四环素调节细胞株产生高滴度的慢病毒载体，专门针对树突状细胞

摘要

这里，我们用逆转录病毒转导和concatemeric的转染建立的细胞系中能表达的慢病毒载体（LV）的组件在没有四环素。此LV编码绿色荧光蛋白是一种糖蛋白，SVGmu，这是具体的树突状细胞上的受体与假。

摘要

慢病毒载体（逻辑卷）是许多类型的细胞提供遗传材料的有力手段。由于相关的安全问题与这些HIV-1的衍生载体，产生大量的LVS是具有挑战性的。在本文中，我们报道了一种用于生产高滴度自我失活LVS的。逆转录病毒转导的tet过稳定线GPR生产细胞产生的细胞系，GPRS，它可以表示所有的病毒组分，包括树突状细胞特异性糖蛋白，SVGmu。然后，我们使用concatemeric的LV的转移质粒编码DNA转染，转染报道基因GFP的组合用一个可选择的标记。得到的克隆可以制作LV上面滴度大于10倍的我们实现与瞬时转染的。另外，这些病毒高效转染树突状细胞在体外和产生强烈的T细胞免疫反应向本报记者抗原。这种方法可能是一个不错的选择FOŗ强LV为基础的疫苗，癌症或传染病的临床研究。

引言

已经开发了许多载体系统的基因传递。基于慢病毒载体已跻身研究最常用的病毒系统。这些载体是有利的，因为他们可以高效转染分裂和非分裂细胞^1，由于整合到宿主基因组实现长期表达，表现出低的天然抗载体在大多数人群的免疫力，并具有低潜力从插入突变^3,4的遗传毒性。

慢病毒的生产安全问题一直着色。慢病毒载体一般是来自于HIV-1，艾滋病的病原体。单个元件的慢病毒（转让，外壳和包装质粒）的瞬时转染是一种常见的和灵活的方法，在实验室设置中提供的遗传物质。然而，扩大规模的临床应用瞬时转染是繁琐和马的Ÿ导致复制能力的慢病毒^5,6的发展。要克服这些障碍，稳定的包装和生产细胞系已开发^6-11。这些线路之一，探地雷达的包装生产线^11，受四环素有吸引力的优势。在本文中，我们将演示如何适应这种系统产生自我失活的慢病毒载体，是专门面向树突状细胞^{（DC-LVS）12。}

树突状细胞（DC）是最强大的抗原呈递细胞的免疫系统。他们已经在癌症疫苗开发的主题极大的兴趣，因为它们直接启动，程序和规范肿瘤特异性免疫反应^13。装有包括区议会有可能引出更强的抗肿瘤免疫反应比肽或DNA疫苗的接种方案。最近，我们已经开发出一种慢病毒载体，specificallÝ针对树突状细胞，通过修改辛德毕斯病毒糖蛋白，SVGmu ^14。这些载体是独特的，他们表现出高特异性树突状细胞，并产生更强的免疫反应比特异性，VSVG假型载体。

在这里，我们报告的方法产生大量的这些直流针对性的慢病毒载体。我们表明，这些DC-LVS可以感染区议会和产生强烈的CD8 ^{+ T}细胞的免疫反应。所有程序涉及动物的人道待遇，执行下USC Intitutional动物护理和使用委员会批准。为了执行在体内和临床实验，这是至关重要的建立的细胞系，可以制作高滴度的病毒。执行转导和转染与所述的相同的步骤，将产生这样的克隆的机会最大化。

研究方案

DC-LV稳定生产细胞构造基于对GPR包装细胞系¹¹包含必要的慢病毒组件gagpol，转和TET关闭系统。首先，逆转录病毒转导是用来产生一个GPRS编码一个四面体依赖SVGmu的糖蛋白的包装细胞系。然后，连环体数组转染用于转染的GPRS慢病毒载体的转基因如GFP细胞系。指定为LV-mGFP的这种稳定的生产细胞系，可在体外和体内进行测试，它能够产生一个DC-LV疫苗的GFP。

