תמונת מצב.
9. חזור כדי לעלות תצוגה.
10. יבול 3D לבודד את תא או קבוצה של תאים.
11. בחר ערוץ אחד בלוח התאמת תצוגה.
12. בחר את קבלן האלגוריתם לעלות / משטחים. צעדי אלגוריתם:
    1. בחר ערוץ.
    2. הגדרת סף (להשתמש באותו הערך מינימאלי בtהוא מציג פנל התאמה).
    3. הגדרת שינוי הגודל.
    4. להגדיר החלקה (= 0.200 הטובים ביותר).
    5. הגדר את מראה צבע.
    6. בסופו של אלגוריתם.
13. חזור על שלב 3.12 לכל ערוץ.
14. בטלו את הבחירה ערוצי הקרינה בלוח התאמת תצוגה ולבחור את כל שלושה המשטחים.
15. הזז את העצמה כדי למצוא את התצוגה הטובה ביותר.
16. קח את תמונת מצב.

תוצאות

דוגמא לתוצאות המתקבלות כאשר פרוטוקולי תיוג ורכישות confocal מתבצעים לאזור איסכמי מתוארת באיורים 1 א ו-1B. צפו בשני ממדים של תמונות שנרכשו עולה כי בעשרים וארבע שעות לאחר איסכמיה (א '), CD68 סמן lysosomal (הירוק) בא לידי ביטוי בתאי hypertrophic ameboid CD11b (אדום) נמצאים בלי?...

Discussion

אנו מציגים כאן פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדי כגישה רבת עוצמה כדי לחקור לוקליזציה ושיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ M / M לאזור איסכמי (לניתוח מפורט יותר ראה נ"צ ^6). שיטה זו משלבת מכתים ספציפי של סמן הרלוונטי של הפעלת M / M עם confocal הדמיה תלת ממדית. ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Rat Anti-mouse CD11b	Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy
Rat Anti-mouse CD68	AbD Serotec	MCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1	Stem Cell Technologies	1404
H–chst 33342	Life technologies	H21492
Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)	CHEMICON	MAB377
Biotinilated Goat Anti-Rat antibody	Jackson Immuno Research	112-065-143
TSA Cyanine 5 System	Perkin Elmer	NEL705A001KT
Prolong Gold	Invitrogen	P36930
Anti-rat alexa 546	Invitrogen	A-11081
Anti mouse Alexa 488	Invitrogen	A-21121
Anti-rabbit Alexa 594	Invitrogen	A-11037
Normal Goat Serum	Vectors Laboratories	S-1000
Tritin X-100	Sigma	T8787
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P4417-100
Equipment
Cryostat CM1850	Leica
Olympus IX81 confocal microscope	Olympus
AnalySIS software	Olympus
Imaris software 5.0	Bitplane
Photoshop cs2	Adobe Systems
Software packages GraphPad Prism version 4.0	GraphPad Software Inc.