Dreidimensionale konfokale Analyse der Mikroglia / Makrophagen-Marker der Polarisation in Experimental Brain Injury

Zusammenfassung

Ein Weg, um neue Einblicke in die Komplexität des Gehirns Entzündungsreaktion gewinnen wird vorgestellt. Wir beschreiben Immunfluoreszenz-basierte Protokolle gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse, um die Muster der Co-Expression von Mikroglia / Makrophagen-Phänotyp-Marker in einem Mausmodell der fokalen Ischämie zu untersuchen.

Zusammenfassung

Nach Schlaganfall Mikroglia / Makrophagen (M / M) zu unterziehen schnelle Aktivierung mit dramatischen morphologischen und phänotypischen Veränderungen, die die Expression von neuen Oberflächenantigene und Produktion von Mediatoren, die aufbauen und pflegen die entzündliche Reaktion umfassen. Anzeichen dafür zeigt, dass M / M sind hochKunstStoffZellen, die klassischen pro-inflammatorische (M1) oder alternative anti-inflammatorische (M2)-Aktivierung nach akuter Hirnverletzung annehmen kann. Jedoch eine vollständige Charakterisierung von M / M Phänotyp Markerexpression, ihre Co-Lokalisation und zeitlichen Entwicklung im verletzten Gehirn fehlt noch.

Immunfluoreszenz-Protokolle spezifische Färbung relevanten Marker der M / M-Aktivierung kann in der ischämischen Gehirn durchgeführt werden. Hier präsentieren wir Immunfluoreszenz-basierte Protokolle, gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse als ein leistungsfähiges Konzept, um das Muster der Lokalisierung und der Co-Expression von M / M-Phänotyp-Marker wie untersuchenCD11b, CD68, YM1, im Mausmodell der fokalen Ischämie durch permanente Okklusion der mittleren Hirnarterie (pMCAO) induziert. Zweidimensionalen Analyse des verschmutzten Bereich zeigt, dass jede Markierung zu einem definierten M / M Morphologie zugeordnet wird und eine bestimmte Lokalisierung in der ischämischen Läsion. Muster der M / M-Phänotyp-Marker co-Expression kann durch dreidimensionale konfokale Bildgebung in den ischämischen Bereich zu beurteilen. Bilder können über einen definierten Volumen erfasst werden (10 um z-Achse und einer Schrittweite von 0,23 &mgr; m, was einer 180 x 135 x 10 um das Volumen) mit einer sequentiellen Abtastmodus um Durchbluten Effekte zu minimieren und überlappenden Wellenlängen zu vermeiden. Bilder werden dann verarbeitet, um dreidimensionale Darstellungen mittels Imaris Software zu erhalten. Festansicht des dreidimensionalen Renderings erlaubt die Definition von Markerexpression in Zellhaufen. Wir zeigen, daß M / M haben die Fähigkeit, auf eine Vielzahl von Phänotypen differenzieren, abhängig von der Position in der Läsion und timich nach der Verletzung.

Einleitung

Nach einer akuten Hirnverletzung, sind Mikrogliazellen aktiviert und schnell unterziehen dramatische morphologische und phänotypische Veränderungen ^3.1. Diese Eigen Antwort wird an die Einstellung von Blut geboren Makrophagen, die in das verletzte Gehirnparenchym ^4,5 migrieren verbunden. Die Rolle der Mikroglia und Makrophagen, die antigen unterscheidbar sind nicht in Hirn-Trauma wird noch diskutiert (im Folgenden als M / M bezeichnet). Eine wachsende Zahl von Studien zeigen, dass, ähnlich wie bei peripheren Makrophagen beschrieben, Mikroglia und Gehirn rekrutiert Makrophagen können verschiedene Phänotypen, deren Extrema entsprechen klassischen proinflammatorischen toxisch (M1) oder entzündungshemmende Schutz (M2) Phänotyp annehmen. Die verschiedenen Aktivierungszustände, einschließlich Sekretion von pro-oder anti-entzündliche Faktoren werden Freisetzung von neurotrophen Moleküle und lysosomale Aktivität von einem bestimmten Muster der phänotypischen Marker, deren Expression ist abhängig von der zeitlichen gekennzeichnetEntwicklung der umliegenden Umgebung. Die Charakterisierung dieser M / M Phänotypen im verletzten Gehirn ist immer noch spärlich. Wir haben ein gut etabliertes Mausmodell der pMCAo bis M / M-Expression und Evolution nach Schlaganfall analysieren. Immunfluoreszenz-basierte Protokolle hier vorge zielen auf immer Einblick in den Auftritt von spezifischen M / M-Phänotyp-Marker, deren Lokalisierung und zellulären Co-Expression in den ischämischen Bereich. Wir untersuchten, ein paar Moleküle zu unterschiedlichen Aktivierungszustand oder Phänotyp assoziiert, nämlich CD11b, ein Oberflächenmarker von Leukozyten und einer weit verbreiteten Markierung von M / M Aktivierung / Recruitment ^8.6 ausgedrückt, CD68 ein Marker für Lysosomen ^6,7 und YM1 eine sekretorische Protein durch alternativ aktiviert (M2) Makrophagen exprimiert und zur Erholung und Wiederherstellung ^9-10 Funktion verbunden.