1。生成一个春节依赖SVGmu的细胞系

质粒PRX-SVGmu是一个构建体，其中被克隆的DC-特异性糖蛋白SVGmu的的下游启动子的逆转录病毒质粒pRetroX四环素销^1（ 图1C），tTA的先进。文化293T细胞在D10（Dulbecco改良的Eagle培养基与10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺）。文化GPR与多西环素（1毫微克/毫升）和嘌呤霉素（2微克/毫升）在D10的包装细胞系。所有细胞培养在5％CO _2，饱和湿度37℃培养箱。

1. 瞬时转染前16-18小时，板2×10 ⁶ 293T细胞在4ml的D10在6厘米的组织培养皿中，例如，细胞在转染时的接近90％汇合。
2. 逆转录病毒质粒转染 :混合100微升1.25M的CaCl ₂的溶液，无菌Milli-Q水和下列质粒:5微克PRX-SVGmu的，2.5微克pGag聚合物，2.5微克pVSV-G。最终体积为500微升。 5毫升聚苯乙烯圆底管，加入500μl2X HBS（50毫米HEPES，氯化钾10毫米，12毫米葡萄糖，氯化钠280毫米，1.5毫米的Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O，pH值7.05）。添加质粒进入2X HBS缓冲区的混合物滴鼓泡缓冲区的同时大力巴斯德玻璃吸管。添加英里后夹具，继续冒泡另一个30秒。然后，将整个混合物添加到293T细胞在6厘米培养皿中，在37℃下
3. 4小时后，转染，仔细更换介质在培养皿中，用4毫升预热D10。
4. 自旋感染 :在转染后48小时，收获SVGmu编码，在上清液中的逆转录病毒颗粒的上清液通过0.45μm的过滤器通过。 GPR包装板在24孔板中的细胞在2×10 ⁴个细胞/孔。添加过滤上清液GPR包装细胞中的菜（2毫升/孔），离心细胞90分钟，以1050×g，25℃下更改介质到新鲜的D10与强力霉素（1纳克/毫升）后旋感染（2毫升/）。
5. 转染后72小时，扩大文化转D10用强力霉素（1纳克/毫升）和嘌呤（2毫微克/毫升）包装细胞。
6. 要确认SVGmu，培养细胞的表达没有强力霉素48小时。测量表面前的SVGmu PRESSION流式细胞仪，使用抗辛德毕斯血清。这些细胞被指定为GPRS包装细胞系。

2。构建DC LV生产者细胞连环阵转

慢病毒转移质粒TL20-GFP的是一个自失活慢病毒转移载体质粒基于pCL20c MSCV-GFP一个霉素调节的病毒RNA基因组的表达系统和巨细胞病毒（CMV）的增强子与7 四面体运营商（ 图^1C）11更换^，12,15。质粒PGK-BLE是一种抗博莱霉素（BLE）盒式磁带驱动由弱PGK启动子^2。

1. 月刊20微克质粒TL20 SFII GFP用限制性内切酶在50℃下精华20微克质粒PGK-BLE PflMI位在37°C。
2. 通过琼脂糖凝胶电泳纯化DNA片段（PGK表盒1011 bp和矢量TL20-GFP为6861碱基对）。
3. 结扎TL20-GFP载体和PGK-表盒（NEB的T4 DNA连接酶）的摩尔比为25:1。在室温下孵育过夜。
4. 隔夜后结扎，纯化DNA连接混合物（Qiagen公司的DNeasy血液和组织工具包）。确保纯化的DNA的量为约5微克。
5. 转染前16-18小时，板GPRS包装细胞在6厘米的组织培养皿中，使得将约90％汇合的转染时。
6. 使用在步骤1.2中所述的纯化的concatemeric DNA转染5微克到GPRS包装细胞在6厘米的组织培养皿中的磷酸钙转染方法。 4小时后，转染，小心取出介质，并更换有4毫升预热D10采用强力霉素（1纳克/毫升）。
7. 转染后48小时，更改到D10中的介质与多西环素（1毫微克/毫升）和嘌呤霉素（2微克/毫升）。吉欧霉素（50微克/毫升）在培养基中加入转染克隆的选择。培养细胞约2周，直到细胞科洛尼ES可以看出底部的菜肴。
8. 标记的细胞集落，在底部的菜肴。径24孔组织培养皿中，数量的孔，并加至各孔中的2毫升D10含有Zeocin的（50微克/毫升），多西环素（1毫微克/毫升），嘌呤霉素（2微克/毫升）。吸媒介转染细胞，然后添加一个胰蛋白酶下降到不到一分钟，每个殖民地。然后，添加一个或多个下降的D10相同的菌落。拿起菌落逐个用吸管，并将它们传送到单独的井24孔细胞培养板。
9. 文化和扩大D10含有Zeocin的（50微克/毫升），多西环素（1毫微克/毫升）和嘌呤霉素（2微克/毫升）中的所有细胞克隆的病毒产生能力的评价。

