Тетрациклин-регулируемой клеточная линия продуцирует высоким титром лентивирусных векторов, которые специально направлены дендритных клеток

Резюме

Здесь мы используем ретровирусной трансдукции и concatemeric трансфекции создать клеточную линию, которая может выразить компоненты лентивирусов вектор (LV) в отсутствие тетрациклина. Этот LV кодирующий GFP и pseudotyped с гликопротеином, SVGmu, которая является специфической для рецептором на дендритных клеток.

Аннотация

Лентивирусов векторов (LV) являются мощным средством доставки генетического материала для многих типов клеток. В целях безопасности, связанные с этими ВИЧ-1, полученных векторов, производя большое количество ракет-носителей является сложной задачей. В данной работе мы сообщаем о первом способе получения высоких титров самостоятельно инактивирующий ЛВС. Мы трансдукции ретровирусом тет-офф стабильной клеточной линии производитель GPR для получения линии клеток, GPRS, который может экспрессировать все вирусные компоненты, в том числе дендритных клеток специфический гликопротеин, SVGmu. Затем мы используем concatemeric трансфекции ДНК для трансфекции передачи LV плазмиды, кодирующей репортерный ген GFP в комбинации с селективным маркером. Некоторые из полученных клонов может производить LV с титром 10 раз больше, чем то, что мы достигаем с временной трансфекции. Кроме того, эти вирусы эффективно трансдукции дендритных клеток в пробирке и генерировать сильный Т-клеточный иммунный ответ на наш репортер антигена. Этот метод может быть хорошим недопустимая кодировкат производстве сильный LV вакцины на основе клинических исследований рака или инфекционных заболеваний.

Введение

Многие системы вектор были разработаны для доставки генов. Векторов на основе лентивирусы были одними из наиболее часто изучаются вирусная системы. Эти векторы выгодно, потому что они могут эффективно преобразовывать как деления и не делящиеся клетки ^1, достижения долгосрочного выражение благодаря интеграции в геном хозяина, проявляют низкую природные анти-вектора иммунитета в большинстве человеческих популяций ^2, и имеют низкий потенциал генотоксичностью от ^3,4 инсерционного мутагенеза.

Производство лентивирусы всегда было окрашено безопасности. Лентивирусов векторов обычно получают из ВИЧ-1, этиологический агент СПИДа. Переходные трансфекции отдельных компонентов lentivector (передача, конверт и упаковку плазмид) является общим и гибким средством доставки генетического материала в лабораторных условиях. Тем не менее, расширение деятельности временных трансфекций для клинического применения является громоздкой и мау приводить к развитию к репликации лентивирусов ^5,6. Чтобы преодолеть эти препятствия, несколько устойчивых линий упаковки и производителя клетки были разработаны ^6-11. Одна из этих линий, линия упаковки GPR ^11, имеет привлекательное преимущество, что они регулируются тетрациклина. В этой работе показано, как приспособить эту систему для получения самостоятельного инактивации лентивирусных векторов, которые специально ориентирована на дендритные клетки (DC-ПЗ) ^12.

Дендритные клетки (ДК) являются наиболее надежными антигенпрезентирующих клетках иммунной системы. Они были предметом большой интерес в развитии рака вакцины, поскольку они непосредственно инициировать, программа, и регулируют опухоль-специфического иммунного ответа ^13. Включение вакцинации протокола включить ДК имеет потенциал, чтобы вызвать более сильный противоопухолевый иммунный ответ, чем пептид или ДНК-вакцин. Недавно мы разработали лентивирусный вектор, который specificallу цели дендритные клетки через изменение гликопротеина вируса Синдбис, SVGmu ^14. Эти векторы уникальны тем, что они показывают высокую специфичность в дендритные клетки и генерировать сильный иммунный ответ, чем неспецифические, VSVG-pseudotyped векторов.

Мы сообщаем способ получения больших количеств этих DC-целевых лентивирусов векторов. Мы показываем, что эти DC-Lys может заразить ДК и генерируют сильные CD8 ⁺ Т-клеточный иммунный ответ. Все процедуры, связанные с животных были проведены гуманно, с одобрения USC Intitutional уходу и использованию животных комитета. Для того, чтобы выполнить в естественных условиях и клинические эксперименты, очень важно, чтобы создать линию клеток, которая может производить вирус на высоком титре. Выполнение трансдукции и трансфекции шаги в точности так, как описано максимизирует вероятность получения такого клона.

протокол

DC-LV стабильные клетки производителей построены на основе ячейки GPR упаковочной линии ^11, которая содержит необходимые компоненты лентивирусный gagpol, оборот и Тет-офф системы. Во-первых, ретровирусной трансдукции используется для генерации клетки GPRS упаковочной линии, которая кодирует тет-зависимой SVGmu гликопротеина. Затем конкатемера массива трансфекции используется для трансфекции линии GPRS клетка с лентивирусный трансгенов вектор, такой как GFP. Это стабильной клеточной линии производитель, обозначенный как LV-MGFP, могут быть проверены в пробирке и в естественных для его способность производить DC-LV вакцины против GFP.

