Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury

Resumen

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

Resumen

Después de ictus cerebral microglia / macrófagos (M / M) se someten a una activación rápida con cambios morfológicos y fenotípicos dramáticos que incluyen la expresión de antígenos de superficie y producción de nuevos mediadores que construyen y mantienen la respuesta inflamatoria. Nuevas pruebas indican que M / M son células altamente plástico que pueden asumir anti-inflamatorio de activación clásica pro-inflamatoria (M1) o alternativa (M2) después de la lesión cerebral aguda. Sin embargo, una caracterización completa de M / M marcador expresión fenotipo, su colocalización y evolución temporal en el cerebro lesionado sigue desaparecido.

Protocolos de tinción de inmunofluorescencia específicamente marcadores pertinentes de la activación M / M se pueden realizar en el cerebro isquémico. Aquí presentamos protocolos basados ​​en inmunofluorescencia seguido por análisis confocal tridimensional como un enfoque poderoso para investigar el patrón de localización y co-expresión de marcadores de fenotipo M / M, tales comoCD11b, CD68, Ym1, en modelo de ratón de isquemia focal inducida por la oclusión permanente de la arteria cerebral media (pMCAO). Análisis bidimensional de la zona manchada revela que cada marcador se asocia a una morfología M / M definido y tiene una localización dada en la lesión isquémica. Patrones de M / M marcador de fenotipo co-expresión puede evaluarse de imagen confocal tridimensional en la zona isquémica. Las imágenes pueden ser adquiridas en un volumen definido (10 micras Z-eje y un tamaño de 0,23 micras paso, que corresponde a un volumen de 180 x 135 x 10 micras) con un modo de escaneo secuencial para minimizar los efectos de sangrado a través de la longitud de onda y evitar la superposición. Las imágenes se procesaron a continuación para obtener representaciones en tres dimensiones por medio de un software Imaris. Vista sólido de tres representaciones tridimensionales permite la definición de la expresión del marcador en grupos de células. Se demuestra que M / M tienen la capacidad de diferenciarse hacia una multitud de fenotipos, dependiendo de la localización en el sitio de la lesión y Timí después de la lesión.

Introducción

Después de una lesión cerebral aguda, microglia se activan rápidamente y se someten morfológica dramática y fenotípica cambios ^1-3. Esta respuesta intrínseca está asociada a la contratación de los macrófagos de origen sanguíneo que migran en el ^4,5 parénquima cerebral lesionado. El papel de los macrófagos y microglia que antigénicamente no son distinguibles (en adelante el M / M) en el daño cerebral es todavía debatido. Un número creciente de estudios indican que, de manera similar a lo descrito para los macrófagos periféricos, la microglía y los macrófagos reclutados cerebro pueden asumir diferentes fenotipos cuyos extremos corresponden a classic pro-inflamatoria tóxica (M1) o de protección (M2) fenotipo antiinflamatorio. Los diferentes estados de activación, incluyendo la secreción de factores pro-o anti-inflamatorias, la liberación de moléculas neurotróficas y la actividad lisosomal se caracterizan por un patrón específico de marcadores fenotípicos, cuya expresión depende de lo temporalevolución del entorno circundante. La caracterización de estos fenotipos M / M en el cerebro lesionado es todavía escasa. Se utilizó un modelo murino bien establecida de pMCAo para analizar la expresión M / M y la evolución después del accidente cerebrovascular. Protocolos de inmunofluorescencia con base aquí presentados tienen como objetivo conseguir una idea de la apariencia de los marcadores específicos de M / M fenotipo, su localización y celular co-expresión en el área isquémica. Investigamos unas pocas moléculas asociadas a diferentes estado de activación o fenotipo, es decir, CD11b, un marcador de superficie expresada por los leucocitos y un marcador ampliamente utilizado de M / M de activación / contratación ^6-8, CD68 un marcador de lisosomas ^6,7 y YM1 un secretora proteína expresada por activados alternativamente (M2) y los macrófagos asociados a la recuperación y restauración de la función ^9-10.

Cuando dos marcadores son expresados ​​por la misma célula, pero en diferentes compartimentos subcelulares, colocalización por sí sola no puede ser mucho informative. En este caso, el análisis de coexpresión se puede realizar mediante el uso de una sola vista en planta y por las representaciones tridimensionales. Estamos aquí describir un protocolo para obtener un análisis tridimensional completo de coexpresión del marcador.

