שורת תאי טטרציקלין מוסדר מייצרת וקטורי lentiviral גבוה כייל שמתמקדים תאי דנדריטים

Summary

כאן, אנו משתמשים התמרה retroviral וtransfection concatemeric כדי ליצור שורת תאים שיכולים לבטא את הרכיבים של וקטור lentiviral (LV) בהיעדר טטרציקלין. זה LV מקודד GFP וPseudotyped עם גליקופרוטאין, SVGmu, שהוא ספציפי לקולטן על תאים דנדריטים.

Abstract

וקטורי lentiviral (LVS) הם אמצעי רב עוצמה להעברת חומר גנטי לסוגים רבים של תאים. בגלל חששות בטיחות הקשורות לוקטורי HIV-1 הנגזרים אלה, מפרישים כמויות גדולות של LVS הוא מאתגר. במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה לייצור titers גבוהה של LVS עצמי inactivating. אנו retrovirally transduce ט פעמי היציב מפיק תא הקו GPR כדי ליצור שורת תאים, GPRS, שיכול לבטא את כל המרכיבים הנגיפיים, כולל גליקופרוטאין תא ספציפי הדנדריטים, SVGmu. לאחר מכן, אנו משתמשים transfection DNA concatemeric לtransfect קידוד פלסמיד העברת LV GFP גן כתב בשילוב עם סמן לבחירה. כמה משיבוטי כתוצאה מכך יכול לייצר LV בכייל פי 10 יותר ממה שנשיג עם transfection חולף. בנוסף, וירוסים אלה ביעילות transduce תאים דנדריטים במבחנה וליצור תגובה חיסונית חזקה תא T לאנטיגן הכתב שלנו. שיטה זו עשויה להיות אפשרות טובה עבורr ייצור חיסונים מבוססי LV חזקים למחקרים קליניים של סרטן או מחלות זיהומיות.

Introduction

מערכות וקטור רבות פותחו למסירת גן. וקטורים המבוססים על lentiviruses היו בין המערכת נגיפית למדה הנפוץ ביותר. וקטורים אלה הם יתרון משום שהם יכולים ביעילות transduce גם החלוקה ולא חלוקת תאי ^1, להשיג ביטוי לטווח ארוך בשל אינטגרציה לתוך הגנום המארח, מפגין חסינות נגד וקטור טבעי נמוכה ברוב האוכלוסיות אנושיות ^2, ויש להם פוטנציאל נמוך ל genotoxicity מmutagenesis insertional ^3,4.

ייצור של lentiviruses מאז ומתמיד שנצבעה על ידי חששות בטיחות. וקטורי lentiviral בדרך כלל נגזרים מHIV-1, הסוכן האטיולוגי של איידס. transfection חולף של רכיבים בודדים של Lentivector (העברה, מעטפה, ופלסמידים אריזה) הוא אמצעי נפוץ וגמיש להעברת חומר גנטי בהגדרות מעבדה. עם זאת, דרוג-up transfections חולף ליישומים קליניים הוא מסורבל ואמאy להוביל להתפתחות של lentivirus שכפול מוסמך ^5,6. כדי להתגבר על המכשולים הללו, שורות תאים המפיקים כמה אריזות ויציבים פותחו ^6-11. יש לאחד את השורות האלה, קו אריזת GPR ^11, היתרון האטרקטיבי של להיות מוסדר על ידי טטרציקלין. במאמר זה, אנו מדגימים כיצד להתאים את המערכת הזו כדי לייצר וקטורי inactivating עצמי lentiviral המיועדים באופן ספציפי לתאים דנדריטים (DC-LVS) ^12.

תאים דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן החזקים ביותר של המערכת החיסונית. הם היו הנושא של עניין רב בפיתוח חיסון לסרטן משום שהם מפעילים ישירות, תכנית, ולווסת תגובות חיסוניות ספציפיות לגידול ^13. שילוב פרוטוקול חיסון לכלול DCs יש פוטנציאל לעורר תגובה חיסונית חזקה יותר מאשר חיסוני antitumor פפטיד או ה-DNA. לאחרונה, פיתחנו וקטור lentiviral שspecifically מטרות תאים דנדריטיים באמצעות שינוי גליקופרוטאין וירוס sindbis, SVGmu ^14. וקטורים אלה הם ייחודיים בכך שהם מראים סגוליות גבוהים לתאים דנדריטים ולייצר תגובה חיסונית חזקה יותר מאשר וקטורים ספציפיים, VSVg-Pseudotyped.