Wenn zwei Markierungen werden durch die gleiche Zelle, aber in unterschiedlichen subzellulären Kompartimenten exprimiert wird, kann Kolokalisation allein nicht viel informative. In diesem Fall kann die Analyse durch Coexpression mit einzelnen Draufsicht und von dreidimensionalen Renderings durchgeführt werden. Wir beschreiben ein Protokoll, um eine gründliche dreidimensionale Analyse von Marker-Co-Expression zu erhalten.

Protokoll

1. Immunfluoreszenz

Das folgende Protokoll wird koronalen Hirngefrierschnitten von Mäusen transkardial perfundiert (20 ml PBS, 0,1 mol / Liter, pH 7,4, gefolgt von 50 ml gekühltem Paraformaldehyd 4% in PBS) erhalten wurden. Nach Perfusion werden Gehirne vorsichtig abgenommen und in 30% Saccharose in PBS bei 4 ° C über Nacht zur Kryokonservierung übertragen. 45 ° C für 3 Minuten, bevor sie in Ampullen versiegelt und bei -70 ° C bis zur Verwendung gelagert - Die Gehirne werden dann schnell durch Eintauchen in Isopentan bei froren. Koronare Gehirn Gefrierschnitte (20 um) seriell zu schneiden und Immunfluoreszenz-Protokoll ^{11, 6} unterzogen.

Alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur gebracht. Bitte beachten Sie, dass die vorgestellten Arbeits Verdünnungen von Antikörpern und Serum ergaben sich aus Studien, um die beste Leistung zu erhalten, gemacht. Wenn verschiedene Antikörper und Serum verwendet werden, muss das Protokoll validiert werden.

Hinweis, dass da sowohl anti-CD11b-und Anti-CD68-Antikörper werden in primären Ratten gemacht, die grenzSignal durch anti-Ratte Alexa 546, verwendeten wir eine hohe Verdünnung von Anti-CD11b, gefolgt von Fluoreszenz-Signal-Amplifikation mit vermeiden TSA-Kit (Cy5 Tyramid). Wir haben die optimale Arbeitsverdünnung für Anti-CD11b durch die Durchführung der beschriebenen Protokoll außer Schritt 1.17 und unter Verwendung von mindestens 7 verschiedene Verdünnungen von anti-CD11b, wie in Tabelle 1 angegeben eingestellt. Als Ergebnis hat 1:30.000 gewählt, der einzige Verdünnung zu erreichen: 1) sichtbares Signal mit Cy5 bei Anregungswellenlänge 646 nm, 2) kein Signal mit Alexa 546 bei 532 nm Anregungswellenlänge. Auf diese Weise wird Alexa 546 Fluoreszenzsignal selektiv mit CD68-Expression assoziiert.

Die optimale Verdünnung für die Anti-CD11b-und Anti-CD68-Antikörper können je nach der Art des Gewebes zu variieren und muss vor der Co-Markierungsprotokoll beginnen definiert werden.

