Una línea celular regulada por tetraciclina Produce lentiviral vectores de alta titulación que se dirigen específicamente a las células dendríticas

Resumen

Aquí, nosotros usamos la transducción retroviral y transfección concatemeric para crear una línea de células que pueden expresar las componentes de un vector lentiviral (VI) en ausencia de tetraciclina. Esta LV codifica GFP y se pseudotyped con una glicoproteína, SVGmu, que es específico para un receptor en las células dendríticas.

Resumen

Los vectores lentivirales (LVs) son un poderoso medio de la entrega de material genético a muchos tipos de células. Debido a los problemas de seguridad asociados a estas VIH-1 vectores derivados, produciendo grandes cantidades de LV es un reto. En este trabajo se presenta un método para la producción de títulos elevados de LV libre inactivar. Nos retroviral transducir la Tet-Off productor estable la línea celular GPR para generar una línea celular, GPRS, que pueden expresar todos los componentes virales, incluyendo una glicoproteína específica de célula dendrítica, SVGmu. A continuación, utilizamos la transfección de ADN concatemeric para transfectar el plásmido que codifica la transferencia de LV un gen reportero GFP en combinación con un marcador seleccionable. Varios de los clones resultantes pueden producir LV a un título 10 veces mayor que lo que logramos con transfección transitoria. Además, estos virus transducen eficazmente células dendríticas in vitro y generan una fuerte respuesta inmune de células T a nuestra antígeno reportero. Este método puede ser una buena opción FOr produciendo fuertes LV vacunas basadas en los estudios clínicos de cáncer o enfermedades infecciosas.

Introducción

Muchos sistemas de vectores se han desarrollado para la entrega de genes. Los vectores basados ​​en lentivirus han estado entre el sistema viral más comúnmente estudiada. Estos vectores son ventajosas, ya que pueden transducir eficientemente tanto que se dividen y no se dividen las células ^1, conseguir la expresión a largo plazo debido a la integración en el genoma huésped, exhibir una baja inmunidad anti-vector natural en la mayoría de las poblaciones humanas ^2, y tienen un bajo potencial de genotoxicidad de mutagénesis de inserción ^3,4.

Producción de lentivirus siempre ha sido coloreado por las preocupaciones de seguridad. Los vectores lentivirales se derivan generalmente de VIH-1, el agente etiológico del SIDA. La transfección transitoria de los componentes individuales de la lentivirus (transferencia, sobre, y los plásmidos de embalaje) es un medio común y flexible de la entrega de material genético en el laboratorio. Sin embargo, la ampliación de las transfecciones transitorias para la aplicación clínica es engorroso y may conducir al desarrollo de lentivirus con capacidad de replicación ^5,6. Para superar estos obstáculos, varios envases estable y líneas celulares productoras se han desarrollado ^6-11. Una de estas líneas, la línea de envasado GPR ^11, tiene la ventaja de ser atractivo regulado por tetraciclina. En este trabajo se demuestra cómo adaptar este sistema para producir auto-inactivación de vectores lentiviral que se dirigen específicamente a las células dendríticas (DC-LV) ^12.

Las células dendríticas (DC) son las más robustas células presentadoras de antígenos del sistema inmune. Han sido objeto de gran interés en el desarrollo de vacuna contra el cáncer, ya que inician directamente, programa, y regulan las respuestas inmunes específicas de tumor ^13. La incorporación de un protocolo de vacunación para incluir a los DC tiene el potencial de provocar una respuesta inmune antitumoral más fuerte que las vacunas de péptidos o ADN. Recientemente, se ha desarrollado un vector lentiviral que specifically dirige a las células dendríticas a través de una glicoproteína del virus de Sindbis modificado, SVGmu ^14. Estos vectores son únicos en cuanto a que muestran una alta especificidad para células dendríticas y generan respuestas inmunes más fuertes que los vectores no específicos, VSVG-pseudotyped.

Aquí, se presenta un método para la producción de grandes cantidades de estos vectores lentiviral DC-dirigidos. Se demuestra que estos DC-LV puede infectar a los DC y generar fuertes T CD8 ⁺ respuestas inmunes celulares. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo con humanidad, en virtud de la aprobación de la USC Intitutional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Para llevar a cabo experimentos in vivo y clínica, es fundamental para crear una línea de células que pueden producir virus en una alta concentración. Realización de las etapas de transducción y transfección exactamente como se describe será maximizar las posibilidades de la generación de dicho clon.

Protocolo

DC-LV células productoras estables se construyen sobre la base de la línea de envasado ¹¹ células GPR que contiene los componentes necesarios lentiviral gagpol, rev y el sistema tet-off. En primer lugar, la transducción retroviral se utiliza para generar una línea celular de empaquetamiento GPRS que codifica una glicoproteína SVGmu tet-dependiente. Entonces, concatemer array transfección se utilizó para transfectar la línea celular GPRS con un vector lentiviral transgén como GFP. Esta línea celular productora estable, designado como LV-MGFP, se puede probar in vitro e in vivo por su capacidad para producir una vacuna CC-LV frente a GFP.