Protocolo

1. Inmunofluorescencia

El siguiente protocolo se realiza en secciones criogénicas cerebrales coronales obtenidas de ratones perfundidos transcardialmente (20 ml de PBS, 0,1 moles / litro, pH 7,4, seguido de 50 ml de paraformaldehído al 4% enfriado en PBS). Después de la perfusión, los cerebros se retiran y se transfieren a 30% de sacarosa en PBS a 4 ° C durante la noche para crioprotección cuidadosamente. Los cerebros se congelan rápidamente por inmersión en isopentano a - 45 ° C durante 3 min antes de ser sellado en viales y se almacenaron a -70 ° C hasta su uso. Criosecciones cerebrales coronales (20 m) se cortan en serie y se sometieron a protocolo de inmunofluorescencia ^{11, 6.}

Llevar todos reactivos y muestras a temperatura ambiente antes de su uso. Por favor, tenga en cuenta que los presentados diluciones de trabajo de anticuerpos en suero y el resultado de las pruebas realizadas con el fin de obtener el mejor rendimiento. Cuando se utilizan diferentes anticuerpos y el suero, el protocolo debe ser validado.

Nota que debido a anticuerpos primarios tanto anti-CD11b y anti-CD68 se hacen, en la rata, para evitar la señal de cruce por anti-rata Alexa 546, se utilizó una alta dilución de anticuerpos anti-CD11b seguido de amplificación de la señal fluorescente con kit TSA (Cy5 tiramida). Hemos puesto en marcha la dilución de trabajo óptima para el anti-CD11b realizando el protocolo descrito excepto el paso 1.17 y el uso de por lo menos 7 diferentes diluciones de anti-CD11b como se informa en la Tabla 1. Como resultado, 1:30.000 ha sido elegido ser el único dilución lograr: 1) la señal visible con Cy5 a una excitación de longitud de onda 646 nm; 2) no hay señal con Alexa 546 en la longitud de onda de excitación de 532 nm. De esta manera, Alexa 546 señal fluorescente se asocia selectivamente con la expresión de CD68.

Las diluciones óptimas para los anticuerpos anti-CD68 anti-CD11b y pueden variar dependiendo del tipo de tejido y debe ser definido antes de iniciar el protocolo de co-etiquetado.

1. Lave cryosections cerebro dos veces con PBS.
2. Encryosections Cubate durante 5 minutos en PBS que contenía 1% de H ₂ O ₂ (paso necesario ya que la amplificación fluorescente necesita incubación con peroxidasa de rábano picante, estreptavidina-HRP, consulte el paso 1.12).
3. Cryosections Lave 2X con PBS.
4. Incubar durante 60 min cryosections en PBS que contenía 10% de NGS y 0,3% Tritón.
5. Incubar criosecciones a 4 ° C durante la noche en PBS que contenía primaria Ab de rata anti-CD11b [1:30.000], 10% de NGS y 0,3% de Triton.
6. Lavado cryosections 2x (5 min) con PBS.
7. Incubar durante 60 min cryosections en PBS que contengan biotina secundario anti-Rata Ab [1:200] y 1% de NGS.
8. Cryosections Lave 2X con PBS.
9. Lavar criosecciones con TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,15 M, 0,05% de Tween 20).
10. Incubar criosecciones durante 1,5 h en TNB (tampón Tris-HCl-NaCl-Bloqueo: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,15 M, 0,5% de reactivo de bloqueo del kit apropiado (véase la tabla de reactivos)).
11. Lave criosecciones 3x veces con TNT.
12. Incubar criosecciones en TNB que contienen estreptavidina-HRP [1:100].
13. Cryosections Lave 3x con TNT.
14. Incubar cryosections durante 8 minutos en la amplificación de diluyente que contiene Cyanine 5 tiramida [1:300].
15. Cryosections Lave 3 veces con PBS.
16. Incubar durante 60 min cryosections en PBS que contenía 10% de NGS y 0,1% Tritón.
17. Incubar criosecciones a 4 ° C durante la noche en PBS que contenía primaria Ab de rata anti-CD68 [1:200], 3% de NGS y 0,3% de Triton.
18. Cryosections Lave 3 veces con PBS.
19. Incubar cryosections durante 60 minutos en PBS que contenía fluorconjugated secundaria Ab Alexa 546 anti-rata [1:500] y 1% de NGS.
20. Cryosections Lave 3 veces con PBS.
21. Incubar criosecciones durante 10 min en PBS que contiene Hoechst 1 g / ml.
22. Cryosections Lave 3 veces con PBS.
23. Montar cryosections en Prolong oro.

2. La adquisición de imágenes tridimensionales por microscopía confocal

El microscopio usado aquí fue un microscopio IX81 equipado con una unidad de digitalización FV500 confocal con 3 líneas de láser: Ar-Kr (488nm), rojo de He-Ne (646nm) y He-Ne verde (532 nm) y un diodo UV.