כאן, אנו מדווחים על שיטה להפקת כמויות גדולות של וקטורי lentiviral DC במיקוד אלה. אנו מראים כי אלה DC-LVS יכול להדביק DCs וליצור CD8 ⁺ T תגובות תא חיסוניים חזקות. כל ההליכים כרוכים בבעלי חיים בוצעו אנושי, תחת האישור של הטיפול בבעלי חי Intitutional USC ועדת שימוש. על מנת לבצע בניסויי vivo וקליניים, זה קריטי כדי ליצור שורת תאים שיכולים לייצר נגיף בכייל גבוה. ביצוע ההתמרה וtransfection הצעדים בדיוק כפי שתוארו יהיה למקסם את הסיכויים ליצירת שיבוט כזה.

Protocol

תאי מפיק יציבים DC-LV בנויים על בסיס ¹¹ שורת תאי אריזת GPR המכיל את הרכיבים הדרושים lentiviral מערכת ט את gagpol, מתניע ו. ראשית, הוא משמש התמרה retroviral כדי ליצור שורת תאי אריזת GPRS המקודדת גליקופרוטאין SVGmu ט תלוי. לאחר מכן, משמשת transfection מערך concatemer לtransfect קו הסלולרי GPRS עם transgene וקטור lentiviral כגון ה-GFP. הקו הזה יציב מפיק התא, המיועד כLV-MGFP, ניתן לבדוק במבחנה in vivo ליכולת שלה לייצר חיסון DC-LV כנגד ה-GFP.

1. יצירת שורת תאי SVGmu ט תלויה

פלסמיד PRX-SVGmu הוא מבנה שבו SVGmu גליקופרוטאין DC הספציפי הוא משובט מורד הזרם של אמרגן TTA-המתקדם של retroviral פלסמיד pRetroX-ט-off ¹ (איור 1 ג). 293T תרבות תאי D10 (המדיום השונה Dulbecco של הנשר עם10% בסרום שור עוברי, 2 מ"מ L-גלוטמין). קו תרבות GPR אריזה בתא D10 עם דוקסיציקלין (1 ng / ml) וpuromycin (2 מיקרוגרם / מ"ל). כל התאים בתרבית humidified 37 ° C חממה עם 5% CO _2.

1. 16-18 שעות לפני transfection החולף, צלחת 2 x 10 ⁶ תאים ב293T 4 מ"ל של D10 בצלחת תרבית רקמה של 6 ס"מ כך שהתאים מתקרבים 90% confluency בזמן של transfection.
2. Transfection של פלסמידים retroviral: לערבב 100 μl CaCl פתרון, מים 1.25 מ _'2 סטרילי מילי-Q ואת פלסמידים הבאים: 5 מיקרוגרם PRX-SVGmu, 2.5 מיקרוגרם pGag-Pol, 2.5 מיקרוגרם pVSV-G. הנפח הסופי הוא 500 μl. לצינור קלקר מסביב לתחתית 5 מ"ל, להוסיף 500 2X בהרוורד μl (50 HEPES מ"מ, 10 מ"מ KCl, 12 מ"מ, 280 מ"מ דקסטרוז NaCl, 1.5 מ"מ Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, pH 7.05). הוסף dropwise תערובת פלסמיד לתוך מאגר HBS 2X תוך מבעבע החיץ נמרצות עם זכוכית פיפטה פסטר. לאחר הוספת מיילxture, ימשיך מבעבע לשנייה עוד 30. לאחר מכן, מוסיף את כל התערובת על גבי תאי 293T במנת התרבות של 6 ס"מ, ולדגור על 37 ° C.
3. 4 שעות לאחר transfection, להחליף בזהירות בינונית בצלחת התרבות עם 4 D10 מחומם מראש מ"ל.
4. ספין זיהום: 48 שעות לאחר transfection, קציר SVGmu-קידוד חלקיקי retroviral בsupernatant על ​​ידי העברת supernatant דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. צלחת תאי אריזת GPR בצלחת 24 גם ב2 x 10 ⁴ תאים / היטב. הוסף מסונן supernatant לתאי GPR אריזה בצלחת (2 מ"ל גם /) ותאי צנטריפוגות במשך 90 דקות ב 1050 XG ו25 ° C. שנה בינונית לD10 הטרי עם דוקסיציקלין (1 ננוגרם / מ"ל) אחרי ספין זיהום (2 מ"ל גם /).
5. 72 שעות לאחר transfection, להרחיב את התרבות של תאי transduced אריזה בD10 עם דוקסיציקלין (1 ng / ml) וpuromycin (2 ng / ml).
6. כדי לאשר את הביטוי של SVGmu, תרבות התאים ללא דוקסיציקלין עבור 48 שעות. מדוד משטח לשעברpression של SVGmu עם cytometry הזרימה באמצעות סרום אנטי Sindbis. תאים אלה מיועדים כקו סלולרי GPRS אריזה.