1. Generación de una línea celular SVGmu Tet-dependiente

El plásmido PRX-SVGmu es un constructo en el que SVGmu glicoproteína DC-específica es clonado corriente abajo del promotor TTA-avanzada de plásmido retroviral pRetroX-Tet-Off ¹ (Figura 1C). Cultura células 293T en D10 (medio de Eagle modificado de Dulbecco con10% de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina). Cultura GPR línea celular de empaquetamiento en D10 con doxiciclina (1 ng / ml) y puromicina (2 g / ml). Todas las células se cultivan en un humidificado 37 ° C incubadora con 5% de CO _2.

1. 16-18 h antes de la transfección transitoria, placa de 2 x 10 ⁶ células 293T en 4 ml de D10 en una placa de cultivo tisular de 6 cm de tal manera que las células se acercan a 90% de confluencia en el momento de la transfección.
2. La transfección de plásmidos retrovirales: mezcla 100 l 1,25 M _CaCl2 solución, agua Milli-Q estéril y los siguientes plásmidos: 5 mg PRX-SVGmu, 2,5 g PGAG-Pol, 2,5 g pVSV-G. El volumen final es de 500 l. Para un tubo de poliestireno ml de fondo redondo de 5, añadir 500 l de 2X HBS (50 mM HEPES, 10 mM de KCl, 12 mM de Dextrosa, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, pH 7,05). Añadir gota a gota la mezcla de plásmido en el tampón HBS 2X mientras se burbujeaba el tampón vigorosamente con una pipeta Pasteur de vidrio. Después de añadir el mixture, continúe burbujeando durante otros 30 segundos. A continuación, añadir toda la mezcla sobre las células 293T en la placa de cultivo de 6 cm, y se incuba a 37 ° C.
3. 4 horas después de la transfección, vuelva a colocar cuidadosamente el medio en la placa de cultivo con 4 ml de D10 precalentado.
4. Girar la infección: 48 h después de la transfección, la cosecha SVGmu-que codifica partículas retrovirales en el sobrenadante por el que pasa el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micras-. Placa de las células empaquetadoras GPR en una placa de 24 pocillos a 2 x 10 ⁴ células / pocillo. Añadir filtró el sobrenadante a células de empaquetamiento GPR en el plato (2 ml / pocillo) y las células de centrifugación durante 90 min a 1050 x g y 25 º C. Cambio de medio en D10 fresco con doxiciclina (1 ng / ml) después de spin-infección (2 ml / pocillo).
5. 72 horas después de la transfección, expandir el cultivo de las células transducidas de embalaje en D10 con doxiciclina (1 ng / ml) y puromicina (2 ng / ml).
6. Para confirmar la expresión de SVGmu, cultivar las células sin doxiciclina durante 48 horas. Mida ex superficiesión de SVGmu con citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-Sindbis suero. Estas células son designadas como línea celular de empaquetamiento GPRS.

2. Construir DC-LV células productoras de matriz concatemer Transfección

Lentiviral transferencia de plásmido TL20-GFP es un auto-inactivación lentiviral vector de transferencia de plásmido basado en pCL20c-MSCV-GFP con un sistema de Dox-regulable genoma viral ARN expresión y la sustitución del citomegalovirus (CMV), potenciador con 7 operadores tet (Figura 1C) ^{11 , 12,15.} Plásmido PGK-ble es un resistente casete bleomicina (BLE), impulsados ​​por la debilidad del promotor PGK ^2.

1. Resumen 20 g TL20-GFP plásmido con la enzima de restricción SfiI en 50 ° C. Resumen 20 g plásmido PGK-ble con PflMI a 37 ° C.
2. Purificar los fragmentos de ADN (el casete PGK-ble de 1011 pb y el vector TL20-GFP es 6861 pb) mediante electroforesis en gel de agarosa.
3. Ligar el vector TL20-GFP y PGK-casete ble en una relación molar de 25:1 (NEB ADN ligasa de T4). Incubar toda la noche a temperatura ambiente.
4. Después de la ligación durante la noche, purificar ADN a partir de la mezcla de ligación (Qiagen DNeasy Tissue Kit y sangre). Asegúrese de que la cantidad de ADN purificado es de alrededor de 5 g.
5. 16-18 h antes de la transfección, las células de la placa de embalaje GPRS en una placa de cultivo tisular de 6 cm de tal manera que la confluencia será de aproximadamente 90% en el momento de la transfección.
6. Usar el método de transfección con fosfato de calcio descrito en el paso 1.2 para transfectar 5 ug del ADN concatemeric purificada en las células de empaquetamiento GPRS en la 6 cm de placa de cultivo tisular. 4 horas después de la transfección, quitar cuidadosamente el medio y reemplazar con 4 ml de D10 precalentado con doxiciclina (1 ng / ml).
7. 48 h después de la transfección, cambiar el medio en D10 con doxiciclina (1 ng / ml) y puromicina (2 g / ml). Seleccionar para clones transfectados mediante la adición de zeocina (50 g / ml) en el medio de cultivo. Cultivar las células durante aproximadamente 2 semanas hasta celular colonizaciónES se puede ver en la parte inferior de los platos.
8. Etiquetar las colonias de células en la parte inferior de los platos. Tome placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, el número de los pocillos y añadir a cada pocillo 2 ml de D10 que contiene zeocina (50 g / ml), doxiciclina (1 ng / ml), y puromicina (2 g / ml). Aspirar el medio de las células transducidas, a continuación, añadir una gota de tripsina en cada una de las colonias por menos de un minuto. A continuación, añadir una o más gotas de D10 en las mismas colonias. Recoger las colonias una a una con una pipeta y transferirlos en pocillos separados de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
9. Cultura y expandir todos los clones de células en D10 que contiene zeocina (50 g / ml), doxiciclina (1 ng / ml) y puromicina (2 g / ml) para la evaluación de la capacidad productora de viral.