1. Seleccione los láseres de excitación en función de las longitudes de onda de los tintes fluorescentes para ser excitados (rojo He-Ne para Cy5, CD11b, He-Ne verde para Alexa546, CD68 y el diodo UV para Hoechst, núcleos).
2. Seleccione la mejor combinación espejo dicroico para la recolección de señal luminosa.
3. Configure la resolución de imagen en un mínimo de 800 x 600 píxeles.
4. Identifique un área de interés mediante el uso de epi-fluorescencia y aumentar progresivamente la ampliación con el objetivo de 40X.
5. Cambie a Láser Scanning Microscopy (LSM) modalidad.
6. Ejecutar exploraciones repetitivas para ajustar el fotomultiplicador (PMT) y la ganancia para cada canal. Los láseres pueden ser activados individualmente para facilitar la puesta en marcha. Mantener el aumento de lo más bajo posible para evitar señales no específicas no deseadas.
7. Con repetitive ejecución del análisis, mover el control de enfoque para definir los extremos inferior y superior de el eje z (longitud total del eje z = 10 micras).
8. Detener exploración repetitiva.
9. Definir el tamaño de paso. Debe ser lo más cerca posible de tamaño de píxel (0,225 m) para obtener una relación de tamaño 1:01 estándar sobre el eje z.
10. Activar filtro de Kalman por lo menos 2 veces.
11. Activar el modo de exploración secuencial para evitar efectos sangrar a través.
12. Ir a mitad de camino a lo largo del eje z y ejecutar un análisis secuencial xy. Compruebe la configuración de PMT y la ganancia (buena relación señal / ruido). Si no es satisfactoria, repita el paso 2.6.
13. Ejecute adquisición xyz.
14. Exportar datos como archivo multitiff. Cada archivo multitiff normalmente contiene 3 canales de color (azul, verde y rojo) y 44 planos focales.

3. Vista tridimensional de Adquisiciones confocal y de representación tridimensional

Subir archivos multitiff al software Imaris y procesarlos como sigue:

1. El software libre.
2. Seleccione la vista de superar.
3. Cargue el archivo multitiff.
4. Seleccione el color deseado para cada canal.
5. Eliminar el ruido de fondo, aumentando el valor mínimo en el panel de ajuste de pantalla. Ajuste cada canal individualmente.
6. Vaya a la vista de sección. Mover a lo largo del eje z en busca de co-localización (píxeles amarillos).
7. Haga clic en un área amarilla para ver si la colocalización está presente a lo largo del eje z (es decir, pertenece a un objeto sólido). Proyecciones del eje Z son visibles en la parte derecha y la parte inferior de la figura.
8. Tomar una instantánea.
9. Volver a superar la vista.
10. Recortar 3D para aislar una célula o un grupo de células.
11. Seleccione un canal en el panel de ajuste de pantalla.
12. Seleccione la superarán / superficies algoritmo constructor. Pasos del algoritmo:
    1. Seleccione el canal.
    2. Definir umbral (utilizar el mismo valor mínimo de tse muestra el panel de ajuste).
    3. Definir el cambio de tamaño.
    4. Definir suavizado (mejor = 0,200).
    5. Definir la apariencia del color.
    6. Fin algoritmo.
13. Repita paso 3,12 para cada canal.
14. Anule la selección de canales de fluorescencia en el panel de ajuste de la pantalla y seleccionar todas las tres superficies.
15. Mueva el volumen para encontrar la mejor vista.
16. Tomar una instantánea.

Resultados

An example of the results obtained when labeling protocols and confocal acquisitions are carried out into the ischemic region is illustrated in Figures 1A and 1B. A two dimensional view of acquired images shows that at twenty-four hours after ischemia (A), the lysosomal marker CD68 (green) is expressed in hypertrophic ameboid CD11b cells (red) present in the ischemic core. In the border zone (B) CD11b positive cells display round cell bodies and ramified...

Discusión

We present here immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate localization and co-expression of M/M phenotype markers into the ischemic area (for a more detailed analysis see ref ⁶). This method combines specific staining of relevant marker of M/M activation with three-dimensional confocal imaging. The fine tuning of antibodies, serum and fluorconjugated working dilutions allows optimal signal to noise ratio of the investigated m...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Rat Anti-mouse CD11b	Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy
Rat Anti-mouse CD68	AbD Serotec	MCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1	Stem Cell Technologies	1404
H–chst 33342	Life technologies	H21492
Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)	CHEMICON	MAB377
Biotinilated Goat Anti-Rat antibody	Jackson Immuno Research	112-065-143
TSA Cyanine 5 System	Perkin Elmer	NEL705A001KT
Prolong Gold	Invitrogen	P36930
Anti-rat alexa 546	Invitrogen	A-11081
Anti mouse Alexa 488	Invitrogen	A-21121
Anti-rabbit Alexa 594	Invitrogen	A-11037
Normal Goat Serum	Vectors Laboratories	S-1000
Tritin X-100	Sigma	T8787
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P4417-100
Equipment
Cryostat CM1850	Leica
Olympus IX81 confocal microscope	Olympus
AnalySIS software	Olympus
Imaris software 5.0	Bitplane
Photoshop cs2	Adobe Systems
Software packages GraphPad Prism version 4.0	GraphPad Software Inc.