2. לבנות תאי יצרן DC-LV על ידי Transfection מערך Concatemer

Lentiviral ההעברה פלסמיד TL20-GFP הוא inactivating עצמי lentiviral העברת וקטור פלסמיד המבוסס על pCL20c-MSCV-GFP עם מערכת ויסות Dox-RNA נגיפי הגנום ביטוי והחלפה של ציטומגלווירוס (CMV) משפר עם 7 ט מפעילים (איור 1 ג) ^{11 , 12,15.} פלסמיד PGK-ble הוא קלטת (ble) עמידה bleomycin מונעת על ידי אמרגן PGK חלש ^2.

1. מיקרוגרם TL20-GFP דייג'סט 20 פלסמיד עם הגבלת האנזים SfiI ב 50 ° C. מיקרוגרם PGK-ble דייג'סט 20 פלסמיד עם PflMI על 37 ° C.
2. לטהר את שברי ה-DNA (קלטת PGK-ble היא 1011 נ"ב וקטורית TL20-GFP הוא 6861 נ"ב) על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose.
3. לקשור את וקטור TL20-GFP וPGK-קלטת ble ביחס טוחנת של 25:1 (אנזים T4 DNA חוד). דגירה הלילה בטמפרטורת חדר.
4. לאחר קשירת הלילה, לטהר את ה-DNA מתערובת קשירה (דם Qiagen DNeasy וערכת רקמה). להבטיח את כמות ה-DNA המטוהר הוא בסביבות 5 מיקרוגרם.
5. 16-18 שעות לפני transfection, תאי אריזת GPRS צלחת בצלחת תרבית רקמה של 6 ס"מ כך שconfluency יהיה כ -90% בזמן של transfection.
6. השתמש בשיטת transfection סידן פוספט המתוארת בשלב 1.2 לtransfect 5 מיקרוגרם של ה-DNA concatemeric מטוהר לתוך תאי אריזת GPRS בצלחת תרבית הרקמה של 6 ס"מ. 4 שעות לאחר transfection, להסיר בזהירות את המדיום ולהחליף עם D10 4 מ"ל מחומם מראש עם דוקסיציקלין (1 ng / ml).
7. 48 שעות לאחר transfection, לשנות את המדיום לD10 עם דוקסיציקלין (1 ng / ml) וpuromycin (2 מיקרוגרם / מ"ל). בחר לשיבוטי transfected ידי הוספת Zeocin (50 מיקרוגרם / מ"ל) במדיום לתרבות. תרבות התאים לכ -2 שבועות עד התא coloniניתן לראות es בתחתית את הכלים.
8. תווית מושבות התאים בחלק התחתון של הכלים. קח את המנות בתרבית רקמת 24 גם, מספר הבארות ולהוסיף לכל אחד גם 2 מ"ל D10 המכיל Zeocin (50 מיקרוגרם / מ"ל), דוקסיציקלין (1 ננוגרם / מ"ל), וpuromycin (2 מיקרוגרם / מ"ל). לשאוב את המדיום של תאי transduced, ואז להוסיף טיפה אחת של טריפסין על כל אחת מהמושבות לפחות מדקה אחת. לאחר מכן, להוסיף אחד או יותר טיפות של D10 באותן מושבות. תרים מושבות בזה אחר זה עם טפטפת ולהעביר אותם לתוך בארות נפרדות של צלחת תרבית רקמת 24 גם.
9. תרבות ולהרחיב את כל השיבוטים תא D10 המכיל בZeocin (50 מיקרוגרם / מ"ל), דוקסיציקלין (1 ng / ml) וpuromycin (2 מיקרוגרם / מ"ל) לצורך ההערכה של יכולת ייצור נגיפית.