3. Evaluar Viral producción de cada clon celular

1. Tripsinizar las células productoras y la placa de alrededor de 4x10 ⁶ células en 6 cm de placa de cultivo tisular de D10 sin doxiciclina tal que la confluenciaexcede 90%. Reemplazar el medio con D10 precalentado fresco todos los días y se recoge el medio para el ensayo de título de 72 horas después de la eliminación de DOX.
2. Se recoge el sobrenadante viral por filtración el medio con un filtro de 0,45 micras-.
3. Las células diana que expresan el receptor de placas DC-SIGN (por ejemplo, 293T.hDC-SIGN o de médula ósea de ratón derivados de células dendríticas ¹⁶⁾ y 293T como control negativo en placas de cultivo de 96 pocillos, 1 x 10 ⁴ células / pocillo. Añadir diluciones seriadas de 2 veces del sobrenadante viral a los pocillos (100 l / pocillo). Por lo general, 6-8 diluciones son suficientes para alcanzar el rango en el que las células transducidas GFP-positivas están en una relación lineal con la cantidad de virus añadido.
4. Centrifugar las células y reemplazar el medio como se ha descrito en el paso 1.4. BMDCs deben ser cultivadas en medio RPMI con 10% de FBS y GM-CSF (01:20 J558L medio acondicionado).
5. Medir la expresión de GFP en células transducidas por citometría de flujo de 4-6 días después de la transducción. El vecto lentiviralr título se calcula en el intervalo de dilución del vector cuando el porcentaje de células positivas para GFP y la cantidad de vectores están en una relación lineal. Elige el clon celular con la producción viral más alta para aplicaciones posteriores.

4. Producir y Concentrado vectores lentiviral

1. Cultura de la línea celular productora (LV-MGFP) en 15 cm de placas de cultivo de tejidos.
2. Tripsinizar las células productoras y las células de la placa en placas de cultivo tisular de 15 cm a más de 90% de confluencia en D10 fresco sin doxiciclina. Cambio medio con frescos D10, precalentado a diario.
3. En el momento de la producción viral pico (según lo determinado por el usuario), cosechar el sobrenadante viral y filtrarla utilizando un filtro de 0,45 micras-. Cargar el sobrenadante filtrado de pared en tubos de ultracentrífuga 32,5 ml gruesas, sellar con parafilm y se centrifuga a 50.000 xg, 4 º C durante 90 min. A fondo resuspender el precipitado en 50 l o un volumen apropiado de PBS o HBSS dependiendo de la aplicación.

5. Inmunizar ratones in vivo y analizar la respuesta inmune específica de antígeno

1. Producir virus de alto título como se describe en la sección 4.
2. Inyectar ratones BALB / c (6-8 semanas de edad, hembra) a través de una ruta almohadilla de la pata con la suspensión de vector (25 l por almohadilla de la pata).
3. 2 semanas después de la inmunización, aislar esplenocitos del bazo y la cosecha. Esplenocitos de cultivo con GFP epítopo péptidos y analizar la presencia de GFP-específica linfocitos T CD8 utilizando tinción intracelular de citoquinas ^+, como se ha descrito anteriormente ¹⁷ (Figura 3B).

Resultados

La línea celular estable descrito en este método puede producir grandes cantidades de vectores lentivirales que están dirigidos específicamente a las células dendríticas. Como se muestra en la Figura 1B, el aislamiento de clones individuales produjo líneas celulares estables de calidad variable ^12. Entre 26 clones ensayados, 8 produce partículas lentivirales a un título mayor de 10 ⁶ unidades de transducción por ml (UT / ml), que es un punto de referencia típica para los...

Discusión

Aquí, hemos esbozado un método para producir grandes cantidades de vectores lentiviral utilizando células 293T transducidas establemente con todos los componentes de lentivirus bajo el tet fuera del sistema regulatorio. Hasta la fecha, la mayoría de los protocolos para producir vectores lentivirales se basan en fosfato de calcio transfección transitoria estándar (ver ^18, por ejemplo). Este enfoque ha tenido éxito a nivel clínico, pero puede sufrir de algunas limitaciones que no puedan estar presentes ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Mediatech Inc.	10-013-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Mediatech Inc.	25-005-Cl
Doxycycline	Clontech Laboratories, Inc.	631311
Zeocin	Invitrogen	R250-01	Toxic
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506