1. Создание Тет-зависимой клеточной линии SVGmu

Плазмиду PRX-SVGmu представляет собой конструкцию, в которой DC-специфический гликопротеин SVGmu клонировали ниже по потоку от TTA-расширенным промотор ретровирусной плазмиды pRetroX-Tet-офф ¹ (фиг. 1С). Культуры клеток 293Т в D10 (среде Игла, модифицированной Дульбекко с10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамин). Культуры GPR упаковочных клеток линии D10 доксициклином (1 нг / мл) и пуромицина (2 мкг / мл). Все клетки культивируют в увлажненной 37 ° C инкубаторе с 5% CO _2.

1. 16-18 ч перед временной трансфекции, пластина 2 × 10 ⁶ клеток 293Т в 4 мл D10 в 6-см чашки для культивирования тканей таким образом, что клетки приблизится к 90% слияния во время трансфекции.
2. Трансфекцию ретровирусную плазмид: смешать 100 мкл 1,25 М _{раствор} CaCl2, стерильные Milli-Q воды и следующие плазмиды: 5 мкг PRX-SVGmu, 2,5 мкг pGag-Pol, 2,5 мкг pVSV-G. Конечный объем составляет 500 мкл. К 5 мл полистирола с круглым дном трубки, добавить 500 мкл 2X HBS (50 мМ HEPES, 10 мМ KCl, 12 мМ декстроза, 280 мм NaCl, 1,5 мМ Na ₂ НРО ₄ * 7H ₂ O, рН 7,05). Добавить плазмиды смеси по каплям в буфере HBS 2X, барботируя буфера энергично стеклянной пипетки Пастера. После добавления мильxture, продолжает пузыриться еще в течение 30 сек. Затем добавляют всю смесь на клетках 293Т в 6-см чашки для культивирования, и инкубируют при 37 ° С.
3. 4 ч после трансфекции тщательно замену среды в культуральной чашке с 4 мл предварительно нагретой D10.
4. Спин инфекции: 48 ч после трансфекции урожай SVGmu кодирования ретровирусных частиц в супернатанте пропусканием супернатанта через 0,45 мкм фильтр. Пластина упаковки GPR клеток в 24-луночный планшет при 2 × 10 ⁴ клеток / лунку. Добавить фильтруют супернатант в GPR упаковка клетки в тарелке (2 мл / лунку) и центрифуги клеток в течение 90 минут при 1050 х г до 25 ° C. Изменение среды в свежей D10 доксициклин (1 нг / мл) после спин-инфекции (2 мл / лунку).
5. 72 часа после трансфекции, расширение культуры трансдуцированных клеток в упаковке D10 доксициклином (1 нг / мл) и пуромицина (2 нг / мл).
6. Для подтверждения экспрессии SVGmu, культуры клеток без доксициклина в течение 48 часов. Поверхностная мера бывшихВыражение из SVGmu с проточной цитометрии с использованием анти-Синдбис сыворотки. Эти клетки обозначаются как GPRS клеточной линии упаковки.

2. Построить DC-LV Клетки Производитель путем трансфекции Массив конкатемера

Лентивирусов трансферной плазмиды TL20-GFP является самостоятельным инактивации лентивирусов вектор переноса плазмиды на основе pCL20c-MSCV-GFP с DOX-регулируемой вирусного генома РНК системы экспрессии и замена цитомегаловирус (ЦМВ) усилитель с 7-тет операторов (рис. 1в) ^{11 , 12,15.} Плазмиды ПГК-BLE является блеомицин устойчивостью (BLE) кассеты обусловлен слабый промотор PGK ^2.

1. Дайджест 20 мкг плазмиды TL20-GFP с помощью рестрикционного фермента SfiI при 50 ° С. Дайджест 20 мкг плазмиды ПГК-BLE PflMI с при 37 ° С.
2. Очищают фрагментов ДНК (ПГК-BLE кассета 1011 б.п., а вектор TL20-GFP является 6861 пар оснований) с помощью электрофореза в агарозном геле.
3. Лигировать TL20-GFP вектора и ПГК-BLE кассеты в молярном соотношении 25:1 (NEB Т4 ДНК-лигазы). Инкубируют в течение ночи при комнатной температуре.
4. После ночной перевязки, очищать ДНК из смеси для лигирования (Qiagen DNeasy крови и тканей Kit). Убедитесь, что количество ДНК, очищенная составляет около 5 мкг.
5. 16-18 часа до трансфекции, плиты GPRS упаковки клеток в 6-см чашки для культивирования тканей таким образом, что слияния составит около 90% во время трансфекции.
6. С помощью трансфекции с фосфатом кальция описано в пункте 1.2 для трансфекции 5 мкг очищенной ДНК concatemeric в упаковку GPRS клеток в 6-см чашку для культуры ткани. 4 ч после трансфекции, осторожно удалите среды и заменить 4 мл предварительно нагретой D10 доксициклин (1 нг / мл).
7. 48 ч после трансфекции изменить среду в D10 доксициклин (1 нг / мл) и пуромицин (2 мкг / мл). Выбрать для трансфицированных клонов путем добавления зеоцина (50 мкг / мл) в культуральной среде. Культуры клеток в течение 2 недель до ячейки колоныES можно увидеть в нижней части блюда.
8. Этикетка клеточных колоний в нижней части блюда. Возьмем 24-луночных планшетах для культуры ткани, число скважин и добавляют в каждую лунку по 2 мл D10 содержащий зеоцина (50 мкг / мл), доксициклин (1 нг / мл), и пуромицина (2 мкг / мл). Аспирируйте среде приемными клетками, затем добавьте одну каплю трипсина на каждую из колоний менее чем за одну минуту. Затем добавить один или несколько капель D10 на той же колоний. Возьмите колоний один за другим с помощью пипетки и передавать их в отдельные лунки 24-луночного планшета для культуры ткани.
9. Культура и расширение всех клеточных клонов D10 содержащий зеоцина (50 мкг / мл), доксициклин (1 нг / мл) и пуромицина (2 мкг / мл) для оценки способности продуцировать вирусные.