1. Zweimal waschen Gehirn Gefrierschnitte mit PBS.
2. Incubate Kryoschnitte für 5 min in PBS mit 1% H ₂ O ₂ (Schritt erforderlich, da die Fluoreszenzverstärkung benötigt Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase-Streptavidin-HRP, siehe Schritt 1.12).
3. Wash Kryoabschnitte 2x mit PBS.
4. Gefrierschnitte Inkubation für 60 min in PBS mit 10% NGS und 0,3% Triton.
5. Gefrierschnitte Inkubation bei 4 ° C über Nacht in PBS mit primären Ab Ratte anti-CD11b [1:30.000], 10% NGS und 0,3% Triton.
6. Wash 2x Gefrierschnitte (5 min) mit PBS.
7. Gefrierschnitte Inkubation für 60 min in PBS mit biotinylierten sekundären anti-Ratte Ab [1:200] und 1% NGS.
8. Wash Kryoabschnitte 2x mit PBS.
9. Mit TNT (0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20 Tris-HCl, NaCl, Tween) gewaschen Gefrierschnitten.
10. Gefrierschnitte Inkubation für 1,5 h in TNB (Tris-HCl-NaCl-Blocking-Puffer: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% Blocking-Reagenz aus entsprechenden Kit (siehe Tabelle der Reagenzien)).
11. Wash KryoAbschnitte 3x mal mit TNT.
12. Inkubieren Gefrierschnitten in TNB enthält Streptavidin-HRP [1:100].
13. Wash Kryoabschnitte 3x mit TNT.
14. Gefrierschnitte Inkubation für 8 min in Amplification Diluent enthält Cyanine 5 Tyramid [1:300].
15. Wash Kryoabschnitte 3x mit PBS.
16. Gefrierschnitte Inkubation für 60 min in PBS mit 10% NGS und 0,1% Triton.
17. Gefrierschnitte Inkubation bei 4 ° C über Nacht in PBS mit primären Ab Ratte anti-CD68 [1:200], 3% NGS und 0,3% Triton.
18. Wash Kryoabschnitte 3x mit PBS.
19. Gefrierschnitte Inkubation für 60 min in PBS mit fluorconjugated Sekundär Ab Alexa 546 anti-Rat [1:500] und 1% NGS.
20. Wash Kryoabschnitte 3x mit PBS.
21. Gefrierschnitte inkubieren für 10 min in PBS mit Hoechst 1 ug / ml.
22. Wash Kryoabschnitte 3x mit PBS.
23. Montieren Gefrierschnitten in Prolong Gold.

2. Erwerb der dreidimensionale Bilder durch konfokale Mikroskopie

Das hier verwendete Mikroskop war ein IX81-Mikroskop mit einem konfokalen Scaneinheit FV500 mit 3 Laserlinien ausgestattet: Ar-Kr (488 nm), He-Ne-rot (646nm) und He-Ne-Grün (532 nm) und eine UV-Diode ist.

1. Aus den Anregungslaser in Abhängigkeit von den Wellenlängen der Fluoreszenzfarbstoffe angeregt werden (He-Ne rot für Cy5, CD11b, He-Ne-Grün für Alexa546, CD68 und UV-Diode für Hoechst, Kerne).
2. Wählen Sie die beste Kombination für dichroitischen Spiegel Lichtsignal-Sammlung.
3. Richten Sie die Bildauflösung auf mindestens 800 x 600 Pixel.
4. Identifizieren Sie einen Bereich von Interesse, indem Auflicht-Fluoreszenz und die schrittweise Erhöhung der Vergrößerung auf dem 40X-Objektiv.
5. Wechseln Sie in der Laser Scanning Mikroskopie (LSM) Modalität.
6. Führen repetitiven Scans, um die Photomultiplier (PMT) und die Verstärkung für jeden Kanal eingestellt werden. Laser können einzeln eingeschaltet, um die Einrichtung zu erleichtern. Halten Verstärkung so gering wie möglich, um unerwünschte nicht-spezifische Signale zu vermeiden.
7. Mit repebewerbs Scan läuft, bewegen Sie den Fokussteuerung, um untere und obere Extrem der z-Achse (z-Achse Gesamtlänge = 10 um) zu definieren.
8. Stoppen wiederholende Scan.
9. Definieren Sie die Schrittweite. Es sollte so nah wie möglich an die Pixelgröße (0,225 um), einen Standard 1:1 Größe-Verhältnis über die z-Achse zu erhalten.
10. Aktivieren Kalman-Filter mindestens 2 mal.
11. Aktivieren sequentiellen Scan-Modus zu bluten Durcheffekte zu vermeiden.
12. Gehen Sie auf halbem Weg entlang der z-Achse und führen Sie einen xy sequentiellen Scan. Überprüfen Sie die Einrichtung von PMT und Verstärkung (gutes Signal / Rausch-Verhältnis). Wenn nicht zufriedenstellend ist, wiederholen Sie Schritt 2.6.
13. Führen xyz Akquisition.
14. Exportieren von Daten als MultiTIFF Datei. Jeder MultiTIFF Datei enthält typischerweise 3 Farbkanäle (blau, grün und rot) und 44 Fokusebenen.