3。评估病毒生产的每一个细胞克隆

1. 胰蛋白酶消化的生产者细胞和板周围4×10 ⁶ 6-D10厘米的组织培养皿中的细胞在没有强力霉素等汇合超过90％。每天用新鲜预热D10更换介质和收集介质滴度检测72小时，取出后DOX。
2. 收获的病毒上清用0.45微米的过滤器通过过滤介质。
3. 板靶细胞表达DC-SIGN受体（ 如 293T.hDC-SIGN或小鼠骨髓来源的树突状细胞的^16）和293T细胞作为阴性对照，在96孔培养皿中，1×10 ⁴个细胞/孔。 2倍系列稀释的病毒上清添加到各孔中（100μl/孔）。 ，6-8的稀释度一般足以达到在其中转导的GFP阳性细胞是在添加的病毒量成线性关系的范围内。
4. 离心细胞，更换介质，在步骤1.4中所述。 DC培养上清应培养在RPMI培养基中含10％FBS和GM-CSF（1:20 J558L条件培养基）。
5. 测量GFP表达的转染细胞，通过流式细胞仪检测转导后4-6天。慢病毒的VECTO的ŗ滴度计算向量中的稀释范围内时，GFP阳性细胞的百分比和矢量量的线性关系。具有最高的病毒生产用于后续的应用中选择的细胞克隆。

4。生产和集中慢病毒载体

1. 文化生产者细胞系（LV-mGFP的），在15厘米的组织培养皿。
2. 胰蛋白酶消化的的生产者细胞和板细胞在15厘米的组织培养皿中，在大于90％汇合在多西环素的新鲜D10无。更改介质每日新鲜的，预先加热D10。
3. 峰值病毒生产（由用户确定）的时间，收获病毒上清，用0.45微米的过滤器过滤。装入过滤上清液成厚壁32.5毫升超速离心管，封口的封口膜和离心机以50,000 xg，4°C，90分钟。彻底将沉淀重悬于50μl或适当体积的PBS或HBSS中，根据不同的应用。

5。免疫小鼠体内，并分析抗原特异性免疫反应

1. 第4节所述产生高滴度的病毒。
2. 通过载体悬浮（25微升每脚垫）脚垫路由注入BALB / c小鼠（6-8周龄，女）。
3. 免疫后2周，隔离健脾和收获脾。培养脾细胞用GFP的表位肽和分析GFP特异的CD8 ⁺ T细胞，使用细胞内细胞因子染色的存在下，如前面所述^17（ 图3B）。

结果

在该方法中所述的稳定的细胞系，可以专门针对树突状细胞的慢病毒载体，大批量地生产。 图1B中所示，分离单个克隆，得到的稳定细胞株的不同的质量^12。在测试的26个克隆中，有8产生的慢病毒颗粒滴度大于10 ⁶转导单位每毫升（TU /毫升），这是一个典型的为SVG的假型化慢病毒载体瞬时转染产生的基准。在同一时间，几个克隆产生小于10 ⁴ TU /毫升，隔离是很?...

讨论

在这里，我们已经提出了一个方法生产大量使用慢病毒载体293T细胞稳定转关监管制度下TET所有慢病毒组件。至目前为止，大多数协议产生慢病毒载体依赖于标准的磷酸钙瞬时转染（见^18）。这种方法已成功地在一个临床范围，但它可能遭受的一些限制，不太可能是存在于扩大生产的稳定细胞株。例如，与大量的LV质粒的共转染理论上可以增加复制能力的慢病毒¹⁹的发展机会。此外?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Mediatech Inc.	10-013-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Mediatech Inc.	25-005-Cl
Doxycycline	Clontech Laboratories, Inc.	631311
Zeocin	Invitrogen	R250-01	Toxic
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506