3. Оцените Вирусные производство каждого клона клеток

1. Trypsinize клеток-продуцентов и пластины вокруг 4x10 ⁶ клеток в 6 см культуре ткани блюдо в D10 без доксициклин, что слиянияпревышает 90%. Замените среды свежей предварительно нагретой D10 ежедневно и собирать средства для анализа титра 72 ч после удаления DOX.
2. Урожай вирусный супернатант путем фильтрации среды с размером пор 0,45 мкм.
3. Клетки плиты целевой выражающие DC-SIGN рецепторов (например, 293T.hDC-SIGN или костного мозга мыши дендритных клетках ¹⁶⁾ и 293Т в качестве отрицательного контроля в 96-луночные планшеты для культивирования, 1 × 10 ⁴ клеток / лунку. Добавляют 2-кратные серийные разведения вирусного супернатанта в лунки (100 мкл / лунку). Как правило, 6-8 разведений являются достаточными для достижения диапазона, в котором трансдуцированных GFP-положительных клеток в линейной зависимости от количества вируса добавлены.
4. Центрифуга клетки и заменить среде, как описано в пункте 1.4. BMDCs следует культивировали в среде RPMI с добавлением 10% FBS и GM-CSF (1:20 J558L кондиционированной среды).
5. Измерить GFP выражение в трансдуцированных клеток методом проточной цитометрии 4-6 дней после трансдукции. Лентивирусный Vectoт титр вычисляется в диапазоне разбавления вектор когда процент GFP-положительных клеток и вектор количества находятся в линейной зависимости. Выбор клеточный клон с высокой вирусной производство для последующей приложений.

4. Производим и сосредоточиться лентивирусных векторов

1. Культура линейный продюсер ячейки (LV-MGFP) в 15-см чашки для культуры ткани.
2. Trypsinize клеток-продуцентов и пластины клеток в 15-см чашки для культуры ткани на более чем 90% слияния в свежем D10 без доксициклин. Изменение среды свежей, предварительно нагретой D10 ежедневно.
3. Во время пика вирусной производства (как определено пользователем), урожай вирусный супернатант и фильтровать с использованием 0,45-мкм фильтр. Загрузка отфильтрованного супернатанта в толстые стены 32,5 мл пробирок ультрацентрифуге, печать парафином и центрифуге при 50 000 мкг, 4 ° С в течение 90 мин. Тщательно ресуспендируют осадок в 50 мкл или соответствующий объем PBS или HBSS, в зависимости от применения.

5. Иммунизации мышей в естественных условиях и анализа антиген-специфического иммунного ответа

1. Продукты с высоким титром вируса, как описано в разделе 4.
2. Введите BALB / с мышей (в возрасте 6-8 недель, самки) через подушечку маршрут с вектором подвески (25 мкл на подушечку) композиций.
3. 2 недели после иммунизации, изолировать селезенки и спленоцитам урожая. Культуры спленоцитов с GFP пептиды эпитопов и анализа присутствия GFP-специфических CD8 ⁺ Т-клеток с использованием внутриклеточного окрашивания цитокинов, как было описано ранее ¹⁷ (фиг. 3В).

Результаты

Стабильной клеточной линии описаны в этот метод может производить большое количество лентивирусных векторов, которые специально предназначены для дендритных клеток. Как показано на фиг.1В, выделение индивидуальных клонов дали стабильных клеточных линий различного качества...

Обсуждение

Здесь мы выделили способ получения больших количеств лентивирусных векторов использованием клеток 293Т стабильно трансдуцированных все лентивирусов компонентов в соответствии с тет от системы регулирования. На сегодняшний день большинство протоколов для производства лентивирусных...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Mediatech Inc.	10-013-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Mediatech Inc.	25-005-Cl
Doxycycline	Clontech Laboratories, Inc.	631311
Zeocin	Invitrogen	R250-01	Toxic
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506