3. Dreidimensionale Ansicht der konfokale Akquisitionen und dreidimensionale Wiedergabe

Galerie MultiTIFF Dateien Imaris Software und verarbeiten sie wie folgt:

1. Offene Software.
2. Wählen Sie die Ansicht übertreffen.
3. Laden Sie die Datei MultiTIFF.
4. Wählen Sie die gewünschte Farbe für jeden Kanal.
5. Rauschen entfernen aus dem Hintergrund durch die Erhöhung der Mindestwert auf dem Display-Panel Einstellung. Stellen Sie jeden Kanal einzeln.
6. Gehen Sie auf die Schnittansicht. Bewegen sich entlang der z-Achse nach Co-Lokalisation (gelbe Pixel).
7. Klicken Sie auf eine gelbe Fläche, um zu sehen, ob die Co-Lokalisation entlang der z-Achse (dh gehört zu einem festen Objekt) vorhanden ist. Z-Achsen-Projektionen sind in der rechten und unteren Teil der Figur sichtbar ist.
8. Machen Sie einen Schnappschuss.
9. Gehen Sie auf Ansicht zu übertreffen.
10. Crop 3D, um eine Zelle oder eine Gruppe von Zellen zu isolieren.
11. Wählen Sie einen Kanal auf der Displayanpassung Panel.
12. Wählen Sie die zu übertreffen / Oberflächen Algorithmus Builder. Algorithmusschritte:
    1. Wählen Sie Kanal.
    2. Schwelle definieren (mit dem gleichen Mindestwert in ter angezeigt Anpassung Platte).
    3. Definieren Sie Größenänderung.
    4. Definieren Glättung (beste = 0,200).
    5. Farbe definieren Aussehen.
    6. End-Algorithmus.
13. Wiederholen Sie Schritt 3.12 für jeden Kanal.
14. Deaktivieren Fluoreszenzkanäle auf dem Display-Panel Einstellung und wählen Sie alle drei Flächen.
15. Bewegen Sie die Lautstärke auf den besten Blick zu finden.
16. Machen Sie einen Schnappschuss.

Ergebnisse

Ein Beispiel der erhalten wird, wenn die Kennzeichnung Protokolle und konfokalen Nahmen sind in den ischämischen Bereich durch Ergebnisse ist in den 1A und 1B dargestellt. Eine zweidimensionale Ansicht der aufgenommenen Bilder zeigt, dass 24 Stunden nach der Ischämie (A), der lysosomalen Marker CD68 (grün) in hypertrophen amöboider CD11b-Zellen (rot) in der ischämischen Kern vorhanden ausgedrückt. In der Grenzzone (B) CD11b-positiven Zellen anzuze...

Diskussion

Wir präsentieren hier Immunfluoreszenz-basierte Protokolle, gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse als ein leistungsfähiges Konzept für Lokalisierung und Co-Expression von M / M-Phänotyp-Marker in den ischämischen Bereich (für eine detaillierte Analyse vgl. Rz ⁶⁾ zu untersuchen. Dieses Verfahren vereint eine spezifische Färbung der entsprechenden Markierung der M / M-Aktivierung mit dreidimensionaler konfokaler Bildgebung. Die Feinabstimmung von Antikörpern, Serum und fluorconjugated Arbeits...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Rat Anti-mouse CD11b	Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy
Rat Anti-mouse CD68	AbD Serotec	MCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1	Stem Cell Technologies	1404
H–chst 33342	Life technologies	H21492
Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)	CHEMICON	MAB377
Biotinilated Goat Anti-Rat antibody	Jackson Immuno Research	112-065-143
TSA Cyanine 5 System	Perkin Elmer	NEL705A001KT
Prolong Gold	Invitrogen	P36930
Anti-rat alexa 546	Invitrogen	A-11081
Anti mouse Alexa 488	Invitrogen	A-21121
Anti-rabbit Alexa 594	Invitrogen	A-11037
Normal Goat Serum	Vectors Laboratories	S-1000
Tritin X-100	Sigma	T8787
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P4417-100
Equipment
Cryostat CM1850	Leica
Olympus IX81 confocal microscope	Olympus
AnalySIS software	Olympus
Imaris software 5.0	Bitplane
Photoshop cs2	Adobe Systems
Software packages GraphPad Prism version 4.0	GraphPad Software Inc.