3. להעריך הפקת ויראלי של שיבוט כל סלולרי

1. Trypsinize תאי המפיק והצלחת סביב 4x10 ⁶ תאים בתרבית רקמת מנה של 6 ס"מ בD10 בלי דוקסיציקלין כזה שconfluencyעולה על 90%. החלף את המדיום עם D10 מחומם מראש טרי מדי יום ולאסוף את המדיום לשעת כייל assay 72 לאחר הסרת DOX.
2. לקצור את supernatant הנגיפי על ידי סינון הבינוני עם מסנן 0.45 מיקרומטר.
3. תאי יעד פלייט מבטאים את הקולטן DC-Sign (293T.hDC-סימן או מח עצם עכבר נגזר תאים דנדריטים ¹⁶ למשל) ו293T כביקורת שלילית בתרבות מנות 96, גם, 1 x 10 ⁴ תאים / היטב. הוסף דילולים סדרתי פי 2 supernatant ויראלי לבארות (100 μl / טוב). בדרך כלל, 6-8 דילולים מספיקים כדי להגיע לטווח שבו transduced GFP חיובי תאים נמצאים במערכת יחסים ליניארי לכמות הנגיף הוסיפה.
4. צנטריפוגה תאים ולהחליף את המדיום כמתואר בשלב 1.4. BMDCs צריך להיות תרבותי במדיום RPMI עם FBS 10% ו-GM-CSF (01:20 בינונית מותנה J558L).
5. מדוד את הביטוי של GFP בtransduced תאים על ידי זרימת cytometry 4-6 ימים לאחר תמרה. Vecto lentiviralr כייל מחושב בטווח דילול הווקטור כאשר אחוז תאי GFP החיוביים ואת סכום וקטור נמצא במערכת יחסים ליניארי. בחר את התא עם שיבוט הייצור הנגיפי הגבוה ביותר עבור יישומים שלאחר מכן.

4. לייצר ותתרכז וקטורי lentiviral

1. תרבות שורת תאי המפיק (LV-MGFP) במנות בתרבית רקמת 15 ס"מ.
2. Trypsinize תאי המפיק ופלייט התאים בצלחות תרבית רקמת 15 סנטימטר בגדול יותר מ -90% בconfluency D10 הטרי ללא דוקסיציקלין. שנה בינונית עם D10 טרי, מחומם מראש יומית.
3. בזמן ייצור נגיפי שיא (כפי שנקבע על ידי המשתמש), למסוק את supernatant ויראלי ולסנן אותו באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. טען את supernatant המסונן לתוך צינורות ultracentrifuge 32.5 מ"ל קיר עבה, לאטום עם parafilm צנטריפוגות ב 50,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. יסודיות resuspend גלולה ב50 μl או נפח מתאים של PBS או HBSS בהתאם ליישום.

5. לחסן עכברים in vivo וניתוח תגובה חיסונית אנטיגן ספציפית

1. לייצר וירוס כייל גבוה כאמור בסעיף 4.
2. הזרק BALB / C (6-8 בשבוע ישן, נקבה) דרך מסלול שודד עם ההשעיה הווקטור (25 μl לשודד דרכים).
3. 2 שבועות לאחר חיסון, לבודד טחול וsplenocytes קציר. splenocytes תרבות עם פפטידים epitope GFP ולנתח את נוכחותו של ה-GFP-CD8 ⁺ T התאים ספציפי באמצעות מכתים ציטוקינים תאי, כפי שתואר ¹⁷ (איור 3) בעבר.

תוצאות

שורת התאים היציבה שתוארה בשיטה זו ניתן לייצר כמויות גדולות של וקטורי lentiviral המיועדים באופן ספציפי לתאים דנדריטים. כפי שניתן לראות באיור 1, בידוד של שיבוטים בודדים הניב שורות תאי יציבות באיכות משתנה ^12. בין 26 שיבוטים שנבדקו, 8 מיוצרים חלקיקי lentiviral בכייל של...

Discussion

הנה, יש לנו התווינו שיטה להפקת כמויות גדולות של וקטורי lentiviral באמצעות 293T תאים ביציבות transduced עם כל רכיבי lentiviral תחת ט 'את המערכת הרגולטורית. נכון להיום, רוב הפרוטוקולים לייצר וקטורי lentiviral להסתמך על transfection פוספט סידן חולפת הסטנדרטית (ראה ^18, לדוגמה). גישה זו הייתה מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Mediatech Inc.	10-013-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Mediatech Inc.	25-005-Cl
Doxycycline	Clontech Laboratories, Inc.	631311
Zeocin	Invitrogen	R250-01	Toxic
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506